돌돔, Oplegnathus fasciatus의 Cyclooxygenase-2 유전자의 cloning 및 발현분석 Cloning and Expression of the Cyclooxygenase-2 gene in the Rock bream, Oplegnathusfasciatus원문보기
Megalocytivirus는 우리나라를 포함한 아시아 각국의 양식현장에서 고위험성 병원체이다. 그럼에도 불구하고 어류의 면역체계와 megalocytivirus의 상호관계에 관한 연구는 아직 부족한 실정이다. 다양한 연구에서 cyclooxygenase isoform중 COX-1 유전자는 constitutive 하게 발현되며, COX-2 enzyme은 면역반응에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 COX-2 유전자는 LPS (lipopolysaccharide) 또는 병원체의 감염과 같은 염증반응 시 그 발현이 증가한다고 알려져있다. 본 연구는 다른 어종의 COX-2 유전자를 바탕으로 제작된 degenerated primer와 5'- 그리고 3'-end RACE-PCR을 이용하여 돌돔에서 COX-2 유전자의 전체 염기서열을 밝혔으며, 그 결과 rbCOX-2 (rock bream COX-2)유전자 cDNA의 전체 길이는 2655 bp 였으며, 609개의 아미노산으로 구성되어있었다. rbCOX-2 유전자의 genomic organization은 9개의 intron과 10개의 exon으로 구성되어 있었다. 또한 본 연구에서는 돌돔에 megalocytivirus의 인위감염 시 COX-2 유전자의 발현을 조사하였다. LPS 접종 시 rbCOX-2 유전자는 접종 1일 후 대조구와 비교하여 13.10배 증가하여 최고 발현을 보였으나, megalocytivirus 접종 시 대조구와의 비교에서 유의적인 발현을 확인할 수 없었다. 돌돔에서 COX-2 유전자의 염기서열의 분석과 발현 분석은 바이러스 감염 시 어류의 방어기작을 이해하는데 도움이 될 것이며, 바이러스 백신개발 및 치료제 개발의 기초자료로 활용될 것이다.
Megalocytivirus는 우리나라를 포함한 아시아 각국의 양식현장에서 고위험성 병원체이다. 그럼에도 불구하고 어류의 면역체계와 megalocytivirus의 상호관계에 관한 연구는 아직 부족한 실정이다. 다양한 연구에서 cyclooxygenase isoform중 COX-1 유전자는 constitutive 하게 발현되며, COX-2 enzyme은 면역반응에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 COX-2 유전자는 LPS (lipopolysaccharide) 또는 병원체의 감염과 같은 염증반응 시 그 발현이 증가한다고 알려져있다. 본 연구는 다른 어종의 COX-2 유전자를 바탕으로 제작된 degenerated primer와 5'- 그리고 3'-end RACE-PCR을 이용하여 돌돔에서 COX-2 유전자의 전체 염기서열을 밝혔으며, 그 결과 rbCOX-2 (rock bream COX-2)유전자 cDNA의 전체 길이는 2655 bp 였으며, 609개의 아미노산으로 구성되어있었다. rbCOX-2 유전자의 genomic organization은 9개의 intron과 10개의 exon으로 구성되어 있었다. 또한 본 연구에서는 돌돔에 megalocytivirus의 인위감염 시 COX-2 유전자의 발현을 조사하였다. LPS 접종 시 rbCOX-2 유전자는 접종 1일 후 대조구와 비교하여 13.10배 증가하여 최고 발현을 보였으나, megalocytivirus 접종 시 대조구와의 비교에서 유의적인 발현을 확인할 수 없었다. 돌돔에서 COX-2 유전자의 염기서열의 분석과 발현 분석은 바이러스 감염 시 어류의 방어기작을 이해하는데 도움이 될 것이며, 바이러스 백신개발 및 치료제 개발의 기초자료로 활용될 것이다.
Megalocytivirus is a major fish pathogen in marine aquaculture of Asian countries including Korea. Despite of many species affected by this pathogen, little is known interaction between megalocytivirus and the fish immune system. One of the cyclooxygenase isoforms, named COX-2, is playing an importa...
