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문제 정의
- 본 연구에서는 다묵장어, Lethenterone reissneri에서 발생한 물곰팡이병의 원인체를 동정하기 위하여 ITS1 gene, 5.8S rDNA 및 ITS2 gene을 포함하고 있는 ITS sequences를 분석하고, Saprolegnia 속의 종들과 형태학적 특징을 비교하여 원인균을 분류하였다.
제안 방법
- (1990)의 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')를 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 pre-denaturation 시킨 후 94℃ denaturation 30초, 50℃ annealing 30초, 72℃ extension 1분 30초를 35cycles 반응시키고, 72℃에서 7분간 post-extension 반응을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.
- 배양된 균주는 평판배지를 1cm x 1cm의 크기의 block으로 잘라 penicillin과 streptomycin이 첨가된 멸균 증류수에 담가 20℃에서 배양하면서 균사체를 현미경 (Olympus)으로 관찰하였다.
- 분석된 ITS sequence는 GenBank에 등록된 Saprolegnia 분리주들 가운데 Diéguez-Uribeondo et al. (2007)가 보고한 14개의 분리주의 ITS sequence에 기초하여 phylogenetic tree를 작성하였다.
- 유전자 동정을 위해 순수 분리된 균주를 절취해서 DNA 분리 kit를 (Exgene™ Tissue SV; GeneALL) 사용하여 Genomic DNA를 추출하였다.
- 자연산 다묵장어, Lethenterone reissneri에서 발생한 물곰팡이병의 원인체를 형태학적 및 유전학적 연구를 통하여 동정하였다. 분리균주는 격벽이 없는 균사를 형성하였고, 가늘고 긴 모양의 유주자낭 내에 활발한 운동성을 보이는 유주자가 여러 줄로 배열되었다가 유주자낭의 선단에서 휴면하지 않고 한꺼번에 방출되는 특징을 보였다.
- PCR 반응은 94℃에서 3분간 pre-denaturation 시킨 후 94℃ denaturation 30초, 50℃ annealing 30초, 72℃ extension 1분 30초를 35cycles 반응시키고, 72℃에서 7분간 post-extension 반응을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에 전기영동하고, ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 특이 밴드를 확인하고 SV Gel and PCR Clean-up system (Promega)으로 정제한 후 Bioneer (Korea)에 의뢰하여 sequence 분석을 실시하였다. 분석된 ITS sequence는 GenBank에 등록된 Saprolegnia 분리주들 가운데 Diéguez-Uribeondo et al.
대상 데이터
- PCR 반응은 TaKaRa사의 Ex-Taq 사용하였으며, PCR에 사용된 primer로는 White et al. (1990)의 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')를 사용하였다.
- 경남 하동군 적량면 섬진강 지역에서 채집한 체장 14.8 cm, 체중 4.68 g의 자연산 다묵장어, Lampetra reissneri에서 체포로 인해 발생한 상처에 물곰팡이로 의심되는 균사를 발견되었다.
- 5% agar) 배지가 사용되었다. 다묵장어 미병부 표면에서 관찰되는 솜 모양의 물곰팡이 균사를 절취하여 GY agar에 접종한 뒤 20℃에서 배양하였다. 곰팡이가 성장한 GY agar를 1cm x 1cm의 크기로 잘라 새로운 배지에 옮겨심은 후 20℃에서 배양하였다.
성능/효과
- 본 연구에서 관찰된 물곰팡이의 균사는 지 등 (2007)이 무지개송어 수정란에서 분리한 물곰팡이의 균사와 같이 나선형으로 꼬여서 성장하는 모습은 관찰할 수 없었다. 균사가 자란 평판배지의 block을 멸균 증류수에 담가 현미경으로 관찰한 결과 가늘고 길며 격벽이 없는 균사체를 확인할 수 있었다.
- 다묵장어로부터 분리한 물곰팡이 균주는 GY agar에 접종하고 20℃에서 1주일이상 배양한 결과 목화솜과 같은 집락을 형성하였고 (Fig. 1A), 평판배지상에서 균사는 나뭇가지 모양과 같이 뻗어 나가는 것이 관찰되었다 (Fig. 1B). 본 연구에서 관찰된 물곰팡이의 균사는 지 등 (2007)이 무지개송어 수정란에서 분리한 물곰팡이의 균사와 같이 나선형으로 꼬여서 성장하는 모습은 관찰할 수 없었다.
- salmonis (AY647193)와 100% 일치하는 것을 확인하였다. 또한 Neighbor-Joining method (BioEdit Version 7.1.7)로 phylogenetic tree를 작성한 결과, S. parasitica, S. diclina Type 1, S. salmonis, S. hypogyna 및 Saprolegnia sp가 속하는 clade I에 분류되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). Diéguez-Uribeondo et al.
