[국내논문]대장균 세포 내 다양한 외부 스트레스에 대한 DPS 단백질의 생리적 기능 Physiological Function of a DNA-Binding Protein from Starved Cells in Combating Diverse External Stresses in Escherichia coli원문보기
대장균에서 DNA 결합 단백질로 확인된 DNA-binding Protein from Staved cells (DSP)는 DNA를 보호하는 중요한 기능을 한다는 것을 보여주었다. 이 연구의 목표는 야생형 대장균과 dps 유전자 결손 대장균(${\Delta}dps$ E.coli)의 특성 비교를 통해 여러 종류의 스트레스에 대해 대장균에서 DPS의 기능적 역할을 설명하는 것이다. 다양한 스트레스 상태에서 자외선 흡광도계(UV-spectrophotometer)를 이용하여 야생형 대장균과 dps 유전자 결손 대장균의 세포성장을 측정하였으며, 각각의 대장균 세포 성장 속도를 비교함으로써 우리는 대장균에 존재하는 DPS 단백질의 기능적 역할을 확인하였다. 야생형 대장균에 비해 dps 유전자 결손 대장균은 영양분 결핍, 산성화, 열충격, 다양한 활성산소종 스트레스들에 민감한 현상을 나타내었으며, 이것은 DPS가 다양한 극단적인 스트레스에 중요한 기능을 한다는 것을 제안하였다. 결론적으로 대장균의 DPS는 다양한 환경적인 스트레스로부터 DNA와 강하게 결합하여 유지함으로써 세포를 보호하고 세포성장에 결정적인 기능을 한다는 것을 증명하였다.
대장균에서 DNA 결합 단백질로 확인된 DNA-binding Protein from Staved cells (DSP)는 DNA를 보호하는 중요한 기능을 한다는 것을 보여주었다. 이 연구의 목표는 야생형 대장균과 dps 유전자 결손 대장균(${\Delta}dps$ E.coli)의 특성 비교를 통해 여러 종류의 스트레스에 대해 대장균에서 DPS의 기능적 역할을 설명하는 것이다. 다양한 스트레스 상태에서 자외선 흡광도계(UV-spectrophotometer)를 이용하여 야생형 대장균과 dps 유전자 결손 대장균의 세포성장을 측정하였으며, 각각의 대장균 세포 성장 속도를 비교함으로써 우리는 대장균에 존재하는 DPS 단백질의 기능적 역할을 확인하였다. 야생형 대장균에 비해 dps 유전자 결손 대장균은 영양분 결핍, 산성화, 열충격, 다양한 활성산소종 스트레스들에 민감한 현상을 나타내었으며, 이것은 DPS가 다양한 극단적인 스트레스에 중요한 기능을 한다는 것을 제안하였다. 결론적으로 대장균의 DPS는 다양한 환경적인 스트레스로부터 DNA와 강하게 결합하여 유지함으로써 세포를 보호하고 세포성장에 결정적인 기능을 한다는 것을 증명하였다.
The DNA-binding protein from starved cells (DPS), originally identified as a DNA binding protein in Escherichia coli, is known to play an important role in DNA protection. The aim of this study was to evaluate the functional roles of DPS in E. coli against various kinds of external stresses by compa...
The DNA-binding protein from starved cells (DPS), originally identified as a DNA binding protein in Escherichia coli, is known to play an important role in DNA protection. The aim of this study was to evaluate the functional roles of DPS in E. coli against various kinds of external stresses by comparing the properties of wild-type E. coli cells and dps knockout mutant E. coli (${\Delta}dps$) cells. Under various stress conditions, we measured the cell growth of the wild-type E. coli and the dps knockout mutant E. coli (${\Delta}dps$) cells using a UV spectrophotometer. The growth rate of the cells was compared to investigate the functional roles of the DPS protein in E. coli. In comparison to the properties of the wild-type E. coli cells, the dps knockout mutant E. coli (${\Delta}dps$) cells showed highly sensitive phenotypes under various stress conditions, such as heat shock, acidic pH, nutrient deficiency, and different concentrations of reactive oxygen species (ROS), suggesting that DPS plays key roles in E. coli in combating diverse external stresses. The DPS DNA-binding protein in E. coli plays crucial roles in bacterial cell growth and in the protection of the cells from environmental stresses by tightly binding and preserving their DNA molecules.
