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문제 정의
- 본 연구는 in vitro에서 아직 살충효과를 측정하는 방법이 알려지지 않은 멍게의 물렁증 원인충인 A. hoyamushi에 대해 간접적 측정방법인 alamar blue assay의 측정 가능성을 제시하고 20종의 화합물에 대해 현미경계수법과 alamr blue assay를 비교하여 A. hoyamushi에 유효한 화합물을 확인하고자 수행하였다.
제안 방법
- hoyamushi 배양액 200 ㎕에 alamar blue (Invitrogen, UK) 20㎕를 형광용 96 well-plate에 첨가한 후 15℃에서 배양하였다. 0, 1, 6, 12, 24시간 별로 fluorescence spectrophotometer (Spectra Max, GEMIN XS, Molecular Device)를 이용해 형광값을 측정하였다. Excitation wavelength는 540 ㎚이였고 emission wavelength는 580 ㎚이였다.
- Alamar blue assay로 A. hoyamushi의 생존이 측정가능한지 알아보기 위해 0.5×106 cells/㎖ 농도의 A. hoyamushi 배양액 200 ㎕에 alamar blue (Invitrogen, UK) 20㎕를 형광용 96 well-plate에 첨가한 후 15℃에서 배양하였다.
- Excitation wavelength는 540 ㎚이였고 emission wavelength는 580 ㎚이였다. 대조군의 형광값과 실험군의 형광값의 비로 A. hoyamushi의 생존율을 평가하였다. 시험은 3회 반복하였다.
- 시험 화합물은 임의적으로 5가지로 분류하여 A. hoyamushi에 대한 살충 효과를 평가하였다. 즉 항원충제, 항생제 및 항진균제, 산화제 및 환원제, 할로겐화물, 기타화합물이다 (Table 1).
- hoyamusi는 fast green에 염색이 된 개체(사망한 충)와 염색이 되지 않은 개체(생존한 충)가 모두 발견되었다. 이러한 형태적 차이를 바탕으로 구형모양의 충과 사망한 충의 합을 화합물에 영향을 받는 개체로 판단하고 20종의 화합물에 대해 살충효과를 평가하였다.
- 즉 10% Eagle's minimal essential medium (MEM, Gibco, USA)에 3.5% sea salt (Sigma, USA), 2.5% fetal bovine serum (FBS, Sigma, USA), 5 mM HEPES (Sigma, USA), 2 mM L-glutamine (Sigma, USA), penicillin-streptomycin mixture (Sigma, USA)를 penicillin 100 units/㎖, streptomycin 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가한 후 0.45 ㎛ filter paper를 이용해 여과한 배지에 A. hoyamusi를 배양하였다.
- 즉 A. hoyamushi (5×104 cells/㎖) 1 ㎖에 시험용액 1 ㎖을 12 well-plate에 넣은 후 24시간 동안 15℃에서 배양한 후 역상현미경을 이용하여 무작위로 200마리씩 측정하여 평가하였다.
- 평가기준은 생존, 형태 이상, 사망 이였다. 형태이상과 사망으로 측정된 기생충의 합을 화합물에 영향을 받은 것으로 계산하였다. 화합물의 평가농도는 MEM으로 2배씩 희석하여 Table 1의 농도범위에서 평가하였으며 3회 반복하여 살충효과를 평가하였다.
- 형태이상과 사망으로 측정된 기생충의 합을 화합물에 영향을 받은 것으로 계산하였다. 화합물의 평가농도는 MEM으로 2배씩 희석하여 Table 1의 농도범위에서 평가하였으며 3회 반복하여 살충효과를 평가하였다.
- hoyamushi (1×106 cells/㎖) 100 ㎕에 시험용액 100 ㎕를 형광용 96 well-plate에 넣은 후 alamar blue 20 ㎕를 첨가하여 24시간 동안 15℃에서 배양하였다. 화합물의 평가농도는 Table 1의 농도범위로 평가하였으며 MEM으로 2배씩 희석하여 fluorescence spectrophotometer로 형광값을 측정하였다. Excitation wavelength는 540 ㎚이였고 emission wavelength는 580 ㎚이였다.
대상 데이터
- Hydrogen peroxide, formaldehyde solution은 Junsei (Japan)에서 구입하였으며 chlorine dioxide은 캐모피아 (Korea)에서 구입하였다. Bithionol은 TCI (Japan)에서 구입하였다.
- Nalidixic acid와 bithionol은 증류수에 sodium hydroxide를 소량 첨가하여 녹인 후 사용하였고 ketoconazole은 증류수에 hydrogen chloride를 소량 첨가하여 녹여 제조하였다. Chlorine dioxide는 1000 ㎎/ℓ으로 제조된 수산용 소독제를 사용하였고 이외의 화합물은 증류수에 녹여 제조하였다. 희석시 MEM를 이용하였으며 시험에 사용한 농도에서 DMSO는 1%이하였고 pH는 6.
