서울시 수계시설에서 분리된 Legionella pneumophila의 분자역학적 특성 Molecular Epidemiology of Legionella pneumophila Isolated from Water Supply Systems in Seoul, Korea원문보기
Objectives: The genus Legionella is common in aquatic environments. Some species of Legionella are recognized as potential opportunistic pathogens for human, notably Legionella pneumophila that causes, Legionellosis. Thus, we investigated the contamination of Legionella pneumophila on water supply s...
Objectives: The genus Legionella is common in aquatic environments. Some species of Legionella are recognized as potential opportunistic pathogens for human, notably Legionella pneumophila that causes, Legionellosis. Thus, we investigated the contamination of Legionella pneumophila on water supply systems in Seoul, including cooling towers, public baths, hospitals and fountains. Methods: The existence of 16S rRNA and mip gene of L. pneumophila was confirmed in the genome of the isolated strains by PCR. Results: During the summer season of 2010 and 2011, Legionella pneumophila were detected from 163 samples (21.1%) out of 772 samples collected. Among the 163 strains of L. pneumophila, eighty one isolates belonged to serogroup 1 (57.4%), 23 isolates were serogroup 5 (16.3%), 21 isolates were serogroup 6 (14.9%), 8 isolates were serogroup 2 (5.79%), and 8 isolates were identified in serogroup 3 (5.7%). Through PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) analysis using Sfi I, genetic types of L. pneumophila were classified into five (A to E) patterns by the band similarity with excess of 70% from public baths. Conclusions: The PFGE patterns of the serotypes showed a tendency for diversity of L. pneumophila. Our results suggest the existence of serological and genetic diversity among the L. pneumophila isolates.
Objectives: The genus Legionella is common in aquatic environments. Some species of Legionella are recognized as potential opportunistic pathogens for human, notably Legionella pneumophila that causes, Legionellosis. Thus, we investigated the contamination of Legionella pneumophila on water supply systems in Seoul, including cooling towers, public baths, hospitals and fountains. Methods: The existence of 16S rRNA and mip gene of L. pneumophila was confirmed in the genome of the isolated strains by PCR. Results: During the summer season of 2010 and 2011, Legionella pneumophila were detected from 163 samples (21.1%) out of 772 samples collected. Among the 163 strains of L. pneumophila, eighty one isolates belonged to serogroup 1 (57.4%), 23 isolates were serogroup 5 (16.3%), 21 isolates were serogroup 6 (14.9%), 8 isolates were serogroup 2 (5.79%), and 8 isolates were identified in serogroup 3 (5.7%). Through PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) analysis using Sfi I, genetic types of L. pneumophila were classified into five (A to E) patterns by the band similarity with excess of 70% from public baths. Conclusions: The PFGE patterns of the serotypes showed a tendency for diversity of L. pneumophila. Our results suggest the existence of serological and genetic diversity among the L. pneumophila isolates.
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문제 정의
pneumophila 을 대상으로 혈청형, 병원성 유전자의 확인 및 PFGE pattern 분류를 실시하였다. 이를 통해 L. pneumophila 의 유전적 분포실태 파악과 예방관리 근거 자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
2010년부터 2011년까지의 서울지역 중 한강을 중심으로 강북지역 3개구와 강남지역 3개구를 선별하여 다중이용시설에서 분리된 레지오넬라균에 대해 혈청형 검사, PCR법을 이용한 16S rRNA 및 L. pneumophila에 특이적으로 존재하는 mip 유전자 확인검사와 PFGE 분석을 실시하였다.
01 ml을 GVPC(glycine-vancomycin-polymyxin B-colisitin)를 첨가한 BCYE-α (buffered charcoal yeast extract-α-ketoglutarate, Difco, Sparks, USA) 선택배지에 각각 도말하고, 37℃에서 7일간 배양하였다. 3일째부터 자란 집락 중 회백색이고, 약간 투명감이 있고, 습윤한 집락으로 특유의 신냄새가 있고 해부현미경 상에서 cut-glass의 형태를 띄는 집락에 대하여 그람염색을 시행하였다. 그람음성 막대균으로 확인된 집락을 다시 BCYE-α 한천배지와 L-cysteine (Difco, Sparks, USA)이 결핍된 BCYEα 한천배지 및 혈액한천배지에 각각 계대배양하였다.
EtBr (0.5 µg/mL) 용액에서 gel을 20분간 염색한 후, 증류수로 탈색과정을 거친 다음 transilluminator를 이용하여 밴드를 확인하였다.
