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문제 정의
- 부위별 고들빼기의 생리활성물질 함량과 활성분포 정도를 파악함으로써 식품 외의 기능성 관련 식품소재를 탐색하고 그 이용 가능성을 모색할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 연구는 다양한 기능성을 갖고 있는 노지재배 고들빼기를 대상으로 잎, 줄기, 뿌리, 꽃의 부위별 성분 및 생리활성 차이를 검토하고자 수행하였다.
제안 방법
- 900 uL DPPH 용액(100 uM)과 시료 추출물을 용해한 용액(100 µL)을 혼합하여 상기의 방법으로 측정하여 시료가 첨가하지 않은 DPPH용액의 용출 peak의 면적으로 하였다.
- Folin-Denis방법에 따라 표준물질 chlorogenic acid를 근거로 분석된 고들빼기 부위별 1000 mg kg-1농도의 메탄올 추출물에 대한 총 페놀 함량을 측정하였다. 고들빼기의 총페놀 함량은 꽃에서 가장 높게 나타났고, 그 다음은 잎, 줄기, 뿌리 순으로 나타났다.
- 각 조사항목별 상관관계(p<0.05)를 알아보고자 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디컬 소거능, 아질산염 소거능, 폐암세포주(Calu-6)와 위암세포주(SNU-601)에 대한 세포독성에 있어서 각 항목 양자 간의 상관계수를 도출하여 비교하였다.
- 고들빼기 부위별 메탄올 추출물의 아질산염 소거작용의 측정은 1 mM NaNO2 20 µL에 시료의 추출액 40 µL와 0.1N HCl(pH 1.2) 또는 0.2 M citrate buffer (pH 4.2) 또는 0.2 M citrate buffer (pH 6.0)를 140 µL 사용하여 부피를 200 µL로 맞추었다.
- 고들빼기 부위별 성분함량과 생리활성을 분석하기 위하여 2010년 5월에 순천시 별량면 한 독농가 포장에서 개화기에 이르는 고들빼기 동정은 Lee(1980)의 도감을 이용하여 수행하였으며 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃을 분리ㆍ채취하였다. 채취된 샘플은 세척한 후 초저온(-60℃) 하에서 5일간 냉동ㆍ보관하였다.
- 1 mL를 잘 혼합시켜 37℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 50% methanol 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 naringin (Sigma Co., USA)을 이용하여 표준 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum)와 peniciline G(25 unit/mL) 및 streptomycin(25 µg/mL)를 첨가한 RPMI 1640배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2의 습윤화된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
- 이것을 72시간 동안 배양시킨 후, 5 mg/mL농도로 조제한 MTT 용액을 각 well당 10 µL씩 넣고 세포 배양기에서 4시간 동안 더 배양시킨 후, MTT 용액이 있는 배지를 제거하고 DMSO 150 µL를 첨가하여 30분간 교반하여 각 세포를 용해시켜 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 그 값을 아래와 같이 각 세포의 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 성장율을 환산하였고, 억제정도가 50%일 때의 추출물의 농도를 IC50값으로 나타냈다.
- 종양세포를 3×104 cells/mL의 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate에 90 µL/well씩 분주하고 이것을 37℃, 5% CO2 세포배양기(Forma, Germany)에서 12시간 배양하여 세포를 부착시킨 다음 추출물을 50, 100, 200, 400, 800 µg/mL 농도가 되도록 10 µL씩 첨가하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 암세포주는 모두 인체기원의 암세포주들로서, Korean Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입한 폐암세포주인 Calu-6(ATCC, HTB-56)와 위암 SNU-601을 사용하였다. 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum)와 peniciline G(25 unit/mL) 및 streptomycin(25 µg/mL)를 첨가한 RPMI 1640배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2의 습윤화된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 분석을 실시하였으며 그 결과를 SAS(SAS Institute, 2000)를 이용하여 식물체 부위별 평균치 차이는 LSD(Least Significant Difference)검정을 통해 비교 ․ 분석하였다. 각 조사항목별 상관관계(p<0.
이론/모형
- 1 g에 Lister et al.(1994) 변법에 따라 75% methanol을 가하여 실온에서 하룻밤 동안 추출한 다음 이 검액 1.0 mL를 시험관에 취하고 10 mL의 diethylene glycol을 가하여 잘 혼합하였다. 다시 여기에 1N NaOH 0.
- HPLC에 의해 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl radical) scavenging activity 검정 방법(Blois, 1958)으로서 분석대상이 DPPH 용액의 흡광도(500- 550 nm)와 같은 영역에 있을 경우 HPLC를 이용하여 정량적 분석조건이 가능하다. 900 uL DPPH 용액(100 uM)과 시료용액 100 uL을 혼합한 후 암조건에서 10분 동안 반응시켰다.
