선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 안전성도 높고 방어능도 뛰어나다고 보고된(Lee et al., 2007) 불활화백신을 이용하여 SG 야외균주에 대한 방어능을 조사하였다. 불활화백신은 균 전체를 불활화시키는 대신, 살모넬라의 세포외막단백질(outer membrane proteins, OMPs)만을 추출한 후 세포매 개성면역 유발을 보조할 수 있는 부형제(adjuvant)와 함께 백신을 제조하였다.
제안 방법
- 5, 6.3 µg의 양으로 접종한 후, 2주 뒤 공격접종을 실시하였으며 2) 접종 경로는 근육주사와 피하주사로 나누었다. 3) 접종횟수는 백신 1회 접종 및 2회 접종그룹으로 나눈 뒤 각각의 백신 접종이 끝난 시점을 기준으로 2주 뒤 공격접종을 하였다.
- 3 µg의 양으로 접종한 후, 2주 뒤 공격접종을 실시하였으며 2) 접종 경로는 근육주사와 피하주사로 나누었다. 3) 접종횟수는 백신 1회 접종 및 2회 접종그룹으로 나눈 뒤 각각의 백신 접종이 끝난 시점을 기준으로 2주 뒤 공격접종을 하였다.
- 3) 접종횟수로 각각 나누어 시험백신의 방어효과 및 항체 형성능을 조사하였다. 1) 항원의 농도는 한 그룹당 5수로 하여 200, 100, 50, 25, 12.
- Strip 당 시료는 각각 200 µg씩을 사용하였으며, Amersham Biosciences사의 Multiphore II system을 이용하여 제조회사의 사용메뉴얼을 준수하여 20°C에서 IEF를 수행하였다. IEF 조건은 150 V에서 3,500 V까지의 도달시간을 3시간 되게 하였으며, 3,500 V에서 26시간 지속되도록 하여 최종적으로 96 kVh가 되도록 설정하였다.
- 이차원전기영동은 하나의 샘플을 동시에 2번 실시하여 처음의 것은 도은염색하고, 다른 하나는 immunoblot assay 를 위해 PVDF membrane(Amersham Pharmacia Biotech, USA)에 transfer시켰다. Immunoblotting assay는 Wu의 방법(2002)을 수정하여 실시하였다. 즉, membrane은 TBST(50 mM Tris-Cl pH 7.
- SG OMPs의 대량 추출과 추출방법에 따른 비용절감을 위해 추출방법을 단순화시켰다. 위로부터 침전된 SG 균체를 Macfarland No.
- SG 세포외막단백질을 이용한 서브유니트백신의 효과적인 접종량을 결정하기 위해 각 군은 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.3 µg/1 dose 및 흉부근육으로 투여되었으며 2주 뒤 공격 접종을 실시하여 2주간 생존율을 관찰하였다.
- Strip 당 시료는 각각 200 µg씩을 사용하였으며, Amersham Biosciences사의 Multiphore II system을 이용하여 제조회사의 사용메뉴얼을 준수하여 20°C에서 IEF를 수행하였다.
- 각 군은 다시 OMP 접종량 별로 200, 100, 50, 25 µg으로 나누어 투여 경로별에 따른 생존율 및 적정량을 재평가하였다.
- 갈색계에 감염되어 큰 경제적 손실을 유발하는 SG의 감염을 효과적으로 방어하기 위해 균의 세포외막단백질을 항원으로 이용하여 백신을 제조하였다. 백신의 구성 단백질 확인을 위해 프로테오믹 분석을 실시하였으며 분석 후 이를 실험동물에 투여하여 백신의 효능평가를 실시한 결과 다음의 결과를 얻을 수 있었다.
- , 1999) Bouzoubaa (1987) 등은 가금티푸스 예방을 위해 OMPs 항원이 생균 백신 제제로 사용되어지고 있는 SG 9R백신보다 안전성이나 방어능이 뛰어난 것을 입증하였다. 그러므로 본 실험에서는 그 효과를 재증명함에 있어서 기존 논문보다 OMPs의 수율향상을 위한 OMPs 추출방법의 변화에 초점을 맞추었다. 또한 추출된 OMPs을 구성하고 있는 면역원성 단백질들의 분석을 위해 이차원 전기영동 후 SG 항혈청을 이용하여 immunoblot assay 및 peptide mass fingerprinting (PMF) 분석방법을 사용하여 단백질 동정을 실시하였다.
- 그러므로 본 실험에서는 그 효과를 재증명함에 있어서 기존 논문보다 OMPs의 수율향상을 위한 OMPs 추출방법의 변화에 초점을 맞추었다. 또한 추출된 OMPs을 구성하고 있는 면역원성 단백질들의 분석을 위해 이차원 전기영동 후 SG 항혈청을 이용하여 immunoblot assay 및 peptide mass fingerprinting (PMF) 분석방법을 사용하여 단백질 동정을 실시하였다.