L. pneumophila의 패턴 분석에는 Not I을 사용하는 것보다 Sfi I을 사용하는 것이 세분화된 분류를 하기에는 변별력이 있다고 한 Park 등17)의 결과를 토대로 Sfi I제한효소를 이용하였다. 2010년부터 2011년까지의 서울시 다중이용시설에서 분리된 L.
가열법으로 추출한 DNA를 GeNeT Bio premix(Genet Bio, Korea)를 사용하여 97℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72°C에서 40초를 30회 반복하고 최종 72℃에서 5분간 증폭시켰다.
그람음성 막대균으로 확인된 집락을 다시 BCYE-α 한천배지와 L-cysteine (Difco, Sparks, USA)이 결핍된 BCYEα 한천배지 및 혈액한천배지에 각각 계대배양하였다.
본 연구는 2010년부터 2011년까지 서울시 소재 대형건물, 병원, 대형목욕탕, 호텔, 분수 등 다중이용시설의 냉각탑수, 목욕탕수, 분수 등으로부터 분리된 L. pneumophila 을 대상으로 혈청형, 병원성 유전자의 확인 및 PFGE pattern 분류를 실시하였다. 이를 통해 L.
본 연구에서는 사람에 대한 병원성과 연관성이 깊고 다른 레지오넬라균에 대하여 L. pneumophila를 구별할 수 있게 하는 표적 유전자인 mip (macrophage infectivity potentiator)을 이용하였다. Mip는 초기에 macrophage 내 감염을 효과적으로 일으키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
분리된 L. pneumophila 시험균주를 다시 BCYE-α 한천배지에서 배양 후, serotyping kit (Denka Seiken, Japan)을 사용하여 혈청형을 확인하였다.
생리식염수에 시험균을 현탁시킨 다음 100℃에서 1시간 또는 120°C에서 15분간 가열처리한 후, 슬라이드 응집 시험법에 의한 항혈청-항원액 반응으로 혈청형을 결정하였다.
가열법으로 추출한 DNA를 GeNeT Bio premix(Genet Bio, Korea)를 사용하여 97℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72°C에서 40초를 30회 반복하고 최종 72℃에서 5분간 증폭시켰다. 이 PCR산물을 1.5% agarose gel을 이용하여 25분간 전기영동한 후 16S rRNA 및 mip유전자의 증폭유무를 확인하였다 (Fig. 1).
대상 데이터
pneumophila의 패턴 분석에는 Not I을 사용하는 것보다 Sfi I을 사용하는 것이 세분화된 분류를 하기에는 변별력이 있다고 한 Park 등17)의 결과를 토대로 Sfi I제한효소를 이용하였다. 2010년부터 2011년까지의 서울시 다중이용시설에서 분리된 L. pneumophila에 대해 한강을 중심으로 강북지역과 강남지역으로 분리하여 PFGE를 실시하였다. 우선 2010년 강남지역 분석 결과, 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~C까지 3개의 유형으로 분류되었다 (Fig.
2010년부터 2011년까지의 서울지역 다중이용시설의 냉각탑수, 목욕탕수, 분수 등 총 772건에 대하여 L. pneumophila 배양검사를 실시하였다. 그 결과 163건(21.
2010년부터 2011년까지의 서울지역 중 한강을 중심으로 강북지역 3개구와 강남지역 3개구를 선별하여 대형건물, 병원, 대형목욕탕, 호텔, 분수 등의 다중이용시설에 대해 냉각탑수, 목욕탕수, 분수 등을 대상으로 총 772건에 대하여 L. pneumophila 검출 실험을 실시하였다.
PCR에 사용한 Primer는 레지오넬라균속에 특징적인 16S rRNA primer set (F: 5'-AGGGTTGATAGGTTAAGAGG-3', R: 5'- CAACAGCTAGTTGACATGG3')과 L. pneumophila 균종에 특이적인 mip 유전자 Primer set (F: 5'-GGTGACTGCGGCTGTTATGG-3', R: 5'- GGCCAATAGGTCCGCCAACG-3')을 사용하였다 (Table 1).
데이터처리
5 µg/mL) 용액에서 gel을 20분간 염색한 후, 증류수로 탈색과정을 거친 다음 transilluminator를 이용하여 밴드를 확인하였다. PFGE 결과 분석을 위하여 BioNumerics software (Applied Maths, Belgium) version 3.5를 이용하여 dendrogram을 작성하였다.16)
성능/효과
1. 대상검체 중 대형쇼핑센터, 호텔 등 대형건물 273건 중 70건에서 레지오넬라균이 검출되어 25.6%의 가장 높은 검출율을 나타내었으며, 대형목욕탕 263건에서는 57건(21.7%), 병원 212건에서는 35건(16.5%), 분수대 24건에서는 1건(4.2%)이 각각 검출되었다.