The DNA-binding protein from starved cells (DPS), originally identified as a DNA binding protein in Escherichia coli, is known to play an important role in DNA protection. The aim of this study was to evaluate the functional roles of DPS in E. coli against various kinds of external stresses by comparing the properties of wild-type E. coli cells and dps knockout mutant E. coli (${\Delta}dps$) cells. Under various stress conditions, we measured the cell growth of the wild-type E. coli and the dps knockout mutant E. coli (${\Delta}dps$) cells using a UV spectrophotometer. The growth rate of the cells was compared to investigate the functional roles of the DPS protein in E. coli. In comparison to the properties of the wild-type E. coli cells, the dps knockout mutant E. coli (${\Delta}dps$) cells showed highly sensitive phenotypes under various stress conditions, such as heat shock, acidic pH, nutrient deficiency, and different concentrations of reactive oxygen species (ROS), suggesting that DPS plays key roles in E. coli in combating diverse external stresses. The DPS DNA-binding protein in E. coli plays crucial roles in bacterial cell growth and in the protection of the cells from environmental stresses by tightly binding and preserving their DNA molecules.
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문제 정의
이러한 DPS의 구조적 특성이나 DNA와의 결합형태, 그리고 DPS와 DNA와의 결합에 작용하는 화학구조나 잔기 등의 형태적 특성과는 달리, DPS 단백질의 생체 내 역할과 특히 외부의 환경적 스트레스가 왔을 때 이 단백질이 어떠한 기능을 수행하는지에 대한 연구는 거의 이루어지지 않은 상태이다. 따라서, 본 연구에서는 다양한 외부의 환경적 스트레스에 대하여 DPS 단백질의 생체 내 기능이 무엇인지, 그리고 대장균의 생육에 DPS 단백질이 어떠한 역할을 수행하는 지에 대한 연구를 수행하였다. 이러한 연구를 위하여 DPS 단백질을 코딩하는 dps 유전자를 대장균에서 제거한 돌연변이 대장균을 제조하고 이 변이 대장균의 특성을 정상적인 대장균(wild type E.
따라서, 본 연구에서는 다양한 외부의 환경적 스트레스에 대하여 DPS 단백질의 생체 내 기능이 무엇인지, 그리고 대장균의 생육에 DPS 단백질이 어떠한 역할을 수행하는 지에 대한 연구를 수행하였다. 이러한 연구를 위하여 DPS 단백질을 코딩하는 dps 유전자를 대장균에서 제거한 돌연변이 대장균을 제조하고 이 변이 대장균의 특성을 정상적인 대장균(wild type E. coli)과 비교하며 생육 및 성장속도 등을 관찰하여 보았다. 이러한 실험을 통하여 대장균에 존재하는 DPS는 산화적인 스트레스, 높은 압력, 자외선과 감마선 노출, 과도한 금속성 물질에 대한 노출 등과 같은 다양한 스트레스에 대하여 강력한 보호기능을 수행함을 관찰함으로서, 하등생명체의 유전물질인 DNA 물질보호는 대장균의 생육과 보존에 결정적인 역할을 수행함을 알 수 있었다.
coli 세포를 각각 500 μl 접종하고 45℃로 예열된 수조에서 배양하며 광학분광계를 사용하여 600 nm에서의 세포 흡광도를 측정하였다. 본 실험을 통하여 열 충격에 대한 대장균의 생육에 있어서 DPS 단백질의 유무가 나타내는 영향을 관찰할 수 있었다.
대장균 세포 내에서 유전물질인 DNA와 결합하는 DPS 단백질의 생체 내 기능을 규명하고자 하였다. 이 단백질을 코딩하는 유전자를 여러 종의 bacteria에서 Clustal W 소프트웨어를 이용하여 조사해 본 결과, Fig.
대장균 세포 내에서 DNA와 결합하여 DNA-DPS 결합형태를 유지하는 DPS 단백질이 대장균의 생육에 미치는 영향을 관찰하여 보았다. 이 실험을 수행하기 위하여 야생형 대장균과 dps 유전자의 결손이 확인된 △dps 대장균 균주를 사용하였다.