- 한편 유성생식기관인 조란기와 조정기는 관찰되지 않았다. 또한 분리균주의 ITS sequence를 분석하고 Saprolegnia 속의 다른 분리균주와 유전학적 상관관계를 조사한 결과, S. parasitica가 속해있는 clade I에 분류되는 것을 확인할 수 있었다. 무성생식기관의 형태, 유주자 방출방식 및 ITS sequence의 phylogenetic analysis에 근거하여 자연산 다묵장어에서 관찰된 물곰팡이병의 원인체는 S.
- parasitica가 속해있는 clade I에 분류되는 것을 확인할 수 있었다. 무성생식기관의 형태, 유주자 방출방식 및 ITS sequence의 phylogenetic analysis에 근거하여 자연산 다묵장어에서 관찰된 물곰팡이병의 원인체는 S. parasitica인 것으로 동정되었다.
- 물곰팡이 균사체에서 분리한 DNA를 ITS1, 5.8S rDNA 및 ITS2 유전자들을 증폭할 수 있는 primer를 사용하여 PCR한 결과 710 bp의 band을 얻을 수 있었다 (data not shown). 이 PCR 산물의 sequence 분석을 통하여 primer 부분을 제외한 분리주의 ITS sequence가 본 연구에서 비교한 14개의 균주 중에서 S.
- 물곰팡이 분리주의 무성생식 기관을 관찰한 결과, 가늘고 긴 모양의 유주자낭 내에 활발한 운동성을 보이는 유주자가 여러 줄로 배열되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2A). 유주자의 방출 방식은 유주자낭의 선단에서 휴면하지 않고 한꺼번에 방출되는 전형적인 Saprolegnia 속의 특징을 보여주었다 (Fig.
- 자연산 다묵장어, Lethenterone reissneri에서 발생한 물곰팡이병의 원인체를 형태학적 및 유전학적 연구를 통하여 동정하였다. 분리균주는 격벽이 없는 균사를 형성하였고, 가늘고 긴 모양의 유주자낭 내에 활발한 운동성을 보이는 유주자가 여러 줄로 배열되었다가 유주자낭의 선단에서 휴면하지 않고 한꺼번에 방출되는 특징을 보였다. 한편 유성생식기관인 조란기와 조정기는 관찰되지 않았다.
- 2A). 유주자의 방출 방식은 유주자낭의 선단에서 휴면하지 않고 한꺼번에 방출되는 전형적인 Saprolegnia 속의 특징을 보여주었다 (Fig. 2B). 지 등 (2007)의 연구에서도 연어과 어류에서 분리한 4종의 분리주 가운데 연어 수정란에서 분리한 한 균주에서만 GY agar에 접종하고 5℃에서 약 15일간 배양한 후에야 조란기가 관찰되었다고 보고하였다.
- 8S rDNA 및 ITS2 유전자들을 증폭할 수 있는 primer를 사용하여 PCR한 결과 710 bp의 band을 얻을 수 있었다 (data not shown). 이 PCR 산물의 sequence 분석을 통하여 primer 부분을 제외한 분리주의 ITS sequence가 본 연구에서 비교한 14개의 균주 중에서 S. parasitica (AY455771, AY455777) 및 S. salmonis (AY647193)와 100% 일치하는 것을 확인하였다. 또한 Neighbor-Joining method (BioEdit Version 7.
- , 2001). 이상의 결과로부터 무성생식기관의 형태 및 유주자 방출방식 및 ITS sequence의 phylogenetic analysis에 근거하여 자연산 다묵장어에서 관찰된 물곰팡이병의 원인체는 S. parasitica인 것으로 동정되었다.
- diclina 분리주가 포함되어 있다. 즉 영국에서 분리된 한 종과 스페인에서 분리된 6종의 S. diclina 균주, S. ferax, 일본에서 분리된 S. diclina, S. australis가 clade III에 분류되며, clade V에는 스페인의 브라운 송어의 난에서 분리된 6종의 S. diclina가 속해있다. Clade IV는 칠레와 프랑스에서 분리된 S.
- 형태학적인 각각의 차이에 대한 연구 결과를 바탕으로 분석한 결과, 본 연구에서 관찰한 균사체와 유주자낭의 형태는 길고 가늘었으며 유주자낭 속의 성숙한 유주자는 길게 늘어서서 생성되어 전형적인 S. parasitica의 특징과 일치하였다 (Shahbazian et al., 2010). 한편 ITS sequence 분석에서 동일한 clade I에 속해있는 S.
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