2. 분리동정된 L. pneumophila 의 혈청형 분포는 1형이 81주(57.4%), 5형이 23주(16.3%), 6형이 21주(14.9%), 2형이 8주(5.7%), 3형이 8주(5.7%)로 확인되었으며 22주가 6가지 혈청형에 반응이 일어나지 않았다.
또한 높은 상동성을 나타내는 균주들간에 다양한 혈청형이 존재함을 보여주었다. 2010년부터 2011년까지의 강남지역과 강북지역의 다중이용목욕시설을 분석한 결과 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~E까지 5개의 유형으로 분류되었다 (Fig. 6). 이를 다시 80% 이상의 상동성을 기준으로 A유형은 A1~A4, D유형은 D1~D5의 subtype으로 분류되었다.
2010년부터 2011년까지의 서울지역 중 한강을 중심으로 강북지역 3개구와 강남지역 3개구를 선별하여 다중이용시설 수계환경검체 총 772건에 대한 레지오넬라 검사를 한 결과 163건의 검체에서 레지오넬라균이 검출되어 21.1%의 검출율을 나타내었다(Table 2).
3. 2010년부터 2011년까지의 강남지역과 강북지역의 다중이용목욕시설 PFGE 분석을 한 결과 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~E까지 5개의 유형으로 분류되었다. 이를 다시 80% 이상의 상동성을 기준으로 A유형은 A1~A4, D유형은 D1~D5의 subtype으로 분류되었다.
4)되었으며 이를 다시 85% 이상의 상동성을 기준으로 분류한 결과 A유형은 A1~A8, B유형은 B1~B5, C유형은 C1~C2의 subtype으로 분류되었다. 가장 많은 유형은 A유형으로 22주(55%)로 나타났으며 혈청형 1형이 높게 나타났다. 2011년 강남지역 결과에서도 같은 지역의 같은 종류의 시설물들의 상동성이 높게 나타난 것을 볼 수 있다.
각 검체별 오염도는 대형건물 25.6% > 대형목욕탕 21.7% > 병원 16.5% > 분수대 4.2% 순으로 확인되었다.
pneumophila 배양검사를 실시하였다. 그 결과 163건(21.1%)에서 L. pneumophila가 검출되었다. 분리동정된 L.
대상검체 중 대형쇼핑센터, 호텔 등 대형건물 273건 중 70건에서 레지오넬라균이 검출되어 25.6%의 가장 높은 검출율을 나타내었으며, 대형목욕탕 263건에서는 57건(21.7%), 병원 212건에서는 35건(16.5%), 분수대 24건에서는 1건(4.2%)이 각각 검출되었다.
B유형에서 다른 지역의 균주들과 상동성이 100%로 나타났으며 이는 같은 균주가 넓게 분포되어 있는 것으로 추정할 수 있다. 또한 높은 상동성을 나타내는 균주들간에 다양한 혈청형이 존재함을 보여주었다. 2010년부터 2011년까지의 강남지역과 강북지역의 다중이용목욕시설을 분석한 결과 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~E까지 5개의 유형으로 분류되었다 (Fig.
A유형과 B유형이 넓게 분포되었으며 혈청형 1이 대부분을 차지하였다. 또한 대형건물, 대형목욕탕, 병원 등 같은 종류의 시설물들간의 상동성이 높게 나타났다. 2011년 강남지역을 분석한 결과, 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~C까지의 3가지 유형으로 분류 (Fig.
pneumophila가 유전적으로 다양하게 분화되어 감을 알 수 있었다. 또한 지역내의 같은 수계시설간의 상동성이 높게 나타났으나, 다른 지역간의 상동성이 높게 나타나는 것도 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 Lee 등23)의 결과와 마찬가지로 서울전역에 L.
본 연구를 통하여 같은 혈청형이라 할지라도 다양한 유전형이 분포되는 것을 알 수 있었으며 인공의 수계시설에서 분리한 L. pneumophila가 유전적으로 다양하게 분화되어 감을 알 수 있었다. 또한 지역내의 같은 수계시설간의 상동성이 높게 나타났으나, 다른 지역간의 상동성이 높게 나타나는 것도 확인할 수 있었다.