Megalocytivirus is a major fish pathogen in marine aquaculture of Asian countries including Korea. Despite of many species affected by this pathogen, little is known interaction between megalocytivirus and the fish immune system. One of the cyclooxygenase isoforms, named COX-2, is playing an important role in immune regulation, and distinct from COX-1 isoform of constitutive activity. COX-2 enzyme is induced by various inflammatory signals, including injection of lipopolysaccharide or infection by pathogenic agents. We cloned COX-2 gene in rock bream using degenerated primers designed from reported sequences of other fish species in PCR followed with 5'- and 3'-end RACE-PCR. The full length of cDNA of rbCOX2 (rock bream COX-2) gene are 2655 bp and that translates into 609 amino acids. The rbCOX-2 genomic organization are found to span 10 exons separated by 9 introns. We also studied if the experimental infection of rock bream with megalocytivirus could affect the expression of COX-2 gene. When injected with LPS, expression of the COX-2 gene was reached peak level at 1 day post injection and showed 13.10 fold increased level compared with that of control. While, when injected with megalocytivirus, we were not able to find significantly increased COX-2 gene expression different from that of control. Cloned and analyzed COX-2 gene in rock bream will help to understand defence mechanisms in fish after viral infection and will also support the development of the measures for treatment and prevention of viral infection.
Megalocytivirus is a major fish pathogen in marine aquaculture of Asian countries including Korea. Despite of many species affected by this pathogen, little is known interaction between megalocytivirus and the fish immune system. One of the cyclooxygenase isoforms, named COX-2, is playing an important role in immune regulation, and distinct from COX-1 isoform of constitutive activity. COX-2 enzyme is induced by various inflammatory signals, including injection of lipopolysaccharide or infection by pathogenic agents. We cloned COX-2 gene in rock bream using degenerated primers designed from reported sequences of other fish species in PCR followed with 5'- and 3'-end RACE-PCR. The full length of cDNA of rbCOX2 (rock bream COX-2) gene are 2655 bp and that translates into 609 amino acids. The rbCOX-2 genomic organization are found to span 10 exons separated by 9 introns. We also studied if the experimental infection of rock bream with megalocytivirus could affect the expression of COX-2 gene. When injected with LPS, expression of the COX-2 gene was reached peak level at 1 day post injection and showed 13.10 fold increased level compared with that of control. While, when injected with megalocytivirus, we were not able to find significantly increased COX-2 gene expression different from that of control. Cloned and analyzed COX-2 gene in rock bream will help to understand defence mechanisms in fish after viral infection and will also support the development of the measures for treatment and prevention of viral infection.
본 연구는 돌돔 COX-2 유전자의 cDNA와 genomic DNA의 전체 염기서열을 밝히고 다른 어종과 비교 및 분자적 특징에 대해 분석하였으며, LPS 또는 megalocytivurus 감염 시 COX-2 유전자의 발현을 분석함으로써 돌돔의 초기 면역반응을 이해하고자 하였다.
제안 방법
RACE PCR을 통해 밝힌 돌돔 COX-2 cDNA의 5`와 3`-ends untranslated region (UTR)에 각각 specific primer (rbCOX2 UTR F, rbCOX2 UTR R)를 제작하였다 [Table 1]. 분리한 돌돔의 genomic total DNA를 template로 하여 PCR을 수행한 뒤 그 생성물을 cloning하고 염기서열을 분석하여, 돌돔 COX-2 유전자의 genomic DNA 염기서열을 결정하였다.
돌돔 COX-2 cDNA의 cloning과 유전적 특성 분석 LPS로 자극시킨 돌돔의 간 조직에서 분리한 RNA와 이전에 보고된 COX-2 유전자에 conserved 하게 제작한 primer (dgpCOX-2 F, dgpCOX-2 R)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 785 bp의 product를 얻을 수 있었으며, 염기서열 분석을 통하여 다른 어종의 COX-2 유전자와 높은 유사도를 보임을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
외관상 질병의 증세가 나타나지 않는 건강한 5-6 g 되는 양식산 돌돔, Oplegnathus fasciatus을 거제의 한 양식장에서 구입하여 250 L 수조에서 1일 2회 사료 투여 및 사육수 환수를 하며 25±0.5℃에서 2주 간 순치시킨 뒤 실험에 사용하였다.
데이터처리
Clustal W program (European Molecular Biology Laboratory)을 이용하여 정리한 염기서열은 MEGA4 program (Ver. 4.1, USA)을 이용하여 Phylogenetic tree 를 만들어 비교하였다.
결과의 통계처리는 Statistical Package for the Social Science (SPSS, Ver. 12.0)을 사용하여 정상어와 감염어 간의 유의차를 One-way ANOVA test를 실시하여 유의성을 검정하였고 P-value가 0.05 이하의 경우 유의한 값으로 나타내었다.
이론/모형
돌돔 두신에서의 leukocyte분리는 Graham et al. (1988)의 방법에 따라 percoll을 이용하여 분리하였다. 분리한 leukocyte는 24 well plate에 106 cells/mL 농도로 분주한 뒤 25℃에서 3시간 배양하였다.
마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지의 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 분석방법은 상대정량으로 하여 β-actin과 돌돔COX-2 유전자의 비교에 따른 상대정량으로 비교한 후 정상어와 감염어에 대한 상대적 발현량을 계산하는 -ΔΔCt methods로 분석하였다 (Livak and Schmittgen, 2001). 발현분석의 계산은 다음과 같다.