특히 환경스트레스에서 세포 보호에 연관되어 DPS 단백질이 중요한 기능을 수행한다는 사실[2, 14, 22, 28]과 대장균 생장의 증식기 동안에 세포를 보호하는 기능을 수행한다는 사실도 보고되었다[19]. 따라서 이러한 외부의 환경적 스트레스에 대한 DPS 단백질의 기능에 대한 보고들을 바탕으로, 본 실험에서는 생체 내산화스트레스를 유발하는 활성산소종의 일종인 과산화수소를 배지에 첨가한 다음, 야생형 대장균과 △dps E.coli 돌연변이 균주를 배양하며 세포 내 DPS단백질의 기능을 관찰하여 보았다. 과산화수소를 처리한 후 대장균 세포의 생장속도와 생장률을 측정하였다.
즉 과도한 양의 철은 산소의 존재 하에 Fenton 반응(Fenton reaction: Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + ●OH)을 거쳐 생물체의 생육에 매우 해로운 hydroxyl radical 생산을 유발하게 된다. 따라서, 대장균의 생육과정에서 DPS 단백질의 존재 유무가 Fenton 반응에 의한 산화스트레스에 대한 저항성을 가질 수 있는지를 실험하여 보았다(Fig. 5). 야생형 대장균과 △dps E.
제안 방법
세포 내부의 DNA를 직접 이용하여 유전자 증폭과정(PCR)을 수행하기 위하여 야생형 대장균(WT E. coli)와 dps 유전자가 제거된 대장균(△dps E. coli) 세포 5 μl를 2차수 45 μl에 희석시킨 다음, 끓는 물에서 5분간 끓임으로써 세포를 파괴하고 세포내부의 DNA를 용출시키도록 한다.
M9 배지(CaCl2 0.015 g/l, Na2HPO4 6 g/l, KH2PO4 3 g/l, NaCl 0.5 g/l, NH4Cl 1 g/l, MgSO4 0.5 g/l, Glucose 2.0 g/l 포함) 35 ml에 야생형 대장균과 △dps E.coli 세포 500 μl를 최소배지 환경하에서 배양하며 광학분광계(photo-spectrometer)를 이용하여 세포의 흡광도를 600 nm에서 한 시간마다 측정하여 48시간 동안 세포생장을 관찰하였다.
coli) 세포 5 μl를 2차수 45 μl에 희석시킨 다음, 끓는 물에서 5분간 끓임으로써 세포를 파괴하고 세포내부의 DNA를 용출시키도록 한다. 유전자 증폭과정의 실험을 위하여 유전자 증폭용 프라이머(primer)는 보고된 dps 유전자 서열에 근거하여 특이적으로 설계하였다. dps 유전자(504 bp)의 특이적 프라이머의 염기서열 정보는 다음과 같다.
LB 배지(NaCl 0.35 g/l, Tryptone 0.35 g/l, Yeast extract 0.175 g/) 35 ml에 야생형 대장균과 △dps E.coli 세포를 각각 500 μl 접종하고 산화적 스트레스를 유발하는 물질인 과산화수소의 농도를 0.5 mM, 1 mM로 첨가하여 세포의 생장 환경에 따른 세포의 성장속도를 관찰하였다.
배지의 pH 5.0를 달리한 조건으로 만든 LB 배지 35 ml에 야생형 대장균과 △dps E.coli 세포를 각각 500 μl 접종하였다.
LB 배지 35 ml에 야생형 대장균과 △dps E.coli 세포를 각각 500 μl 접종하고 Fenton 반응을 유도하는 물질인 FeCl2을 농도를 달리한 배양조건에서 대장균 세포의 생장속도를 측정하였다.
LB 배지 35 ml에 야생형 대장균과 △dps E.coli 세포를 각각 500 μl 접종하고 45℃로 예열된 수조에서 배양하며 광학분광계를 사용하여 600 nm에서의 세포 흡광도를 측정하였다.