6% 검출되었다. 본 연구에서도 냉각탑수와 목욕탕수 모두 혈청형 1형이 57.4%로 높게 검출되어 다른 연구들과 같은 결과로 나타났으며, 목욕탕수의 경우 혈청형 5형과 6형도 혈청형 1형과 더불어 우세하게 상존하는 레지오넬라 혈청형으로 확인되었다. 한편 Kim 등21)과 Kim 등22)의 결과와 비교해 볼 때 4형은 여전히 검출되지 않았다.
이를 다시 85% 이상의 상동성을 기준으로 A유형은 A1~A3, B유형은 B1~B4, C유형은 C1~C5의 subtype으로 분류되었다. 시설별로 보면 A유형은 대형목욕탕이 대부분을 차지하였으며 혈청형 1형과 더불어 다중이용목욕시설에서 우세하게 상존하는 혈청형 5형, 6형이 대부분을 차지하였으며 같은 지역내의 시설물들이 높은 상동성으로 나타났다. C유형의 경우 같은 지역, 같은 종류의 시설물들의 상동성이 높게 나타남으로써 동일 유래균으로 추정할 수 있다.
레지오넬라균의 오염 가능성이 있는 수계환경에 대하여 오염여부를 조사하여 효율적인 소독 및 관리방안을 제시하고 분리된 레지오넬라균에 대한 유형을 분석하여 환자 발생시 비교 가능한 데이터를 확보하는 것은 레지오넬라증 예방관리에 있어 중요한 일이라 생각된다. 이에 본 연구에서는 2010년부터 2011년까지의 서울지역 중 한강을 중심으로 강북지역 3개구와 강남지역 3개구를 선별하여 다중이용시설 수계환경검체 총 772건에 대한 레지오넬라 검사를 실시한 결과 163건의 검체에서 레지오넬라균이 검출되어 21.1%의 검출율을 나타내었다. 각 검체별 오염도는 대형건물 25.
후속연구
pneumophila을 함께 연구하고, 이들 분리균주에 대한 유전자 pattern 분석결과를 데이터베이스화하면, 레지오넬라증의 집단 발생 또는 산발적인 질병 발생이 있을 경우 분자역학적인 도구로서 이용 가능할 것으로 생각된다. 또한 감염원과 감염경로의 파악 및 대책수립에 유용한 자료를 제공할 수 있을 것이다.
가 유전적으로 다양하게 분화되어감을 추측할 수 있다. 추후 계속되는 연구를 통하여 이러한 subtype의 분포의 변화를 관찰함으로써 다중이용시설에서의 L. pneumophila 균종의 생태에 대한 기초 정보를 얻을 수 있을 것이다.
환경수계에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 노출이 증가하고 있는 시점에서 환경뿐만 아니라 사람에서 분리한 L. pneumophila을 함께 연구하고, 이들 분리균주에 대한 유전자 pattern 분석결과를 데이터베이스화하면, 레지오넬라증의 집단 발생 또는 산발적인 질병 발생이 있을 경우 분자역학적인 도구로서 이용 가능할 것으로 생각된다. 또한 감염원과 감염경로의 파악 및 대책수립에 유용한 자료를 제공할 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Mip의 초기 역할은?
pneumophila를 구별할 수 있게 하는 표적 유전자인 mip (macrophage infectivity potentiator)을 이용하였다. Mip는 초기에 macrophage 내 감염을 효과적으로 일으키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.8-12)
L-cysteine 은 어떤 역할을 하는가?
그람음성 막대균으로 확인된 집락을 다시 BCYE-α 한천배지와 L-cysteine (Difco, Sparks, USA)이 결핍된 BCYEα 한천배지 및 혈액한천배지에 각각 계대배양하였다. L-cysteine은 성장을 자극하는 역할을 한다. BCYE-α 한천배지에서는 발육하고 L-cysteine 결핍된 BCYE-α 한천배지 및 혈액한천배지에서는 발육하지 않는 그람음성 막대균을 레지오넬라균으로 일차 동정하였다.
레지오넬라속균에 의한 감염 특징은?
)은 자연계의 토양을 비롯한 하천과 호수에서 서식하는 그람음성 막대균으로 편모를 가지고 있어 운동성이 있다. 레지오 넬라 감염은 대개 불현성으로 진행되며, 임상증상은 독감과 유사한 증상을 나타내는 폰티악열과 중증의 폐렴을 나타내는 레지오넬라증(재향군인병)의 두 가지 형태로 나타난다. 레지오넬라증의 발병은 면역억제제 치료자, 수술환자, 알코올중독자, 흡연자, 노약자 등 면역력이 떨어진 개체에 치명적이며, 사람에서 사람으로의 감염은 일어나지 않고 사람만이 유일한 자연숙주로 알려져 있다.4)
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