- 일반성분 분석 중 조단백질은 Kjeldahl법으로, 조지방 함량은 Soxhlet 추출법으로, 조섬유소는 FiberCap 시스템을 이용한 시료의 조섬유 정량법 (H2SO4-NaOH법)을 이용하였고, 회분 함량은 550℃에서 직접 회화법으로 수행하였다(AOAC, 1984).
- 총 페놀 화합물 함량은 Folin-Denis 방법(Singleton & Rossi, 1965)에 따라 분석하였다.
성능/효과
- 각 기능성 성분과 생리활성 항목간의 상관관계는 r2=0.0001~0.2123으로 매우 낮은 것으로 나타났으나 각 생리활성 항목간의 상관관계는 r2=0.2258~0.8333으로 비교적 높게 나타났다. 그 중에서 DPPH와 폐암 세포주(Calu-6) 활성간에는 r2=0.
- 고들빼기 식물체 부위별 조단백질과 조지방은 꽃, 잎, 줄기 뿌리 순으로 높았고 조섬유와 조회분은 줄기와 뿌리가 꽃과 잎보다 높은 것으로 나타났다. 조단백질 함량은 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 순으로 각각 13.
- 고들빼기에서 DPPH(DPPH radical scavenging activity) 법에 의한 항산화성은 농도와 비례하게 활성이 증가하는 양상을 보였다. 특히 2,500 mg kg-1 메탄올 추출물에서 합성항산화제 Vitamin C와 BHT의 경우 99.
- 고들빼기에서 MTT assay에 의한 세포독성 중 폐암 세포주(CALU-601)에 대한 세포생존율로 나타낸 결과 개화기 때 수확된 식물체 부위별로 볼 때 뿌리, 잎, 꽃, 줄기 순으로 높은 세포독성을 보였다. 특히 뿌리와 잎은 500 mg kg-1에서 각각 12.
- Folin-Denis방법에 따라 표준물질 chlorogenic acid를 근거로 분석된 고들빼기 부위별 1000 mg kg-1농도의 메탄올 추출물에 대한 총 페놀 함량을 측정하였다. 고들빼기의 총페놀 함량은 꽃에서 가장 높게 나타났고, 그 다음은 잎, 줄기, 뿌리 순으로 나타났다. 꽃의 총 페놀 함량은 72.
- 8333으로 비교적 높게 나타났다. 그 중에서 DPPH와 폐암 세포주(Calu-6) 활성간에는 r2=0.8333로 가장 높은 상관관계를 보였고, 그 다음이 폐암 세포주(Calu-6)와 대장암 세포주(HCT-116) 세포 독성간 r2=0.7905, DPPH와 대장암 세포주(HCT-116) 간에는 r2=0.647로 나타났다. 한편 기능성 성분인 총 페놀 함량과 총 플라보노이드간의 상관관계 r2=0.
- 3%로 뿌리가 가장 높고 줄기가 가장 낮은 활성을 보였다. 따라서 50% 항산화 활성을 보이는 IC50값도 뿌리, 잎, 꽃, 줄기 순으로 각각 1,345.6, 1,354.3, 1,740.9, 1,788.4 mg kg-1으로 나타났다(Table 2).
- 90%로 가장 낮은 함량을 보였다(Table 1). 따라서 각 부위별 고들빼기의 일반성분은 영양생장기를 거쳐 생식생장기(개화기)에 이르렀을 때 줄기와 꽃 부위가 분화되면서 그 성분 분포 정도가 다른 것으로 나타났다.
- 7480로 비교적 높게 나타났다(Table 3). 이들 결과는 생리활성물질인 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 그 자체는 생리활성과 연관성이 낮았으나 생리활성인 항산화성과 세포독성간에 연관성이 더 높음을 보여 준 것으로 해석된다.
- 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 순으로 각각 23.3, 21.0, 14.3, 10.6 mg kg-1으로 잎과 꽃이 가장 높았고 뿌리가 가장 낮은 함량을 보였다(Fig. 1-B).
- 고들빼기 식물체 부위별 조단백질과 조지방은 꽃, 잎, 줄기 뿌리 순으로 높았고 조섬유와 조회분은 줄기와 뿌리가 꽃과 잎보다 높은 것으로 나타났다. 조단백질 함량은 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 순으로 각각 13.37, 7.53, 4.78, 3.20%로 나타났고, 조지방은 각각 3.78, 1.44, 1.11, 0.63%로 나타났다.