- 시약은 Sigma사에서 chloramine T hydrate, bronopol, potassium monosulfate salt, fumagillin (from Aspergillus fumigatus), albendazole, citric acid, quinine, potassium permanganate, metronidazole, nalidixic acid, amphotericin B, poly (vinylpyrrolidone)-iodine complex, paromomycin sulfate salt, benzalkonium chloride, sulfamonomethoxine, ketoconazole을 구입하였다. Hydrogen peroxide, formaldehyde solution은 Junsei (Japan)에서 구입하였으며 chlorine dioxide은 캐모피아 (Korea)에서 구입하였다. Bithionol은 TCI (Japan)에서 구입하였다.
- 물에 난용성화합물인 albendazole, quinine, fumagillin은 dimethyl sulfoxide에 녹인 후 증류수로 희석하여 사용하였다. Nalidixic acid와 bithionol은 증류수에 sodium hydroxide를 소량 첨가하여 녹인 후 사용하였고 ketoconazole은 증류수에 hydrogen chloride를 소량 첨가하여 녹여 제조하였다.
- 즉 항원충제, 항생제 및 항진균제, 산화제 및 환원제, 할로겐화물, 기타화합물이다 (Table 1). 시약은 Sigma사에서 chloramine T hydrate, bronopol, potassium monosulfate salt, fumagillin (from Aspergillus fumigatus), albendazole, citric acid, quinine, potassium permanganate, metronidazole, nalidixic acid, amphotericin B, poly (vinylpyrrolidone)-iodine complex, paromomycin sulfate salt, benzalkonium chloride, sulfamonomethoxine, ketoconazole을 구입하였다. Hydrogen peroxide, formaldehyde solution은 Junsei (Japan)에서 구입하였으며 chlorine dioxide은 캐모피아 (Korea)에서 구입하였다.
- Chlorine dioxide는 1000 ㎎/ℓ으로 제조된 수산용 소독제를 사용하였고 이외의 화합물은 증류수에 녹여 제조하였다. 희석시 MEM를 이용하였으며 시험에 사용한 농도에서 DMSO는 1%이하였고 pH는 6.8~8.2범위였다. 모든 화합물의 순도는 100%로 보정하여 사용하였다.
이론/모형
- 현미경계수법은 Park et al. (2013)의 방법으로 하였다. 즉 A.
- 화합물에 대한 반수영향농도 (median effective concentration, EC50)의 값은 Graphpad Prism (version 4, Prism, USA)을 이용하여 평가하였다.
성능/효과
- 2). A. hoyamushi에 강력한 살충효과를 보인 화합물은 hydrogen peroxide, formalin, bronopol, chlorine dioxide, bithionol이였으며 각각 0.32, 0.73, 1.24, 3.76, 7.37 ㎍/㎖의 24hr-EC50값을 얻었다. Benzalkonium chloride, chloramine T, ketoconazole, amphotericin B은 10≤24hr-EC50≤25 ㎍/㎖이었으며 quinine, povidone iodine은 25≤24hr-EC50≤100 ㎍/㎖이었다.
- Alamar blue assay를 이용한 A. hoyamushi의 살충효과는 총 20개의 시험 화합물 중 11종의 화합물에서 감수성을 보였다 (Fig. 2). A.
- Alamar blue assay와 현미경계수법은 시험농도범위에서 11종의 화합물에 대해 A. hoyamushi에 감수성을 보였으며 amphotericin B를 제외한 모든 유효화합물에서 현미경계수법이 alamar blue assay보다 더 낮은 24hr-EC50값을 얻었다. 두 측정법의 EC50값 비 (alamar blue assay/ microscopic counting)의 차이는 amphotericin B, hydrogen peroxide, povidone iodine, benzalkonium chloride는 ≤2였으며 quinine, ketoconazole, bithionol, chloramine T, chlorine dioxide, bronopol은 ≤5이였다.
- Alamar blue assay와 현미경계수법을 이용하여 A. hoyamushi에 대한 20종의 화합물에 대한 24시간 살충효과를 평가한 결과 11종의 화합물에 대해 효과를 보였으며, 두 측정법 모두에서 강한 살충효과를 보이는 화합물은 항진균제인 amphotericn B, 산화제 및 환원제인 formalin, hydrogen peroxide, bithionol, 기타 약물인 benzalkonium chloride, bronopol로 나타났다 (24hr-EC50≤20 ㎍/㎖).
- 이와 같은 결과는 alamar blue assay가 효소의 산화/환원 반응에 의해 형성되는 resorufin의 양에 의해 평가되는 간접법이기 때문이라 생각된다. Formalin에 대한 alamar blue assay와 현미경계수법의 24h-EC50값의 비는 26.3 : 1로 다른 시험화합물에 비해 큰 차이를 보였으며, 이는 강력한 환원제인 formalin이 alamar blue의 환원에 영향을 미쳐 둔감한 값이 측정됐을 것으로 생각되나 formalin에 alamar blue를 첨가했을 때 formalin이 직접 alamar blue를 환원시키는 현상은 관찰되지 않았다 (data not shown).