- 5% Tween 20) 에 5% fetal bovine serum을 넣어 1시간 37℃에서 반응 후 차례대로 SG백신균주를 2주 간격으로 2회 접종하여 얻은 항혈청을 1:100으로 희석하여 2시간 37℃에서 반응시키고 anti-chicken IgG는 1:1000의 비율로 1시간, 37℃에서 반응 후 최종적으로 항원항체결합체는 3,3'-diaminobenzidine tetrahydro-chloride(DAB)에 의해 반응시켜 염색하였다. 반응한 spot들은 도은염색으로 시각화된 spot들과 비교 후 trypsin을 처리한 후 Mass spectrometry로 질량분석 후에 얻어진 각 단백질의 고유한 peak값으로 PMF(peptide mass fingerprinting)에 의해 분석되어 NCBI database에 근거한 아미노산 염기서열에 의해 고유 단백질로 동정되었다.
- 갈색계에 감염되어 큰 경제적 손실을 유발하는 SG의 감염을 효과적으로 방어하기 위해 균의 세포외막단백질을 항원으로 이용하여 백신을 제조하였다. 백신의 구성 단백질 확인을 위해 프로테오믹 분석을 실시하였으며 분석 후 이를 실험동물에 투여하여 백신의 효능평가를 실시한 결과 다음의 결과를 얻을 수 있었다.
- 백신접종 횟수에 따른 방어효과를 평가하기 위해 갈색 산란계 35수를 1회 백신접종군과 2회 백신접종군으로 나누어 실험하였으며 1차 백신과 2차 백신 사이의 기간은 3주로 하였고, 흉부근육으로 투여되었으며 OMP 용량은 각각 200, 100, 50 µg으로 평가하여 결과를 Table 2에 나타내었다.
- 3%(v/v) formalin을 첨가한 후 37°C에서 3일간 불활화하였으며 BCATM protein assay kit(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 outer membrane protein의 정량 측정 후 protein 농도를 10,000 µg/mL로 조정하여 냉장 보관하면서 시험백신을 제조하였다. 부형제(adjuvant)는 ISA70를 사용하여 60%(v/v) 로 농도 조절하여 OMP백신과 혼합하여 각각의 백신량으로 조절하고 나머지는 인산완충액(phosphate buffered saline)로 채운 후, T. K. HOMO mixer mark II(IKA, Japan)를 이용하여 20-30분간 부형제와 OMP 백신을 인산완충액에 혼합하여 사용하였다.
- , 2007) 불활화백신을 이용하여 SG 야외균주에 대한 방어능을 조사하였다. 불활화백신은 균 전체를 불활화시키는 대신, 살모넬라의 세포외막단백질(outer membrane proteins, OMPs)만을 추출한 후 세포매 개성면역 유발을 보조할 수 있는 부형제(adjuvant)와 함께 백신을 제조하였다. OMPs의 경우 세포매개성 면역을 활성화시키는 immunodominant proteins으로서 보고되고 있으며(Lee et al.
- 살모넬라는 약 2,500개의 혈청형으로 이루어져있으며 숙주영역이 광범위한 혈청형과 숙주영역이 좁은 혈청형으로 구분할 수 있는데 숙주영역이 좁으며 양계산업에 있어 경제적 피해를 일으키는 SG와 넓은 숙주영역을 가지며 사람에게 계육, 계란 등을 통해 식중독을 유발하는 SE(Barrow et al., 1994)를 동시에 효과적으로 예방하기 위해 SG의 세포외막단백질만을 추출하여 불활화 백신을 제조하여 효능및 안전성을 검증하였다. 특히 세포내 기생세균이 살모넬라 방어를 위해 요구되는 세포매개성면역은 부형제를 사용하여 그 효과를 보강하였다.
- SG OMPs의 대량 추출과 추출방법에 따른 비용절감을 위해 추출방법을 단순화시켰다. 위로부터 침전된 SG 균체를 Macfarland No. 10에 맞추어 재부유하였다. 추출방법은 변형된 Barenkamp의 방법(Barenkamp et al.
- 7 kVh가 되게 전개하였다. 이차원전기영동이 완료된 이차원 젤의 단백질은 도은염색을 실시하여 단백질 spot을 확인하였다.
- 추출한 crude outer membrane protein에 0.3%(v/v) formalin을 첨가한 후 37°C에서 3일간 불활화하였으며 BCATM protein assay kit(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 outer membrane protein의 정량 측정 후 protein 농도를 10,000 µg/mL로 조정하여 냉장 보관하면서 시험백신을 제조하였다.
