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문제 정의
- 이처럼 선행연구들에서 키토산 및 키토올리고당의 분자량이 항균활성과 지질 개선에 미치는 영향이 크다고 보고되고 있으나, 저분자량 키토올리고당의 생체 내에서의 항균활성과 지질 대사에 미치는 효과에 관한 연구는 상대적으로 부족하다. 이에 본 연구는 흰쥐에서 저분자량 키토올리고당의 항균성이 장의 미생물생태계에 미치는 효과와 키토올리고당의 지질개선능을 조사하기 위하여 1~3 kDa 키토올리고당을 식이의 0.5%, 2%, 5% 수준으로 용량을 달리하여 그 효과를 조사하였다.
제안 방법
- Bifidobacteria, lactobacilli, bacteroides를 각각 BS(Bifidobacterium-selective) agar, MRS(Man, Rogosa and Sharpe)(Merck & Co., Inc., Darmstadt, Germany), VA(vancomycin-added) medium에서 37℃, 72시간 동안 Anaerocult® A(Merck & Co., Inc.)를 사용하여 배양하였다(25).
- 5 g을 취하여 Folch 등 (28)의 방법을 이용하여 총 지질을 추출하였다. 간 조직과 분변으로부터 추출한 지질은 질소를 사용하여 유기용매를 제거한 후 triton X-100과 에탄올에 용해시켜(29) 혈장 지질 분석용 효소시약(Asan pharmaceutical)을 사용하여 총 콜레스테롤과 중성지방을 측정하였다. 분변의 총 담즙산은 건조 분쇄한 변을 사용하여 Crowell과 Macdonald법(30)에 의해 추출한 후 총 담즙산 분석용 효소시약(Bio-Quant Inc, San Diego, CA, USA)을 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
- 해부 전 실험동물을 12시간 절식시키고, CO2로 마취하여 개복 후 heparin 처리한 주사기로 복부 대정맥에서 채혈하였으며, 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈장을 분리하였다. 간을 분리하여 생리식염수로 혈액을 제거한 후 무게를 측정하고 -70℃에 보관하였으며, 소장의 무게와 길이를 측정하였다.
- , Jecheon, Korea)를 급여하여 사육 환경에 적응시켰다. 난괴법에 따라 군당 8마리씩 분배하고 대조 식이와 키토올리고당(chitooligosaccharide, COS) 0.5%, 2% 및 5% 식이를 자유롭게 5주 동안 급여하였다. 사육실 환경은 온도 20±2℃, 습도 55±5%, 12시간 주기 조명을 유지하였고, 실험동물의 체중과 식이섭취량은 2일에 한 번씩 측정하였으며 식이와 물은 자유롭게 섭취하게 하였다.
- 대조식이는 기본식이인 AIN 93G(24)에 쇠기름 15%를 더 첨가하여 총지방량을 식이의 20%(w/w)로 조절하였다. 실험식이는 대조식이를 기본으로 하고 키토올리고당을 0.
- 사육실 환경은 온도 20±2℃, 습도 55±5%, 12시간 주기 조명을 유지하였고, 실험동물의 체중과 식이섭취량은 2일에 한 번씩 측정하였으며 식이와 물은 자유롭게 섭취하게 하였다.
- 대조식이는 기본식이인 AIN 93G(24)에 쇠기름 15%를 더 첨가하여 총지방량을 식이의 20%(w/w)로 조절하였다. 실험식이는 대조식이를 기본으로 하고 키토올리고당을 0.5%, 2%, 5% 수준으로 조정하였다. 식이에 사용된 mineral mix, vitamin mix, L-cystine, choline bitartrate는 Harlan Laboratories(Madison, WI, USA)로부터 구입하였으며, 키토 올리고당(분자량 1～3 kDa)은 키토라이프(Pyeongtaek, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
- 키토산과 키토올리고당의 항균 활성에 관한 메커니즘은 확실하게 밝혀지지 않았지만, 제안된 메커니즘은 키토산과 키토올리고당이 미생물 세포막의 투과성을 변화시켜 영양소의 흡수를 저해하거나 세포성분의 누출을 야기해 세균을 죽게 한다는 것이다(35). 키토올리고당 분자의 양전하를 띠는 성질은 amine 잔기에 의한 것이며(36), 양전하의 크기는 탈아세틸화와 중합 정도에 비례하며, 85~95% 탈아세틸화가 최대의 항균력을 제공한다(37).
