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문제 정의
- 본 연구는 노루궁뎅이 버섯 열수추출물의 항산화 효능과 RAW 264.7 cell에서의 LPS에 의한 염증반응의 조절 효과에 대해 알아보고자 한다.
제안 방법
- DPPH는 Blois의 (Blois, 1958) 실험방법을 변형하여 열수 추출을 통해 얻어진 노루궁뎅이 버섯 시료를 10 ㎎을 증류수 1 ㎖ 로 희석하여 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 농도로 각각 1 ㎖ 씩 제조하고, standard로 사용되는 BHT 용액은 BHT 10 ㎎ 을 methanol 1 ㎖ 로 희석하여서 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 의 농도로 각각 1 ㎖ 씩 제조한다. 또한 DPPH 용액은 DPPH 0.
- 002 g에 methanol 25 ㎖ 로 제조한다. 96 well plate에 BHT 용액과 methanol를 각각 80 ㎕ 씩 혼합한 군, BHT와 DPPH 용액을 각각 80 ㎕ 씩 혼합한 군, sample과 DPPH 용액을 각각 80 ㎕ 씩 혼합한 군, methanol과 DPPH용액을 각각 80 ㎕ 씩 혼합한 군, methanol만을 160 ㎕ 씩 처리한 군, 증류수와 DPPH용액을 각각 80 ㎕ 씩 혼합한 군, 증류수와 methanol을 각각 80 ㎕씩 혼합한 군을 각각 구분하여 분주한 후 빛과 반응하지 못하게 foil로 감싸준 뒤 실온에서 30분간 방치한 후 ELISA reader를 이용해 517 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
- Oyaizu의 (Oyaizu, 1986) 방법에 따라 PBS와 1% potassium ferricyanide 2.5 ㎖ 를 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 의 농도로 제조한 sample과 standard인 BHT와 ascorbic acid 2.5 ㎖ 과 대조군 2.5 ㎖ 에 각각 혼합시킨 후 50℃에서 20분 동안 정치한 다음 반응이 끝난 혼합물을 각각 5 ㎖ 씩 새 tube로 옮긴 뒤 TCA (trichloroacetic acid) 용액 2.5 ㎖ 를 첨가하여 centrifuge에서 3,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 원심분리한 상층액 5 ㎖에 증류수 5 ㎖와 ferric chloride 1 ㎖를 첨가한 후 96well plate에 0.
- ABTS 라디칼 소거능은 Jeong 등의 방법을 (Jeong et al., 2009), 변형하여 측정하였다. 증류수에 용해한 7 mM의 ABTS와 2.
- 4)로 희석하였다. 노루궁뎅이 버섯 추출물과 standard인 ascorbic acid을 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 로 용해한 용액 0.1 ㎖ 와 위의 ABTS 용액 0.9 ㎖을 가하여 혼합한 후, 5분간 실온에서 정치한 후, 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 계산법은 아래와 같다.
- , 1994). standard인 gallic acid를 0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.30 ㎎/㎖ 의 농도로 실험하여 y = 0.0642x + 0.0618, R2 = 0.9903의 표준곡선을 획득하였고 노루궁뎅이 버섯 추출물을 10 ㎎/㎖ 로 용해한 용액 40 ㎕ 와 Folin-Ciocalteu phenol reagent을 1 ㎎/㎖ 로 용해한 용액 20 ㎕, Na₂CO₃(20%) 60 ㎕ 을 혼합한다. 암실에서 30분간 반응을 시킨 후 ELISA reader를 이용해 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 암실에서 30분간 반응을 시킨 후 ELISA reader를 이용해 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정 후 얻어진 페놀 농도에 표준곡선과 수율 (61.04%)을 이용해 총 페놀 함량 값을 측정하였다.
- 5)를 혼합하여 10분간 상온에서 반응시킨다. 그 후 1 N HCl 1 ㎖를 가한 혼합물과 농도처리만 된 sample과 standard를 0.15 ㎖ 을 가한 후 ELISA reader로 420 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 세포를 5 × 104 cells/well 의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각 세포에 알맞은 배지로 5 ㎎/㎖ 의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕ 의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 산출하였다.
- 각 세포에 알맞은 배지로 5 ㎎/㎖ 의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕ 의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 산출하였다.
- 불포화유리지방산의 일종인 Linoleic acid에 대한 노루궁뎅이 버섯의 산화 억제 활성 (oxidation inhibition)을 측정하였으며, 항산화제로 널리 쓰이는 ascorbic acid의 산화 억제 활성을 함께 비교하였다. linoleic acid 산화 억제능의 결과는 Fig.