- 투여에 따른 부작용은 최소로 하되 백신의 효과를 유발하기에 적절한 투여경로를 찾기 위해 두 군으로 나누어한 군은 흉부근육에 투여를 하고 다른 한 군은 피하에 접종하였다. 각 군은 다시 OMP 접종량 별로 200, 100, 50, 25 µg으로 나누어 투여 경로별에 따른 생존율 및 적정량을 재평가하였다.
대상 데이터
- OMP 분리를 위한 후보 균주로는 본 연구팀의 선행연구 결과를 토대로 2000년에 강원도 원주에 위치한 농장의 산란계에서 분리된 SG 분리균주를 사용하였으며 이 균주의 유전형은 XbaI와 SpeI의 제한효소를 이용한 PFGE type에서 국내분리주 중 대표적인 PFGE type인 A type을 보인 균주였다(Seo et al., 2006). SG균주는 Tryptic soy broth (BD Difco, USA) 액체배지에서 18시간, 37℃에서 배양하여 13,000 rpm으로 20분간 4℃에서 원심분리한 후 침전된 균을 OMPs 추출을 위해 사용하였다.
데이터처리
- OMP 백신의 교차반응 확인을 위해 부검 후 실질장기에서 검출된 공격접종균주의 CFU에 대한 통계학적 유의 성은 one-way Anova test를 이용하여 p<0.05 이하의 유의 성만을 통계학적 차이로 인정하였다(Lee et al., 2007).
이론/모형
- 10에 맞추어 재부유하였다. 추출방법은 변형된 Barenkamp의 방법(Barenkamp et al., 1981)에따라 부유된 균체를 초음파분쇄기(SLTt, USA)를 이용하여 균의 세포외막을 분쇄시킨 후에 원심분리기를 이용하여 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 OMP성분을 포함한 상층액을 수집하여 OMP 백신으로 사용하였다.
성능/효과
- 9개의 spot을 단백질 동정을 위해 PMF 분석을 실시한결과 1개의 spot만을 제외하고 나머지 8개의 spot이 모두 동정되었다(Table 1). 그 중에서 4개의 isoform을 가진 단백질인 OMP channel protein이 가장 빈도 높게 동정되었으며 outer membrane protein A와 DNA starvation and stationary phase protection protein이 각각 2개의 isoform을갖고 있었다.
- 1A). PDQuest software에 의해 map에 나타난 22개의 spot들을 분석하여 보면 대부분의 단백질들은 10~15 kDa와 30~45 kDa 사이, 등전점은 4~8 범위 내에 분포되어 있는 것을 확인하였다. 이러한 spot을 바탕으로 immunoblotting assay를 위해 SG 항혈청에 반응시킨 결과총 9개의 spot에서만 항원-항체반응이 일어났다(Fig.
- SG를 방어할 수 있는 서브유니트인 세포외막단백질의 구성 단백질 중 면역원성을 띄는 단백질을 규명하기 위해 실시한 프로테옴분석에서 3가지의 단백질을 동정할 수 있 었다. 3가지 단백질 중 outer membrane protein A의 경우, 이미 많은 연구논문에서 이 단백질을 전사시키는 유전자인 ompA가 숙주체내에서 T cell 반응 및 세포매개성면역을 자극시킨다고 보고되어지고 있다(Cordwell, 2006; Lee et al.
- 그 결과 근육 접종시에는 모든 OMP의 용량에서 100%의 생존율을 보인 반면 피하접종의 경우 200, 100 µg에서만 100%의 생존율을 보이고, 50 µg과 25 µg 에서는 각각 80%, 60%의 생존율을 보여 생존율측면에서볼 때 근육접종 경로가 효과적인 투여경로로 확인되었다 (Table 2).
- 그 결과 백 신비접종군이 보인 20%의 생존율에 비해 25 µg 이상의 용량에서는 모두 100%의 생존율을 보이며 백신의 효능을 입증하였다(Table 2).
- 9개의 spot을 단백질 동정을 위해 PMF 분석을 실시한결과 1개의 spot만을 제외하고 나머지 8개의 spot이 모두 동정되었다(Table 1). 그 중에서 4개의 isoform을 가진 단백질인 OMP channel protein이 가장 빈도 높게 동정되었으며 outer membrane protein A와 DNA starvation and stationary phase protection protein이 각각 2개의 isoform을갖고 있었다.
- 그러나 공격접종 2주 뒤 생존개체를 대상으로 병리조직을 관찰한 결과 25 µg 용량을 접종한 군에서는 심장결절 및 간의 심한 종대, 충혈, 황색 변화 및 청동색으로 변한 육안 병변을 확인할 수 있었으며(data not shown) 50 µg 이상에서는 간의 미미한 종대만 관찰되어 50 µg 이상의 SG OMP 용량이 숙주 체내에서 충분한 백신 효과 및 안전성을 보이는 것으로 나타났다.
