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문제 정의
- 본 연구는 생산지별 원두커피내 카페인과 클로로겐산의 함유량을 모니터링하기 위해 수행되었다. 시료의 특별한 전처리 없이 추출 후 두 물질을 동시에 분석할 수 있는 LC-MS/MS 방법을 적용하였다.
- 카페인 및 클로로겐산은 커피에서 가장 관심의 대상이 되고 있는 물질로써 일반적으로 가장 많이 사용되는 역상크로마토그래피 C18 컬럼을 이용하여 빠른 동시분석을 목적으로 하였다. Fig.
제안 방법
- UV에서 사용한 파장은 275 nm이었다. ESI 이온화 방식에서는 각 성분별로 positive 이온모드에서 [M+H]+ 이온세기와 negative 이온 모드에서[M-H]- 이온세기를 비교하여 이온모드를 결정하였다. 이와 더불어 특별한 전처리 없이도 시료중 존재하는 다른 물질의 간섭을 피하고 선택성과 검출감도를 높이기 위해 MS/MS 분석을 위한 SRM(Selected Reaction Monitoring)모드를 사용하였다.
- 분리 및 검출방법으로 액체크로마토그래피/질량분석기(Liquid Chromatography/Mass Spectrometer, LC-MS)를 사용할 경우 시료 중 존재하는 다른 물질의 간섭을 받지 않고 선택적으로 원하는 물질을 정성확인하고 정량할 수 있어서 최근에는 LC-MS 방법의 활용이 많아지고 있다. 따라서 항암효과가 있는 것으로 알려지면서 관심이 커지고 있는 클로로겐산과 적정 섭취 함량으로 주목되고 있는 커피내 카페인 성분의 동시 분석법을 개발하고 커피 생산지별 클로로겐산과 카페인 함량을 조사하였다. 국가적으로도 식품 중 성분함량에 관심이 증대되고 있는만큼 이들 성분에 대한 지속적인 모니터링 관리에 기여할 수 있을 것이다.
- 시료의 주입은 2 μL였으며, 질량분석기는 이온포집 (Ion trap) 형태의 분석관이 사용되었으며, 전자 분무 이온화 (electrospray ionization, ESI)방식에 의한 양이온, 음이온 모드에서 두 화합물이 측정되었다.
- 액체크로마토그래프상에서 카페인과 클로로겐산의 완전한 분리가 어렵기 때문에 분자이온 확인에 의한 정성확인 및 정량조건을 제시하였다. UV에서 사용한 파장은 275 nm이었다.
- 이러한 클로로겐산의 경우 고온으로 로스팅(볶는 과정)하는 중 분해되어 감소하는데, 따라서 로스팅 과정을 거치는 원두 커피에서 보다는 그린 커피빈(green coffee bean)의 효능에 착안한 식품들이 출시되고 있다. 일일권장량 설정에 관한 필요성이 제기되는 카페인과 항암물질로 섭취양에 대한 관심이 집중되고 있는 클로로겐산의 동시분석 방법을 통하여 생산지별 원두커피내 두 성분을 정량하였다.
- 정량을 위한 표준물질의 조제는 클로로겐산과 카페인 10 mg을 Milli-Q purification 시스템(Millipore, Eschborn, Germany)의 3차 증류수 10 mL에 녹이고 5 ~ 800 μg/mL 사이에서 5개 이상의 농도를 분석하여 직선성을 확인하였다.
- 카페인과 클로로겐산의 정량을 위하여 5점 이상의 표준물질을 제조하여 검량선을 작성하였다. 카페인의 경우는 5 ~ 800 μg/mL, 클로로겐산의 경우는 5 ~ 200 μg/mL 사이의 농도범위에서 얻어진 크로마토그램에서의 면적비를 농도별로 그래프화 하여 상관계수를 얻은 결과 두 성분 모두 R2값이 0.
- 클로로겐산과 카페인의 분리용 컬럼은 phenomex사의 Luna C18(150 x 2.1 mm, 내경 2.7 μm)컬럼이 사용되었으며 컬럼의 이동상은 85% 증류수/15% 아세토나이트릴 혼합액 (0.1% 포름산 포함)을 일정용매조성법(Isocratic method)으로 22분간 흘려주었다(Table 1).
대상 데이터
- 최근 이러한 LC-MS/MS 방법은 시료의 추출 후 특별한 정제과정없이도 원하는 물질을 분리, 분석할 수 있는 방법으로 많이 활용되고 있다. Fig. 2는 카페인(A)과 클로로겐산(B)을 MS/MS 분석으로 스캔하여 얻어진 질량 스펙트럼으로 카페인의 경우는 positive 모드에서 분자이온 m/z 195를 확인할 수 있었고 MS/MS에 의한 조각이온 m/z 138을 정량 이온으로 선정하였다. 클로로겐산의 경우는 negative 모드에서 Fig.
- 기기분석은 Shiseido사의 nanospace SI-2 액체크로마토그래프와 Thermo Finnigan사의 LCQ Deca XP 질량분석기를 이용하였다. 클로로겐산과 카페인의 분리용 컬럼은 phenomex사의 Luna C18(150 x 2.
- 실험에 사용된 시료는 가정에서 직접 추출해서 섭취할 수 있도록 판매되는 커피원두로 추출에 바로 사용될 수 있도록 분쇄된 것이었다. 시료내 정성확인 및 정량을 위한 클로로겐산과 카페인 표준물질은 Sigma-Aldrich사(Steinheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 커피시료의 추출은 분쇄시료 2 g을 취해 0.