- 실험식이 급여 5주째에 4일 동안 분변을 수집하여 무게를 재고 -70℃에 보관하였다. 해부 전 실험동물을 12시간 절식시키고, CO2로 마취하여 개복 후 heparin 처리한 주사기로 복부 대정맥에서 채혈하였으며, 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈장을 분리하였다. 간을 분리하여 생리식염수로 혈액을 제거한 후 무게를 측정하고 -70℃에 보관하였으며, 소장의 무게와 길이를 측정하였다.
대상 데이터
- 4주령 된 Sprague-Dawley 수컷 32마리(DBL Co., Eumseong, Korea)를 구입하여 1주일간 일반고형사료(Samyangoil Co., Jecheon, Korea)를 급여하여 사육 환경에 적응시켰다. 난괴법에 따라 군당 8마리씩 분배하고 대조 식이와 키토올리고당(chitooligosaccharide, COS) 0.
- 5%, 2%, 5% 수준으로 조정하였다. 식이에 사용된 mineral mix, vitamin mix, L-cystine, choline bitartrate는 Harlan Laboratories(Madison, WI, USA)로부터 구입하였으며, 키토 올리고당(분자량 1～3 kDa)은 키토라이프(Pyeongtaek, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 실험식이의 조성은 Table 1과 같다.
이론/모형
- 간 조직 1 g에 생리식염수 2 mL를 넣어 homogenizer (Glas-Col, LCC, Terre Haute, IN, USA)로 얼음물에서 균질화한 다음, Folch 등(28)의 방법을 이용하여 총 지질을 추출하였다. 냉동 보관한 분변을 동결 건조기에서 항량이 될 때까지 건조시키고 곱게 분쇄한 후 0.
- 간 조직 1 g에 생리식염수 2 mL를 넣어 homogenizer (Glas-Col, LCC, Terre Haute, IN, USA)로 얼음물에서 균질화한 다음, Folch 등(28)의 방법을 이용하여 총 지질을 추출하였다. 냉동 보관한 분변을 동결 건조기에서 항량이 될 때까지 건조시키고 곱게 분쇄한 후 0.5 g을 취하여 Folch 등 (28)의 방법을 이용하여 총 지질을 추출하였다. 간 조직과 분변으로부터 추출한 지질은 질소를 사용하여 유기용매를 제거한 후 triton X-100과 에탄올에 용해시켜(29) 혈장 지질 분석용 효소시약(Asan pharmaceutical)을 사용하여 총 콜레스테롤과 중성지방을 측정하였다.
- 간 조직과 분변으로부터 추출한 지질은 질소를 사용하여 유기용매를 제거한 후 triton X-100과 에탄올에 용해시켜(29) 혈장 지질 분석용 효소시약(Asan pharmaceutical)을 사용하여 총 콜레스테롤과 중성지방을 측정하였다. 분변의 총 담즙산은 건조 분쇄한 변을 사용하여 Crowell과 Macdonald법(30)에 의해 추출한 후 총 담즙산 분석용 효소시약(Bio-Quant Inc, San Diego, CA, USA)을 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
- 혈장의 총 콜레스테롤과 중성지방, HDL-C(high density lipoprotein cholesterol) 농도는 측정용 효소시약(Asan pharmaceutical, Seoul, Korea)을 이용하여 효소비색법으로 각각 파장 500 nm, 550 nm, 500 nm에서 비색정량 하였으며, LDL-C(low density lipoprotein cholesterol) 농도는 지질 측정치를 이용한 Friedewald 식(27)에 따라 총콜레스테롤－(HDL-C＋중성지방/5)를 이용하여 계산하였다. 혈장의 glutamic pyruvic transaminase(GPT) 활성은 transaminase 측정용 시약(Asan pharmaceutical)을 이용하여 505 nm에서 분광광도계로 비색정량 하였다.
성능/효과
- 5주 동안 실험식이를 섭취시킨 흰쥐의 초기 체중, 최종 체중, 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 Table 2와 같다. COS 0.5% 첨가군과 COS 2% 첨가군은 대조군과 체중증가, 식이섭취량, 식이효율에 있어 차이가 없었지만, COS 5% 첨가군은 체중증가량, 식이 섭취량 및 식이효율이 대조군의 59.8%, 80.6%, 72.7% 수준으로 유의하게 낮았다. 체중 100 g당 간의 무게는 군간 유의한 차이가 없는 반면에 맹장의 무게, 소장의 무게와 길이는 COS 5% 첨가군이 다른 군에 비해 유의하게 높았다.
- 5% 첨가군에 비해 COS 5% 첨가군에서 유의하게 높았다. COS 5% 첨가군의 총 담즙산 농도는 대조군과는 차이가 없었으나, COS 0.5% 첨가군에 비해 유의하게 낮았다.