5 mM, 1 mM로 첨가하여 세포의 생장 환경에 따른 세포의 성장속도를 관찰하였다. 용액의 세포는 37℃에서 배양하며 광학분광계를 이용하여 흡광도 600 nm에서 한시간마다 측정하여 48시간 동안 세포생장을 관찰하며 세포성장에 대한 산화적 스트레스의 영향을 관찰하였다.
coli 세포를 각각 500 μl 접종하고 Fenton 반응을 유도하는 물질인 FeCl2을 농도를 달리한 배양조건에서 대장균 세포의 생장속도를 측정하였다. 세포는 37℃에서 배양하면서 세포성장을 광학분광계를 이용하여 흡광도 600 nm에서 세포성장을 한 시간마다 측정하여 7시간 동안 세포생장을 관찰하였다. 세포성장 속도의 변화를 관찰함으로써 산화스트레스를 유발하는 중금속의 존재가 세포성장에 주는 정도를 관찰하고 특히 DPS단백질의 영향을 측정할 수 있었다.
coli 세포를 각각 500 μl 접종하였다. 세포는 37℃에서 배양하면서 용액의 세포는 37℃에서 배양하며 광학분광계를 이용하여 흡광도 600 nm에서 세포성장을 한 시간마다 측정하여7시간 동안 세포생장을 관찰하였다. 세포성장 속도의 변화로 배지내의 수 pH가 세포의 성장에 미치는 영향을 관찰할 수 있으며, 특히 DPS단백질의 영향을 측정할 수 있었다.
coli 균주를 분양 받았다. 분양 받은 돌연변이 대장균 세포를 실제로 dps 유전자가 결손 된 대장균인지의 여부를 확인하기 위하여 세포 내 유전자 증폭(Colony Polymerase chain reaction, PCR) 실험을 수행하였다. 먼저 야생형 대장균과 △dps E.
분양 받은 돌연변이 대장균 세포를 실제로 dps 유전자가 결손 된 대장균인지의 여부를 확인하기 위하여 세포 내 유전자 증폭(Colony Polymerase chain reaction, PCR) 실험을 수행하였다. 먼저 야생형 대장균과 △dps E.coli 균주 세포를 이용하여 재료 및 방법에서 설명한 것과 같이 각각의 대장균 균주 세포를 끓는 물에서 5분간 끓임으로써 세포를 파괴하고 세포내부의 DNA를 용출시키도록 하였다. 그리고 용출된 DNA를 주형 가닥으로 하여 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 dps유전자를 유전자 증폭 실험 방법으로 증폭시켰으며, 증폭된 유전자를 이용하여 유전자의 크기, 이동속도 등을 0.
coli 균주 세포를 이용하여 재료 및 방법에서 설명한 것과 같이 각각의 대장균 균주 세포를 끓는 물에서 5분간 끓임으로써 세포를 파괴하고 세포내부의 DNA를 용출시키도록 하였다. 그리고 용출된 DNA를 주형 가닥으로 하여 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 dps유전자를 유전자 증폭 실험 방법으로 증폭시켰으며, 증폭된 유전자를 이용하여 유전자의 크기, 이동속도 등을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동방법으로 확인하였다. 그 결과, 야생형 대장균에서 용출된DNA를 주형 가닥으로 사용하여 증폭한 유전자에는 504 bp의 dps 유전자가 존재한다는 것을 확인하였다.
2). 결국, △dps E.coli 균주에는 dps 유전자가 결손 되었다는 사실을 확인할 수 있었고, 이 균주의 특성을 야생형 대장균의 특성과 비교함으로써 대장균 내에 존재하는 DPS 단백질의 생체 내 기능을 규명하는 실험들을 수행하였다.
이 실험을 수행하기 위하여 야생형 대장균과 dps 유전자의 결손이 확인된 △dps 대장균 균주를 사용하였다. 이들 균주가 대장균이 살아가는 데 요구되는 영양분의 결핍상태에서 DPS 단백질 역할을 규명하기 위하여 최소한의 영양분만을 함유한 M9 최소배지[21]를 사용하여 대장균을 배양하며 성장속도 변화를 관찰하였다. 이와 같은 영양 부족 환경에서는 미생물의 생육활동에 필요한 대사활동 수행을 위한 영양분이 부족하기 때문에 야생형 대장균의 경우에도 정상적인 세포 생장을 하기 힘들다는 것을 확인할 수 있었다.
coli 돌연변이 균주를 배양하며 세포 내 DPS단백질의 기능을 관찰하여 보았다. 과산화수소를 처리한 후 대장균 세포의 생장속도와 생장률을 측정하였다. Fig.
이러한 적정온도를 벗어날 경우, 생물체는 다양한 생체방어 시스템을 구동하여 생존할 수 있도록 노력하지만 이러한 범위를 넘어서면 살지 못하고 죽어가게 된다. 따라서 대장균 세포 내에서 환경적 스트레스를 극복하는 데 중요한 기능을 한다고 보고 된 DPS 단백질이 과산화수소(0.5 mM)가 존재하는 상태에서 고온을 처리한 열 충격 스트레스에 대해서 방어기능을 수행하는 지를 실험하였다(Fig. 6). Fig.