성능/효과
LPS 접종 시 COX-2 유전자는 in vivo와 in vitro실험에서 각각 대조구에 비해 최고 13.1배와 7.4배의 발현 을 보여 통계적으로 유의적으로 높은 발현을 보였다 (Fig. 4, 5). 변화를 살펴보면 in vivo의 경우 LPS 접종 1일째 가장 높은 발현을 보이며, 이후 급격히 감소하여 7일째에는 PBS를 주사한 대조구 수준의 발현을 나타내었다 (Fig.
그 결과 785 bp의 product를 얻을 수 있었으며, 염기서열 분석을 통하여 다른 어종의 COX-2 유전자와 높은 유사도를 보임을 확인할 수 있었다. 따라서 785 bp의 fragment 를 COX-2 유전자의 부분 염기배열로 하여, 전체 염기서열을 결정하기 위해 5` 및 3`RACE- PCR을 수행한 결과 총 2655 bp의 COX-2 유전자 전체 염기서열을 결정할 수 있었다.
본 연구에서 qPCR을 이용한 in vivo 및 in vitro에서의 발현분석에서는 LPS를 주사 시 rbCOX-2 발현량은 대조구와의 비교에서 통계적으로 유의적인 차이를 보이며 증가하였으나, megalocytivirus의 감염 시에는 대조구와 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 megalocytivirus 감염이 어류에 있어 염증반응을 유도하지 않거나 매우 낮은 정도의 염증반응을 유도를 하고 있음을 추정케 하였는데, 실제로 megalocytivirus 감염어의 경우 체색흑화 및 이상유영을 제외한 외부 증상이 뚜렷하지 않으며, 다만 조혈기관에 비대세포만 관찰되어 해부학적 및 외관상 염증증상이 관찰되지 않아 본 연구결과와 외부증상 간의 연관관계에 대한 새로운 접근이 필요하다고 할 수 있다.
후속연구
HCV의 경우 같은 바이러스 임에도 불구하고 저자에 따라 바이러스 감염에 따라 COX-2 유전자 발현에 대해 이견을 보이고 있다. 본 연구에서 사용한 megalocytivirus 역시 감염에 대한 면역억제 및 유도에 관한 더 명백한 증거 및 확인이 필요할 것이다.
본 연구에서 qPCR을 이용한 in vivo 및 in vitro에서의 발현분석에서는 LPS를 주사 시 rbCOX-2 발현량은 대조구와의 비교에서 통계적으로 유의적인 차이를 보이며 증가하였으나, megalocytivirus의 감염 시에는 대조구와 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 megalocytivirus 감염이 어류에 있어 염증반응을 유도하지 않거나 매우 낮은 정도의 염증반응을 유도를 하고 있음을 추정케 하였는데, 실제로 megalocytivirus 감염어의 경우 체색흑화 및 이상유영을 제외한 외부 증상이 뚜렷하지 않으며, 다만 조혈기관에 비대세포만 관찰되어 해부학적 및 외관상 염증증상이 관찰되지 않아 본 연구결과와 외부증상 간의 연관관계에 대한 새로운 접근이 필요하다고 할 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Prostanoid의 역할은?
Prostanoid는 다양한 생리적 과정에 작용하는 지방산으로, 포유류에서는 온도조절, 수분조절, 배란과 출산에 중요한 역할을 하며, 통증, 열, 염증, 신경괴사성 질병과 암의 발병 시 높은 발현을 한다. 이러한 prostanoid는 arachidonic acid을 prostaglandin H2로 변환시키는 촉매작용을 하는 cyclooxygenases (COX)에 의해 형성된다.
Prostanoid가 높은 발현을 하는 조건은?
Prostanoid는 다양한 생리적 과정에 작용하는 지방산으로, 포유류에서는 온도조절, 수분조절, 배란과 출산에 중요한 역할을 하며, 통증, 열, 염증, 신경괴사성 질병과 암의 발병 시 높은 발현을 한다. 이러한 prostanoid는 arachidonic acid을 prostaglandin H2로 변환시키는 촉매작용을 하는 cyclooxygenases (COX)에 의해 형성된다.
Prostanoid의 형성은 무엇에 의해 이루어지는가?
Prostanoid는 다양한 생리적 과정에 작용하는 지방산으로, 포유류에서는 온도조절, 수분조절, 배란과 출산에 중요한 역할을 하며, 통증, 열, 염증, 신경괴사성 질병과 암의 발병 시 높은 발현을 한다. 이러한 prostanoid는 arachidonic acid을 prostaglandin H2로 변환시키는 촉매작용을 하는 cyclooxygenases (COX)에 의해 형성된다.
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