- 간 조직 g당 총콜레스테롤 함량은 군간 유의한 차이가 없으며, 중성지방 함량은 COS 5% 첨가군이 COS 0.5% 첨가군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다(Table 6). 분변의 총 콜레스테롤 농도는 COS 0.
- 5%) 첨가 식이를 돼지에게 먹인 결과 대장균 수는 감소하였지만, lactobacilli 수에는 영향을 미치지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서 1~3 kDa 키토올리고당은 식이의 2% 수준까지는 항균 활성이 없었으며, 5% 수준에서는 대표적인 장내 혐기성균인 bacteroides 증식 억제 효과가 크게 나타났을 뿐만 아니라, bifidobacteria와 lactobacilli도 억제하였다. 이와 같은 결과는 분자량 30~50 kDa 키토산을 0.
- 키토올리고당이 혈장 콜레스테롤을 낮추고 지질 상태를 개선하는 기전 중 하나로 키토산과 마찬가지로 키토올리고당의 양이온 구조가 담즙산염과의 이온결합을 통해 배설을 높임으로써 혈중 콜레스테롤을 감소시키거나 또는 지질을 직접 trapping하여 분변으로 배출시킴으로써 가능할 것이다 (36). 본 연구에서 키토올리고당 5% 첨가는 분변으로의 지질 배설량을 증가시켰으므로 키토올리고당이 장내에서 지질을 흡착하여 trapping한 효과가 있다고 판단된다. 그러나 분변의 담즙산 함량에는 차이가 없으므로 1~3 kDa의 키토 올리고당은 담즙산을 흡착하여 변으로 배설하는 능력은 크지 않으며, 그 결과로 간조직의 콜레스테롤 함량과 혈장 콜레스테롤 농도에는 영향을 미치지 않은 것으로 추정된다.
- 젖산을 생성하는 유익한 장내 세균인 bifidobacteria와 lactobacilli는 Gram-positive 박테리아인 반면, bacteroides는 Gram-negative bacteria이다. 본 연구에서 키토올리고당의 용량에 따른 장내 미생물 증식 억제 효과가 0~2% 용량에 비해 5% 용량에서 혐기성균에 비해 호기성균, 그리고 장내 유익균인 bifidobacteria와 lactobacilli에 비해 Gram-negative bacteria인 bacteriodes에서 더 크게 나타났다.
- 본 연구에서는 식이의 20%를 지방으로 조성한 고지방식이에 1~3 kDa 키토올리고당을 식이의 0.5%, 2%, 5% 수준으로 용량을 달리했을 때 혈장 콜레스테롤 변화는 없었으며, 혈장 중성지방 농도는 2%와 5% 첨가에서 첨가 용량이 높을수록 낮아지는 효과를 보였다. 선행 연구들에서는 대부분 콜레스테롤을 첨가한 고지방식이를 사용하였으나, 본 연구에서는 고지방식이를 사용하여 콜레스테롤보다 중성지방 감소 효과가 나타난 것으로 유추된다.
- 분변의 미생물 상태는 장내 미생물 상태를 반영하므로 분변의 미생물 균수는 키토올리고당의 장내 항균 활성을 예측하는 지표로 볼 수 있다. 분변 g당 bifidobacteria, lactobacilli, bacteroides, total anaerobes, total aerobes 균수는 대조군, COS 0.5% 첨가군, COS 2% 첨가군 간에는 유의한 차이가 없었으나, COS 5% 첨가군에서 유의하게 감소하였다. 키토올리고당 첨가에 의한 세균 수의 감소 효과는 total anaerobes에 비해 total aerobes에서 더 크게 나타났다.
- 5% 첨가군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다(Table 6). 분변의 총 콜레스테롤 농도는 COS 0.5% 첨가군과 COS 2% 첨가군에 비해 COS 5% 첨가군에서 유의하게 높았으며, 중성지방 농도는 대조군과 COS 0.5% 첨가군에 비해 COS 5% 첨가군에서 유의하게 높았다. COS 5% 첨가군의 총 담즙산 농도는 대조군과는 차이가 없었으나, COS 0.
- 674 kDa)의 키토올리고당을 식이의 10% 수준으로 5주간 급여한 결과 키토올리고당 섭취군의 식이섭취량과 식이효율은 대조군과 유의적 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과에서 1 kDa 미만의 저분자량의 키토올리고당은 체중 증가를 억제하지 않으며, 분자량이 1 kDa 이상으로 크더라도 식이의 2% 첨가는 크게 영향을 미치지 않는 듯하다.