대상 데이터
본 실험에 사용한 dps knock-out 대장균(△dps E.coli)은 유전자원센터(genetic stock center)에서 주문, 구입하였다. △dps E.
유전자 증폭을 위한 Colony PCR 실험을 위한 FIRE Tag DNA Polymerase 효소는 Solid BioDyne 회사로부터 구입하여 사용하였다.
1과 같이 DPS 단백질들 간에 매우 보존된 아미노산 서열을 가지고 있음으로써 진화적으로 잘 보존되며 유전되고 있음을 알 수 있다. 대장균 세포 내에서 DPS의 기능을 규명하기 위한 실험을 수행하기 위하여 dps knockout 세포인 △dps E.coli 균주를 분양 받았다. 분양 받은 돌연변이 대장균 세포를 실제로 dps 유전자가 결손 된 대장균인지의 여부를 확인하기 위하여 세포 내 유전자 증폭(Colony Polymerase chain reaction, PCR) 실험을 수행하였다.
대장균 세포 내에서 DNA와 결합하여 DNA-DPS 결합형태를 유지하는 DPS 단백질이 대장균의 생육에 미치는 영향을 관찰하여 보았다. 이 실험을 수행하기 위하여 야생형 대장균과 dps 유전자의 결손이 확인된 △dps 대장균 균주를 사용하였다. 이들 균주가 대장균이 살아가는 데 요구되는 영양분의 결핍상태에서 DPS 단백질 역할을 규명하기 위하여 최소한의 영양분만을 함유한 M9 최소배지[21]를 사용하여 대장균을 배양하며 성장속도 변화를 관찰하였다.
성능/효과
coli)과 비교하며 생육 및 성장속도 등을 관찰하여 보았다. 이러한 실험을 통하여 대장균에 존재하는 DPS는 산화적인 스트레스, 높은 압력, 자외선과 감마선 노출, 과도한 금속성 물질에 대한 노출 등과 같은 다양한 스트레스에 대하여 강력한 보호기능을 수행함을 관찰함으로서, 하등생명체의 유전물질인 DNA 물질보호는 대장균의 생육과 보존에 결정적인 역할을 수행함을 알 수 있었다.
세포는 37℃에서 배양하면서 세포성장을 광학분광계를 이용하여 흡광도 600 nm에서 세포성장을 한 시간마다 측정하여 7시간 동안 세포생장을 관찰하였다. 세포성장 속도의 변화를 관찰함으로써 산화스트레스를 유발하는 중금속의 존재가 세포성장에 주는 정도를 관찰하고 특히 DPS단백질의 영향을 측정할 수 있었다.
세포는 37℃에서 배양하면서 용액의 세포는 37℃에서 배양하며 광학분광계를 이용하여 흡광도 600 nm에서 세포성장을 한 시간마다 측정하여7시간 동안 세포생장을 관찰하였다. 세포성장 속도의 변화로 배지내의 수 pH가 세포의 성장에 미치는 영향을 관찰할 수 있으며, 특히 DPS단백질의 영향을 측정할 수 있었다.
대장균 세포 내에서 유전물질인 DNA와 결합하는 DPS 단백질의 생체 내 기능을 규명하고자 하였다. 이 단백질을 코딩하는 유전자를 여러 종의 bacteria에서 Clustal W 소프트웨어를 이용하여 조사해 본 결과, Fig. 1과 같이 DPS 단백질들 간에 매우 보존된 아미노산 서열을 가지고 있음으로써 진화적으로 잘 보존되며 유전되고 있음을 알 수 있다. 대장균 세포 내에서 DPS의 기능을 규명하기 위한 실험을 수행하기 위하여 dps knockout 세포인 △dps E.
8% 아가로스 겔에서 전기영동방법으로 확인하였다. 그 결과, 야생형 대장균에서 용출된DNA를 주형 가닥으로 사용하여 증폭한 유전자에는 504 bp의 dps 유전자가 존재한다는 것을 확인하였다. 하지만 △dps E.