대상 데이터
- 실험에 사용된 소재인 노루궁뎅이 버섯은 음건하고 분쇄하여 사용하였다. 리터당 약 100 g을 넣고 85℃에서 3회 반복 열수 추출하고, 추출액은 여과지 (Adventec Toyo 2, Japan)를 사용하여 2회 감압 여과하고 rotary evaporator로 농축하였다.
- 본 연구에 사용한 RAW 264.7 세포를 유지하기 위해 DEME 배지를 사용하였고, 이때 각각의 배지에 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco/BRL)와 1% penicillin이 포함된 용액을 사용하여 37℃, 5% CO2incubator에서 배양하였고 Ca2+ /Mg2+ free phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)로 각 세포의 단층을 깨끗이 씻어낸 후 계대배양을 실시하였고, 배지는 매일 교환하였다.
데이터처리
- 본 연구의 모든 실험값은 3회 이상 반복 실시한 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 통계는 SPSS package program을 이용하였다.
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 p < 0.05의 유의수준에서 Ducan’s multiple range test로 유의적 차이를 검증하였다.
이론/모형
- 아질산염 소거능 측정은 Gray와 Dugan의 (Gray and Dugan, 1975) 실험방법을 이용하여 먼저, 노루궁뎅이 버섯 추출물과 standard인 ascorbic acid을 각각의 농도 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖로 sample을 제조하고, 1 ㎖의 증류수 대조군을 준비해 준 후 여기에 각각 1 ㎖ 에 1 mM의 nitrite sodium을 넣고 혼합해 준 뒤 8 ㎖ 의 0.2 M citrate buffer (pH 3.0)를 넣고 혼합한다. 그 후, 37℃에서 1시간 동안 incubation한 후에 혼합물 중 1 ㎖ 를 다른 시료에 옮긴 뒤 2% acetic acid 2 ㎖ 와 griess reagent를 0.
- 총 페놀성 화합물 함량을 측정하기 위해 Folin-Ciocalteu’s 방법을 이용하였다 (Wang et al., 1994).
- 노루궁뎅이 버섯 추출물의 총 플라보노이드 화합물 함량의 측정은 Nieva 등 (Nieva et al., 2000)의 방법으로 측정되었다. 우선 catechin reagent을 1 ㎎/㎖ 로 용해한 용액을 0.
- 리놀레산 산화 저해 활성 측정은 Debnath 등의 방법 (Debnath et al., 2012)을 사용하여 측정하였다. 최저 농도 0.
- SOD 유사 활성 측정은 Marklund의 방법 (Marklund and Marklund, 1975)에 따라 측정하였다. 노루궁뎅이 버섯 추출물과 standard인 ascorbic acid을 0.
- 추출물의 세포독성은 3-3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)를 이용한 방법에 의해 측정하였다. 배양된 RAW 264.
성능/효과
- 노루궁뎅이 버섯 추출물의 페놀 및 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 Table 1과 같다. 노루궁뎅이 버섯 추출물의 페놀 함량은 30.06 ㎎/100 g, 플라보노이드 함량은 33.86 ㎎/100 g로 확인되었다.
- 62%의 소거 활성을 보였다. 이와 비교적으로 합성 항산화제인 BHT는 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 에서 각각 74.74%, 95,69%, 96.08%, 96.71%, 95.94%를 보임으로서 노루궁뎅이 버섯은 BHT 보다는 낮은 소거 활성을 보이나 전체적 농도로 보았을 때 60% 이상의 DPPH 라디칼 소거활성을 보이기 때문에 DPPH 라디칼에 대한 높은 전자공여능을 가지고 있는 것으로 사료된다.
- , 2012). 노루궁뎅이 버섯의 농도가 증가함에 따라 환원력이 증가하는 경향을 보이나 standard로 사용된 물질인 ascorbic acid나 BHT보다는 낮은 결과를 보여 노루궁뎅이 버섯이 환원력에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.
- , 2000). 노루궁뎅이 버섯의 아질산염 소거능은 Fig. 1의 C와 같으며, 결과를 보면 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 에서 각각 19.33%, 23.65%, 39.67%, 67.47%, 101.34%의 저해율을 보였으며, standard로 쓰인 ascorbic acid는 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 에서 각각 15.11%, 25.13%, 37.57%, 55.15%, 99.47%의 저해율을 나타냈는데, 노루궁뎅이 버섯이 Ascorbic acid 이상의 소거능을 보였다. 이때 노루궁뎅이 버섯은 standard 물질과 같이 농도 의존적으로 높은 저해율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- ABTS 라디칼 소거활성은 산화 유도제인 potassium persulfate와 반응에 의해 형성된 ABTS 양이온이 시료 중의 항산화 물질에 의해 제거될 때 일어나는 탈색반응을 이용하여 물질의 항산화 능력을 측정하는 방법이다 (Myung and Hwang, 2008). 노루궁뎅이 버섯의 ABTS 라디칼 소거능의 결과는 Fig. 1의 D와 같으며, 노루궁뎅이 버섯의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거능 또한 증가하였다. 0.