- 고들빼기에서 DPPH(DPPH radical scavenging activity) 법에 의한 항산화성은 농도와 비례하게 활성이 증가하는 양상을 보였다. 특히 2,500 mg kg-1 메탄올 추출물에서 합성항산화제 Vitamin C와 BHT의 경우 99.7%와 98.6%에 비해 낮은 활성이지만 뿌리, 잎, 꽃, 줄기 순으로 각각 77.1, 74.0, 69.6, 65.3%로 뿌리가 가장 높고 줄기가 가장 낮은 활성을 보였다. 따라서 50% 항산화 활성을 보이는 IC50값도 뿌리, 잎, 꽃, 줄기 순으로 각각 1,345.
- 한편 고들빼기 부위별 추출물에 대한 대장암세포주(HCT116)의 세포생존율로 나타낸 결과 잎, 뿌리, 꽃, 줄기 순으로 높은 세포독성을 보였다. 특히 뿌리와 잎은 1,000 mg kg-1에서 각각 8.8과 7.1%로 10% 이내의 생존율을 보여 높은 세포독성 수준을 보여 주었고, 줄기와 꽃은 각각 44.9와 32.1%를 보여 비교적 낮은 수치를 보였다. 그리고 IC50값은 뿌리, 잎, 꽃, 줄기 순으로 623.
- 고들빼기에서 MTT assay에 의한 세포독성 중 폐암 세포주(CALU-601)에 대한 세포생존율로 나타낸 결과 개화기 때 수확된 식물체 부위별로 볼 때 뿌리, 잎, 꽃, 줄기 순으로 높은 세포독성을 보였다. 특히 뿌리와 잎은 500 mg kg-1에서 각각 12.5와 5.4%의 생존율을 보여 높은 세포독성 수준을 보여 주었고, 줄기와 꽃은 각각 74.3과 42.5%의 세포 생존율을 보여 비교적 낮은 수치를 보였다. 한편, 50% 생존율을 보이는 추출물의 농도인 IC50값은 뿌리, 잎, 꽃, 줄기 순으로 196.
- 한편 고들빼기 부위별 추출물에 대한 대장암세포주(HCT116)의 세포생존율로 나타낸 결과 잎, 뿌리, 꽃, 줄기 순으로 높은 세포독성을 보였다. 특히 뿌리와 잎은 1,000 mg kg-1에서 각각 8.
- 647로 나타났다. 한편 기능성 성분인 총 페놀 함량과 총 플라보노이드간의 상관관계 r2=0.7480로 비교적 높게 나타났다(Table 3). 이들 결과는 생리활성물질인 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 그 자체는 생리활성과 연관성이 낮았으나 생리활성인 항산화성과 세포독성간에 연관성이 더 높음을 보여 준 것으로 해석된다.
- 한편, 아질산염 소거능력(nitrite scavenging activity)은 1,000mg kg-1 농도에서 고들빼기의 줄기는 79.7%로 유의적인 높은 함량을 나타냈고 그 다음이 잎, 꽃, 뿌리 순으로 각각 70.9, 65.5, 64.6%로 뿌리가 가장 낮은 함량을 보였다(Fig. 2).
후속연구
- 따라서 고들빼기 부위별 생리활성물질 함량과 그 활성은 부위별로 차이가 뚜렷하여 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 꽃과 잎에서, 항산화성은 뿌리에서, 항암성은 잎과 뿌리에서 각각 높게 나타난 것으로 보아 부위별 생리활성이 달리함으로써 기능성 꽃차 등과 같은 식품소재로서의 이용성이 확대될 것으로 예상된다. 다만 본 연구는 in vitro시험에 국한된 기초연구로서 앞으로 지표성분 변이, 컬럼분석 및 용매별 분획 등을 통해 보다 세밀한 후속적 연구가 필요하다고 본다.
- 따라서 고들빼기 부위별 생리활성물질 함량과 그 활성은 부위별로 차이가 뚜렷하여 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 꽃과 잎에서, 항산화성은 뿌리에서, 항암성은 잎과 뿌리에서 각각 높게 나타난 것으로 보아 부위별 생리활성이 달리함으로써 기능성 꽃차 등과 같은 식품소재로서의 이용성이 확대될 것으로 예상된다. 다만 본 연구는 in vitro시험에 국한된 기초연구로서 앞으로 지표성분 변이, 컬럼분석 및 용매별 분획 등을 통해 보다 세밀한 후속적 연구가 필요하다고 본다.
- 하지만, 부위별 고들빼기의 생리활성물질 함량과 활성에 관한 연구는 전무한 실정이다. 부위별 고들빼기의 생리활성물질 함량과 활성분포 정도를 파악함으로써 식품 외의 기능성 관련 식품소재를 탐색하고 그 이용 가능성을 모색할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 연구는 다양한 기능성을 갖고 있는 노지재배 고들빼기를 대상으로 잎, 줄기, 뿌리, 꽃의 부위별 성분 및 생리활성 차이를 검토하고자 수행하였다.
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