그 결과, 야생형 대장균에서 용출된DNA를 주형 가닥으로 사용하여 증폭한 유전자에는 504 bp의 dps 유전자가 존재한다는 것을 확인하였다. 하지만 △dps E.coli 균주로부터 용출된 DNA를 주형 가닥으로 사용하여 증폭한 유전자에서는 dps 유전자에 해당하는 크기의 유전자가 증폭되지 않았다는 사실을 아가로스 전기영동 방법으로 확인하였다(Fig. 2). 결국, △dps E.
이들 균주가 대장균이 살아가는 데 요구되는 영양분의 결핍상태에서 DPS 단백질 역할을 규명하기 위하여 최소한의 영양분만을 함유한 M9 최소배지[21]를 사용하여 대장균을 배양하며 성장속도 변화를 관찰하였다. 이와 같은 영양 부족 환경에서는 미생물의 생육활동에 필요한 대사활동 수행을 위한 영양분이 부족하기 때문에 야생형 대장균의 경우에도 정상적인 세포 생장을 하기 힘들다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 영양분이 충분한 정상배지에서의 생육속도(Fig.
이와 같은 영양 부족 환경에서는 미생물의 생육활동에 필요한 대사활동 수행을 위한 영양분이 부족하기 때문에 야생형 대장균의 경우에도 정상적인 세포 생장을 하기 힘들다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 영양분이 충분한 정상배지에서의 생육속도(Fig. 3A)보다 영양분 결핍의 M9 배지에서는 대장균 성장속도 저하가 관찰되었으며, 특히 dps 유전자 결손 대장균 세포의 생장 곡선은 야생형 대장균의 성장속도보다 뚜렷하게 낮은 성장속도를 보임을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 이러한 결과는 미생물의 생육속도를 비교한 막대그래프(Fig.
3C)에서 보다 분명하게 확인할 수 있었다. 본 실험의 결과, 대장균 세포의 DNA와 결합하여 DPS단백질은 미생물의 생육에 필요한 영양 결핍상태에서 유전자 보호라는 기능을 통하여 영양분 부족에 의한 스트레스로부터 대장균을 보호하는 중요한 기능을 수행함을 알 수 있었다.
하지만, 미생물 배지에 1 mM의 과산화수소를 첨가한 배양조건에서는 야생형 대장균도 약간의 생육속도 저해가 나타남을 관찰할 수 있었다. 특히 중요한 점은, dps유전자가 결손된 △dps E.coli 돌연변이 균주는 과산화수소의 존재 하에서 대장균의 생육속도가 심각하게 저해됨을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). 이러한 결과는 대장균 생육속도를 비교한 막대그래프(Fig.
4C)에서 확연히 알 수 있었다. 이러한 산화스트레스 물질의 존재 하에 대장균의 생육속도에 미치는 영향을 관찰한 실험결과로부터, 대장균 세포 내 유전자와 강한 결합을 하는 DPS 단백질이 산화적 스트레스 동안에 대장균 세포를 보호하는 매우 중요한 기능을 한다는 사실을 확인함으로서, DPS 단백질이 대장균의 생육에 필수적 기능을 수행함을 알 수 있었다.
5). 야생형 대장균과 △dps E.coli 돌연변이 균주의 배양액에 1 mM FeCl2를 처리하며 세포의 성장속도를 측정하여 본 결과, 1 mM FeCl2를 처리한 배지에서 △dps E.coli 돌연변이 균주는 야생형 대장균에 비하여 생육속도가 현저히 저하되는 것을 관찰함으로써 DPS 단백질이 Fenton 반응에 의한 산화적 스트레스로부터 대장균을 잘 보호하고 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
6). Fig. 6A에서 정상적인 성장온도인 37℃에서 야생형 대장균이나 dps유전자가 결손된 △dps E.coli 돌연변이 균주 모두 정상적인 성장 속도를 나타내는 것을 확인하였다. 하지만, 강력한 산화 스트레스를 유발하는 과산화수소(0.
coli 돌연변이 균주 모두 정상적인 성장 속도를 나타내는 것을 확인하였다. 하지만, 강력한 산화 스트레스를 유발하는 과산화수소(0.5 mM)와 고온(45℃)의 열 충격을 동시에 처리하여 대장균을 배양하였을 때 dps유전자가 결손된 △dps E.coli 돌연변이 균주의 생육은 야생형 대장균에 비해 훨씬 심한 영향을 받음으로써 성장속도 저하가 약 80% 이상 저해됨을 확인함 할 수 있었다. 이러한 결과를 통해서 DPS 단백질은 산화적 스트레스에 의한 대장균 보호기능뿐만 아니라 산화스트레스와 고온의 열 충격을 동시에 처리한 강력한 환경스트레스 상태에서 대단히 중요한 기능을 수행함을 관찰할 수 있었다.