- 닭에 부형제와 OMP백신을 혼합하여 백신을 투여한 경우 최저 농도 50 µg에서 100% 생존율의 효과를 나타내었으며 접종 경로는 근육접종이 피하접종보다 접종부위의 부작용이나 실질장기 미치는 영향이 적은 것으로 관찰되었다.
- , 1999). 따라서, 본 연구에서는 강하고 지속적으로 면역반응을 유지시키며 체액성 및 세포매개성 면역반응까지 유발시키는 효과적인 부형제를 사용함으로써, 최소한의 OMP양으로도 높은 생존율을 유지할 수 있 었다. 접종량 결정 실험에서 50 µg 이상의 OMP 농도가 숙주체내에서 뚜렷한 임상증상을 나타내지 않으면서도 100%의 생존율을 보였으며, 근육접종경로가 피하보다 백신접종부위의 부작용이 관찰되지 않으면서 간이나 비장의 실질장기에 나타나는 종대가 적게 관찰되었다.
- 또한 육안병변에서도 피하접종의 경우 20 µg에서 심장 외막염 및 심장결절을 보였으며 그 이하의 OMP 농도에서도 근육접종보다 간 및 비장의 종대가 심각하게 관찰되었다.
- 본 실험의 OMP 추출방법에 따른 OMP 분리양은 15 mL 배양 시 10 mg이였으며 이는 대량으로 단백질을 추출하여 수율 향상을 위한 문제점을 개선하였다. 또한 기존에 보고된 숙주의 면역반응유발을 위한 용량보다 훨씬 더 적은 용량으로도 같은 효과를 보였다는 점에서 양계농가에 가금 티푸스 예방에 기여할 것으로 사료된다.
- 백신접종 횟수에 따른 방어효과를 평가하기 위해 갈색 산란계 35수를 1회 백신접종군과 2회 백신접종군으로 나누어 실험하였으며 1차 백신과 2차 백신 사이의 기간은 3주로 하였고, 흉부근육으로 투여되었으며 OMP 용량은 각각 200, 100, 50 µg으로 평가하여 결과를 Table 2에 나타내었다. 생존율에서는 1회 백신 접종군과 2회 접종군 모두 각각의 OMP용량에서 100%의 생존율을 나타내었다. 게다가 육안병변의 차이도 1회 백신접종군의 200 µg에서 보여진 간의 미약한 종대 및 황색변화가 2회 백신접종군의 같은 용량의 OMP 접종군에서도 똑같이 관찰됨에 따라 백신의 투여횟수에 따른 백신의 효능이나 숙주체내의 반응은 크게 차이를 나타내지 않았다.
- 세포외막단백질을 이용한 백신의 효능은 이미 여러 차례 다른 논문에서 보고되었지만 본 실험의 경우 백신으로 사용될 세포외막단백질을 프로테오믹적 접근을 이용하여그 성분단백질을 조사하여 백신의 면역반응을 in vitro로 증명하였다.
- 접종량 결정 실험에서 50 µg 이상의 OMP 농도가 숙주체내에서 뚜렷한 임상증상을 나타내지 않으면서도 100%의 생존율을 보였으며, 근육접종경로가 피하보다 백신접종부위의 부작용이 관찰되지 않으면서 간이나 비장의 실질장기에 나타나는 종대가 적게 관찰되었다.
- 추출된 OMP의 등전점 및 분자량으로 전개하여 OMP의 구성성분 중 어떠한 단백질이 숙주 체내의 면역유발과 관련이 있는지 알아보기 위해 실시한 프로테옴 분석에서 2차원 전기영동 후 도은염색을 한 결과 22개의 spot이 관찰되었다(Fig. 1A). PDQuest software에 의해 map에 나타난 22개의 spot들을 분석하여 보면 대부분의 단백질들은 10~15 kDa와 30~45 kDa 사이, 등전점은 4~8 범위 내에 분포되어 있는 것을 확인하였다.
후속연구
- , 2007). 그러므로, OMP가 불활화 백신의 서브유니트로 사용될 경우 숙주의 면역체계를 유발할 수 있을 것이며, 본 연구에서 수행한 OMP 추출방법 또한 OmpA 단백질의 수율을 최대화하여 숙주의 체내 면역반응을 일으킬 수 있는 충분한 양의 단백질을 얻을 수 있을 것이다.
- 본 실험의 OMP 추출방법에 따른 OMP 분리양은 15 mL 배양 시 10 mg이였으며 이는 대량으로 단백질을 추출하여 수율 향상을 위한 문제점을 개선하였다. 또한 기존에 보고된 숙주의 면역반응유발을 위한 용량보다 훨씬 더 적은 용량으로도 같은 효과를 보였다는 점에서 양계농가에 가금 티푸스 예방에 기여할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.