- 커피시료는 생산지별로 인도네시아산 12종, 베트남산 4종, 코스타리카산 4종 총 20종의 시료를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 시료는 가정에서 직접 추출해서 섭취할 수 있도록 판매되는 커피원두로 추출에 바로 사용될 수 있도록 분쇄된 것이었다. 시료내 정성확인 및 정량을 위한 클로로겐산과 카페인 표준물질은 Sigma-Aldrich사(Steinheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
- 커피시료는 생산지별로 인도네시아산 12종, 베트남산 4종, 코스타리카산 4종 총 20종의 시료를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 시료는 가정에서 직접 추출해서 섭취할 수 있도록 판매되는 커피원두로 추출에 바로 사용될 수 있도록 분쇄된 것이었다.
이론/모형
- 본 연구는 생산지별 원두커피내 카페인과 클로로겐산의 함유량을 모니터링하기 위해 수행되었다. 시료의 특별한 전처리 없이 추출 후 두 물질을 동시에 분석할 수 있는 LC-MS/MS 방법을 적용하였다. LC 상에서는 카페인과 클로로겐산을 완전하게 분리할 수 없었지만 전자 분무 이온화-선택반응분석법(selected reaction monitoring, SRM)에 의해 두 성분의 바탕선 분리가 가능하였고 이러한 방법으로 커피 시료내에 두 성분을 정량하였다.
- ESI 이온화 방식에서는 각 성분별로 positive 이온모드에서 [M+H]+ 이온세기와 negative 이온 모드에서[M-H]- 이온세기를 비교하여 이온모드를 결정하였다. 이와 더불어 특별한 전처리 없이도 시료중 존재하는 다른 물질의 간섭을 피하고 선택성과 검출감도를 높이기 위해 MS/MS 분석을 위한 SRM(Selected Reaction Monitoring)모드를 사용하였다. 이때 각 성분별로 감응도가 큰 충돌에너지(collision energy)를 선정하여 사용하였다.
성능/효과
- 컬럼상에서 카페인과 클로로겐산이 완전하게 분리가 되지 못하고 이동상의 조건이나 흐름속도에 매우 민감하여 조작에 어려움이 있음을 알 수 있었다. 반면 질량분석기를 이용하는 경우 선택된 분자이온을 분리할 수 있으며 분리된 이온은 충돌가스에 의해 조각 이온화(fragment ion)하여 이들 이온을 동시에 스캔할 수 있기 때문에 컬럼에서 비슷한 머무름 시간을 가진 물질이라도 분리해 낼 수 있으며 분석의 선택성과 검출감도를 높일 수 있었다. 최근 이러한 LC-MS/MS 방법은 시료의 추출 후 특별한 정제과정없이도 원하는 물질을 분리, 분석할 수 있는 방법으로 많이 활용되고 있다.
- 카페인의 경우는 5 ~ 800 μg/mL, 클로로겐산의 경우는 5 ~ 200 μg/mL 사이의 농도범위에서 얻어진 크로마토그램에서의 면적비를 농도별로 그래프화 하여 상관계수를 얻은 결과 두 성분 모두 R2값이 0.99 이상의 직선성을 나타내는 것을 알 수 있었으며 시료 중 고농도의 경우 이 범위내에서 면적비를 가질 수 있도록 희석하여 사용하였다(Fig. 4).
- LC 상에서는 카페인과 클로로겐산을 완전하게 분리할 수 없었지만 전자 분무 이온화-선택반응분석법(selected reaction monitoring, SRM)에 의해 두 성분의 바탕선 분리가 가능하였고 이러한 방법으로 커피 시료내에 두 성분을 정량하였다. 커피 주요 생산지별 20개의 시료를 선정하여 분석한 결과 코스타리카산의 경우 카페인은 15.05 mg/g 평균값을 나타내었다. 클로로겐산의 경우는 5.
- 1% 포름산을 포함한 85% 증류수와 15% 아세토나이트릴 혼합액(v,v)을 이동 상으로 C18 컬럼에 흘려 주었을 때 UV 검출기 275 nm 파장에서 측정된 두가지 물질의 크로마토그램을 나타내고 있었다. 컬럼상에서 카페인과 클로로겐산이 완전하게 분리가 되지 못하고 이동상의 조건이나 흐름속도에 매우 민감하여 조작에 어려움이 있음을 알 수 있었다. 반면 질량분석기를 이용하는 경우 선택된 분자이온을 분리할 수 있으며 분리된 이온은 충돌가스에 의해 조각 이온화(fragment ion)하여 이들 이온을 동시에 스캔할 수 있기 때문에 컬럼에서 비슷한 머무름 시간을 가진 물질이라도 분리해 낼 수 있으며 분석의 선택성과 검출감도를 높일 수 있었다.
후속연구
- 따라서 항암효과가 있는 것으로 알려지면서 관심이 커지고 있는 클로로겐산과 적정 섭취 함량으로 주목되고 있는 커피내 카페인 성분의 동시 분석법을 개발하고 커피 생산지별 클로로겐산과 카페인 함량을 조사하였다. 국가적으로도 식품 중 성분함량에 관심이 증대되고 있는만큼 이들 성분에 대한 지속적인 모니터링 관리에 기여할 수 있을 것이다.
- 12 mg/g의 평균값을 나타내는 것으로 조사되었다. 식품 중 두 성분의 관심이 높아지고 있는 만큼 향후 관련 연구 및 관리를 위하여 보다 많은 시료수의 분석을 통한 통계적인 접근이 필요하다고 사료된다.
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