coli 돌연변이 균주의 생육은 야생형 대장균에 비해 훨씬 심한 영향을 받음으로써 성장속도 저하가 약 80% 이상 저해됨을 확인함 할 수 있었다. 이러한 결과를 통해서 DPS 단백질은 산화적 스트레스에 의한 대장균 보호기능뿐만 아니라 산화스트레스와 고온의 열 충격을 동시에 처리한 강력한 환경스트레스 상태에서 대단히 중요한 기능을 수행함을 관찰할 수 있었다.
따라서, 하등생물체인 대장균이나 다른 bacteria는 산성에 노출된 세포가 세포막의 구성을 바꾸는 능력, 선천적인 세포질의 pH 의 효소에 의한 항상성 조절 그리고 생체 거대분자들의 피해에 대한 복구 혹은 예방을 하는 세 가지 주요한 방어전략을 가진다는 사실이 알려져 있다[3, 5, 7, 15, 16]. 정상적인 pH 7.0의 중성상태 배지에서는 야생형 대장균이나 dps유전자가 결손된 △dps E.coli 돌연변이 대장균 균주 모두 잘 성장함을 관찰할 수 있었다. 하지만, 정상보다 낮은 pH조건인 pH 5인 배지에서 야생형 대장균은 비교적 잘 성장하고 있음을 알 수 있었으나, dps유전자가 결손된 △dps E.
coli 돌연변이 대장균 균주 모두 잘 성장함을 관찰할 수 있었다. 하지만, 정상보다 낮은 pH조건인 pH 5인 배지에서 야생형 대장균은 비교적 잘 성장하고 있음을 알 수 있었으나, dps유전자가 결손된 △dps E.coli 돌연변이 균주는 성장속도가 야생형 대장균에 비하여 약 20% 정도 더 많은 저해된 생육상태를 보여주었다(Fig. 7). 이 결과에서 볼 수 있듯이, DNA와 결합하여 복합체를 구성하는 DPS 단백질은 대장균이 성장하는 배지 용액의 낮은 pH조건에서 대장균이 성장하는데 매우 중요한 기능을 수행함을 알 수 있었다.
7). 이 결과에서 볼 수 있듯이, DNA와 결합하여 복합체를 구성하는 DPS 단백질은 대장균이 성장하는 배지 용액의 낮은 pH조건에서 대장균이 성장하는데 매우 중요한 기능을 수행함을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 우리는 DPS 단백질이 DNA와 결합하여 외부의 pH변화에 따른 유전정보 가닥의 파괴를 보호하는 중요한 기능을 수행한다는 것을 규명할 수 있었다.
이 결과에서 볼 수 있듯이, DNA와 결합하여 복합체를 구성하는 DPS 단백질은 대장균이 성장하는 배지 용액의 낮은 pH조건에서 대장균이 성장하는데 매우 중요한 기능을 수행함을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 우리는 DPS 단백질이 DNA와 결합하여 외부의 pH변화에 따른 유전정보 가닥의 파괴를 보호하는 중요한 기능을 수행한다는 것을 규명할 수 있었다.
본 실험을 통해서 대장균은 DPS 단백질 발현을 통하여 다양한 외부의 환경 스트레스에 대해 저항성을 가지게 된다는 것을 규명하였다. 본 실험의 결과로부터 DPS 단백질은 대장균 세포 내에서 유전물질인 DNA와 강하게 결합하여 외부 환경 스트레스로부터 유전물질의 변화를 보호하게 되고 이를 통하여 미생물의 생육을 원활하게 유지시켜 줄 수 있다는 사실을 확인하였다.