- 3에 나타냈다. 즉, superoxide의 반응성을 억제하며, 노화와도 관계가 있는 SOD 유사활성능을 pyrogallol에 대한 자동산화 반응을 이용하여 노루궁뎅이 버섯을 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 의 농도에서 측정한 결과, 각각 44.38%, 54.71%, 77.01%, 114.42%, 175.46%으로 나타났으며 standard인 ascorbic acid는 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 에서 각각 43.11%, 52.42%, 70.60%, 97.91%, 100.28%을 나타내는 것으로 보아 노루궁뎅이 버섯이 높은 SOD 유사활성능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
- 노루궁뎅이 버섯 추출물을 농도별로 처리시 세포 생존율은 증가하였다. LPS군에 서는 세포수가 감소하였으며, 추출물의 경우에는 높은 세포 생존율을 나타냄으로서 노루궁뎅이 버섯 열수 추출물에서 항염증 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
- 1의 D와 같으며, 노루궁뎅이 버섯의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거능 또한 증가하였다. 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 에서 각각 29.13%, 47.63%, 69.82%, 99.48%, 101.49%의 소거활성을 보였으며 이때 standard 물질로 쓰인 ascorbic acid는 0.1, 0.5, 1, 2, 3 ㎎/㎖ 에서 각각 100.44%, 99.97%, 99.29%, 99.16%, 100.95%의 소거활성을 보임으로써 높은 소거 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 불포화유리지방산의 일종인 Linoleic acid에 대한 노루궁뎅이 버섯의 산화 억제 활성 (oxidation inhibition)을 측정하였으며, 항산화제로 널리 쓰이는 ascorbic acid의 산화 억제 활성을 함께 비교하였다. linoleic acid 산화 억제능의 결과는 Fig. 2와 같으며, 노루궁뎅이 버섯은 시간이 증가함에 따라 linoleic acid 산화 억제능 또한 증가하였다. 특히 4일째에 노루궁뎅이 버섯은 85% 억제능을, standard인 ascorbic acid는 96%의 억제능으로 제일 높은 값을 나타내었고 5일째부터 감소하는 경향을 나타냈다.
- 2와 같으며, 노루궁뎅이 버섯은 시간이 증가함에 따라 linoleic acid 산화 억제능 또한 증가하였다. 특히 4일째에 노루궁뎅이 버섯은 85% 억제능을, standard인 ascorbic acid는 96%의 억제능으로 제일 높은 값을 나타내었고 5일째부터 감소하는 경향을 나타냈다.
- 따라서 노루궁뎅이 버섯 열수 추출물은 환원력에는 크게 영향을 미치는 않는 것으로 판단되며, 페놀과 플라보노이드 함량은 낮았지만 DPPH 라디칼 소거능, 아질산염 소거능, ABTS 라디칼 소거능, superoxide dismutase 유사 활성에서는 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 리놀레산 산화 저해 활성에 있어서 standard 물질인 ascorbic acid와 유사한 값을 나타내어 매우 우수한 항산화 활성을 가진 물질로 사료된다. 한편, MTT assay 결과에서 LPS로 유도된 RAW 264.
후속연구
- 따라서 노루궁뎅이 버섯 열수 추출물은 환원력에는 크게 영향을 미치는 않는 것으로 판단되며, 페놀과 플라보노이드 함량은 낮았지만 DPPH 라디칼 소거능, 아질산염 소거능, ABTS 라디칼 소거능, superoxide dismutase 유사 활성에서는 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 리놀레산 산화 저해 활성에 있어서 standard 물질인 ascorbic acid와 유사한 값을 나타내어 매우 우수한 항산화 활성을 가진 물질로 사료된다. 한편, MTT assay 결과에서 LPS로 유도된 RAW 264.7세포는 높은 세포 생존율을 나타냄으로써 노루궁뎅이 버섯 열수 추출물은 낮은 독성을 갖는 항염증 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되며 이와 같은 실험을 감안하여 노루궁뎅이 버섯 추출물의 경우 마이크로웨이브 추출공정 최적화 (Lee et el., 2007)와 같은 다각도의 실험이 추가적으로 요구되며 열수 추출물뿐만 아니라, 추출물의 분획물 등에서의 추가적인 활성 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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