- 중성지방 농도는 COS 2% 첨가군과 COS 5% 첨가군이 대조군에 비해 유의하게 낮은 농도를 보였으며, 올리고당의 용량이 높아질수록 낮아지는 경향을 보였다. 이처럼 혈장 콜레스테롤에 미치는 키토올리고당의 효과가 뚜렷하지 않은 반면에, 혈장 중성지방을 낮추는 용량-반응 효과는 뚜렷이 나타났다. 혈장 GPT 활성은 COS 5% 첨가군에서 대조군에 비해 2배 정도 높았다.
- 그러나 분변의 담즙산 함량에는 차이가 없으므로 1~3 kDa의 키토 올리고당은 담즙산을 흡착하여 변으로 배설하는 능력은 크지 않으며, 그 결과로 간조직의 콜레스테롤 함량과 혈장 콜레스테롤 농도에는 영향을 미치지 않은 것으로 추정된다. 저분자량 키토올리고당이 흰쥐에서 성장, 식이효율, GPT 활성 및 장내미생물생태에 미치는 효과와 선행연구 결과들을 종합적으로 고려할 때, 식이의 2～3% 수준이 적절한 용량인 것으로 판단된다.
- 총 콜레스테롤, HDL-C 및 LDL-C 농도는 대조군과 키토올리고당 첨가군 사이에 차이가 없었다. 중성지방 농도는 COS 2% 첨가군과 COS 5% 첨가군이 대조군에 비해 유의하게 낮은 농도를 보였으며, 올리고당의 용량이 높아질수록 낮아지는 경향을 보였다. 이처럼 혈장 콜레스테롤에 미치는 키토올리고당의 효과가 뚜렷하지 않은 반면에, 혈장 중성지방을 낮추는 용량-반응 효과는 뚜렷이 나타났다.
- 7% 수준으로 유의하게 낮았다. 체중 100 g당 간의 무게는 군간 유의한 차이가 없는 반면에 맹장의 무게, 소장의 무게와 길이는 COS 5% 첨가군이 다른 군에 비해 유의하게 높았다. 장 통과시간은 군간 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 3).
- 혈장 지질 양상은 Table 5와 같다. 총 콜레스테롤, HDL-C 및 LDL-C 농도는 대조군과 키토올리고당 첨가군 사이에 차이가 없었다. 중성지방 농도는 COS 2% 첨가군과 COS 5% 첨가군이 대조군에 비해 유의하게 낮은 농도를 보였으며, 올리고당의 용량이 높아질수록 낮아지는 경향을 보였다.
- 5% 첨가군, COS 2% 첨가군 간에는 유의한 차이가 없었으나, COS 5% 첨가군에서 유의하게 감소하였다. 키토올리고당 첨가에 의한 세균 수의 감소 효과는 total anaerobes에 비해 total aerobes에서 더 크게 나타났다.
- 이처럼 혈장 콜레스테롤에 미치는 키토올리고당의 효과가 뚜렷하지 않은 반면에, 혈장 중성지방을 낮추는 용량-반응 효과는 뚜렷이 나타났다. 혈장 GPT 활성은 COS 5% 첨가군에서 대조군에 비해 2배 정도 높았다. 흰쥐에게 공급한 식이 5% 수준의 키토올리고당은 kg 체중당으로 환산할 경우 일일 2 g 이상에 해당하며, 이 용량은 식품의약품안전청이 설정한 키토산과 키토올리고당의 일일섭취량(2)의 50~100배의 수준에 해당한다.
- 본 연구에서 사용한 식이는 지방함량이 20%에 해당하는 고지방식이이다. 흰쥐의 체중증가량이 COS 2% 첨가군에서는 대조군과 차이가 없었으나, COS 5% 첨가군에서는 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 고콜레스테롤 식이에 분자량 1～20 kDa 키토올리고당을 식이의 1% 또는 2%로 첨가 하여 먹인 결과 체중증가량, 식이섭취량, FER에서 유의적인 차이 없음(20)과 유사하였다.
후속연구
- 흰쥐에게 공급한 식이 5% 수준의 키토올리고당은 kg 체중당으로 환산할 경우 일일 2 g 이상에 해당하며, 이 용량은 식품의약품안전청이 설정한 키토산과 키토올리고당의 일일섭취량(2)의 50~100배의 수준에 해당한다. 키틴 및 키토산의 독성은 보고되지 않았으며, 키토올리고당의 독성에 관한 연구로서 마우스 체중 kg당 5 g까지 경구투여 후 급성독성검사에서 어떤 이상 증상도 발견되지 않았으므로(38), 증가된 GPT 활성에 대한 이유는 추가 실험이 필요하다고 본다.
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