본 실험을 통해서 대장균은 DPS 단백질 발현을 통하여 다양한 외부의 환경 스트레스에 대해 저항성을 가지게 된다는 것을 규명하였다. 본 실험의 결과로부터 DPS 단백질은 대장균 세포 내에서 유전물질인 DNA와 강하게 결합하여 외부 환경 스트레스로부터 유전물질의 변화를 보호하게 되고 이를 통하여 미생물의 생육을 원활하게 유지시켜 줄 수 있다는 사실을 확인하였다. 그리고 이 실험 결과는 DPS의 기능이 세포 내의 유전자와 결합하여 생명체를 보호하는데 주된 역할을 수행한다는 선행결과와 잘 일치함을 알 수 있었다[4]
대장균 세포내의 유전자와 강한 결합을 하는 DPS 단백질은 영양부족, 산성배지, 활성산소종, 산화스트레스와 열 충격 등의 다양한 환경스트레스 조건 하에서 대장균의 유전물질을 보호함으로서 대장균 세포의 성장과 생육에 중요한 기능을 수행함을 알 수 있었다.
후속연구
현재 보고된 연구들에 의하면 DPS 단백질은 ClpXP와 ClpAP 단백질분해효소들에 의해서 분해가 된다[25]. 하지만 ClpXP에 의한 post-translational 단계에서의 조절과 ClpAP에 의한 translational 단계에서의 조절들에 대한 mechanism에 관여하는 단백질이나 혹은 그 결합이 해체되는 과정 등에 대해서는 아직 더 많은 연구가 필요하다.
우리는 DPS의 뛰어난 생체방어 능력과 산화적 스트레스에 대한 저항성을 활용하여 많은 실생활에 활용할 수 있도록 접목할 수 있을 것으로 판단된다. 지구상에서 살아가는 생물들은 산소에 노출되어 있기에 대사활동을 하게 될 경우, 활성산소종이 생성되고 이로 인한 세포 사멸, 수명감축 등이 유발되는데 이는 각각의 생물들이 스스로 예방하고 복구하는 시스템을 가지고는 있지만 환경 스트레스에 약한 한계가 있기 마련이다.
지구상에서 살아가는 생물들은 산소에 노출되어 있기에 대사활동을 하게 될 경우, 활성산소종이 생성되고 이로 인한 세포 사멸, 수명감축 등이 유발되는데 이는 각각의 생물들이 스스로 예방하고 복구하는 시스템을 가지고는 있지만 환경 스트레스에 약한 한계가 있기 마련이다. 그러므로 DPS를 다른 생물에 도입 할 수 있는 방법을 찾고 안정적으로 기능을 수행할 수 있게 된다면 활성산소종 및 외부의 환경스트레스에 대한 저항성은 생물체의 생육과정에서 커다란 시너지 효과를 기대할 수 있을 것이며 이는 산업적 이용 측면에서 대단히 중요한 의미를 갖는 응용성을 가지게 될 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대장균에 존재하는 DPS는 몇 개의 아미노산으로 구성되었으며, 분자량은 얼마인가?
대장균에 존재하는 DPS는 167개의 아미노산으로 구성되어 있으며 19 kDal의 분자량을 가진다고 보고되었다. DPS는 DNA 결합단백질로서 DNA의 특정한 서열을 구별하지 않고 유전물질과 결합함으로서 매우 안정한 형태의 DNA-단백질 복합체를 형성한다.
DPS의 구조는?
대장균 내 유전물질인 DNA가 DPS와 복합체를 형성하면 유전자 절단효소(DNase)에 대한 저항성을 가지게 된다[1]. DPS의 구조는 지름 ~45 Å 인 Hole을 중심으로 12개의 동일한 subunit가 4면 대칭으로 조립된 shell-like structure를 가지고 있다는 사실이 보고되었다[10]. DPS 단위체(subunit)는 기본적으로 4개의 나선형 입체 구조를 가지고 있고, 이 나선형 구조는 αⅠ, αⅡ, αⅣ, αⅤ로 구성된다.
진핵생물의 histone 단백질은 어떻게 DNA를 보호합니까?
대표적인 예로 진핵 생물은 histone 단백질을 가지고 있는데 이 histone 단백질은 작고, 염기성 성질을 가진다[20]. 이 단백질은 산성 성질을 가지는 DNA와 강하게 결합함으로써 DNA를 nucleosome 형태로 압축하고 nucleus 안에서 외부 스트레스에 대한 보호기능을 수행한다. bacteria는 진핵 세포와 달리 핵이 없으며 DNA가 세포질에 분포하고 있으나 histone 비슷한 특성을 가진 histone 유사 단백질을 여러 종류 가지고 있다.
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