- Mansour and Bickle (2010)는 형태변화에 따른 현미경 측정법과 alamar blue assay 를 이용하여 Schistosoma mansoni의 7일간 살충효과를 비교 평가하였고 alamar blue assay가 현미경계수법에 비해 덜 민감한 값을 얻었다고 보고하였다. 본 연구 또한 amphotericin B를 제외한 모든 유효화합물에서 현미경계수법이 alamar blue assay 보다 더 낮은 24hr-EC50값을 얻었다. 이와 같은 결과는 alamar blue assay가 효소의 산화/환원 반응에 의해 형성되는 resorufin의 양에 의해 평가되는 간접법이기 때문이라 생각된다.
- 본 연구결과를 요약하면, 멍게 물렁증의 원인충인 A. hoyamushi는 배양시간에 따라 지속적으로 alamar blue를 환원시켰으며 in vitro에서 alamar blue assay와 현미경계수법을 비교하여 amphotericn B, formalin, hydrogen peroxide, bithionol, benzalkonium chloride, bronopol이 A. hoyamushi에 강한 살충효과가 있는 것으로 확인하였다. 두 측정법 모두 대부분의 화합물에서 비슷한 결과를 얻었다는 점에서 A.
- 그 중 alamar blue assay는 다른 측정법에 비해 시험법이 간단하며 세포에 독성을 미치지 않고 형광과 비색정량 모두에서 측정이 가능하다는 점에서 동물세포, 세균, 곰팡이, 기생충 등 다양한 생물체에서 독성을 평가하는데 이용되고 있다. 본 연구는 A. hoyamushi가 alamar blue를 환원시키는 지에 대해 알아보기 위해 시간별로 형광값의 변화량을 측정하였으며 시간별로 높은 상관관계를 가지는 형광값을 얻었으나 배양 24시간 후의 S/B비가 3.9 : 1로 나타났다. Hamid et al.
- , 2013). 현미경계수법은 방추형 모양의 A. hoyamushi가 유효 화합물에 노출되었을 때에는 구형의 모양으로 변하는 현상이 관찰되었으며 fast green exclusion test로 확인한 결과, 구형모양의 A. hoyamusi는 fast green에 염색이 된 개체(사망한 충)와 염색이 되지 않은 개체(생존한 충)가 모두 발견되었다. 이러한 형태적 차이를 바탕으로 구형모양의 충과 사망한 충의 합을 화합물에 영향을 받는 개체로 판단하고 20종의 화합물에 대해 살충효과를 평가하였다.
- 현미경계수법을 이용한 A. hoyamushi의 살충효과에서도 총 20개의 시험 화합물 중 11종의 화합물에서 감수성을 보였다 (Fig. 2). A.
후속연구
- (formalin, hydrogen peroxide, bithionol), Neoparamoeba spp. (bithionol), Cryptocaryon irritans (benzalkonium chloride), Ichthyophthirius multifilliis (bronopol) 등에 살충효과가 있다고 보고되었으며 (Saha et al., 1986; Ostland et al., 1995; Russo et al., 2007; Florent et al., 2007, 2010; Hirazawa et al., 2003; shinn et al., 2012), 일부는 국내에서 수산용의약품으로 판매되고 있다는 점에서 멍게의 물렁증 치료에 유용한 물질로 생각되지만 in vivo 조건에서의 효과가 확인되지 않았기 때문에 추가적인 연구가 필요할 것이다.
- hoyamushi에 강한 살충효과가 있는 것으로 확인하였다. 두 측정법 모두 대부분의 화합물에서 비슷한 결과를 얻었다는 점에서 A. hoyamushi의 살충효과를 측정하는데 좋은 방법으로 생각되지만, formalin처럼 두 측정법에서 큰 차이를 보이는 화합물도 존재하기 때문에 상호보완해서 사용해야 할 것이다. 이러한 연구결과를 바탕으로 향후 화합물의 병용투여 및 멍게에 대한 in vivo시험 등의 연구를 통해 멍게의 물렁증에 효과적인 치료법이 개발될 것으로 기대된다.
- hoyamushi의 살충효과를 측정하는데 좋은 방법으로 생각되지만, formalin처럼 두 측정법에서 큰 차이를 보이는 화합물도 존재하기 때문에 상호보완해서 사용해야 할 것이다. 이러한 연구결과를 바탕으로 향후 화합물의 병용투여 및 멍게에 대한 in vivo시험 등의 연구를 통해 멍게의 물렁증에 효과적인 치료법이 개발될 것으로 기대된다.
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