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문제 정의
- 22) 따라서 본 연구에서는 로바스타틴에 의한 멜라닌 합성 촉진 작용에 미치는 칼슘신호의 역할을 알아보고자 하였다.
- 따라서 다음은 로바스타틴에 의한 멜라닌 합성 촉진 작용에 미치는 기전에 관여하는 cAMP 경로의 역할을 조사하였다. 로바스타틴은 멜라닌을 촉진하는 농도(1~10 µM)에서 cAMP 농도의 변화를 초래하지 않았으나 cAMP 경로를 상향조절하는 양성 대조 물질인 FK(10 µM)에 의해서는 현저한 cAMP 농도의 증가를 보였다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 스타틴 계열의 약물인 로바스타틴을 사용하여 이 약물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 알아보고 그 기전을 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 HMG-CoA 환원 효소 억제제인 로바스타틴이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 알아보고 그 기전을 규명하고자 하였다. 실험결과에서 로바스타틴은 B16 세포에서 농도의존적으로 멜라닌 합성을 증가시켰다.
제안 방법
- B16 세포(7×105)를 0.1 M HCl에 녹여 phosphodiesterase 활성을 억제한 후 상등액을 모아 중화·희석시켜 토끼 다중클론항체를 고정시킨 96 well plate을 사용하여 cAMP conjugate를 첨가하여 세포용해액에 들어 있는 cAMP와 경쟁시켰다.
- B16 세포를 이용하여 로바스타틴이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하였다. 로바스타틴을 처리하고 48시간 동안 배양 후 그 효과를 관찰하였는데 그 이유는 이 시간대에서 대조군, 즉 약물을 가하지 않은 상태에서 분석이 가능한 멜라닌 합성이 이루어지기 때문이다.
- 4)에 세포밀도가 ml당 2×106개가 되도록 현탁시켰다. Fura-2가 봉입된 세포를 형광측정 전까지 25℃에서 90분간 유지시킨 후 교반봉이 들어있는 quartz cuvette에 0.5 ml 세포현탁액을 주입하여 Hitachi F4500 형광분석기를 사용하여 여기파장을 340 및 280 nm에서 반복하게 하고 형광발광을 510 nm에서 측정하였다. 세포내 칼슘농도는 340 : 380 nm 형광비로써 나타내었다.
- cAMP 농도는 cAMP immunoassay kit(Sigma-Aldrich, 미국)을 이용해 측정하였다. B16 세포(7×105)를 0.
- 다음은 로바스타틴에 의한 세포내 칼슘 증가가 어떤 경로를 통해 일어나는 지를 추적하기 위해 1 mM EGTA를 함유하는 칼슘-비포함 용액을 이용하여 세포내 칼슘변화를 관찰하였다. 이 실험 조건하에서는 세포외 칼슘 농도를 효과적으로 감소할 수 있기 때문에 칼슘유입을 차단할 수가 있게 된다.
- 로바스타틴이 세포 독성에 미치는 농도를 조사하여 향후 실험에 사용될 농도 범위를 결정하기 위해서 MTT 분석을 시행하였다. B16 흑색종 세포에 대한 로바스타틴의 세포독성을 측정한 결과, 10 µM 이하의 농도로 처리했을 때 세포생존율은 90% 이상으로 나타났으며, 50 µM을 처리했을 때 생존율이 유의성 있게 저하되었다(Fig.
- 멜라닌 표준품을 이용한 표준 검량선을 이용하여 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌 생성량은 단위세포(104개)에서의멜라닌 생성량으로 비교하였다.
- 여기서 얻은 세포 pellet을 1N NaOH, 10% DMSO 용액 200 µl를 첨가하고 vortex 후 멜라닌을 완전히 녹인 다음 96 well plate에 옮긴 후 ELISA reader(Molecular Device, 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준품을 이용한 표준 검량선을 이용하여 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌 생성량은 단위세포(104개)에서의멜라닌 생성량으로 비교하였다.
- 세포를 Krebs-Ringer 완충액(125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 5 mM NaHCO3, 25 mM HEPES, 6 mM glucose 및 2.5 mM probenecid, pH 7.4)에 세포밀도가 ml당 2×106개가 되도록 현탁시켰다.
- 로바스타틴은 HMG-CoA 환원효소를 저해하여 콜레스테롤의 합성을 억제하는 효과를 가지고 있으므로 그 작용기전에 콜레스테롤 대사의 변화가 연관되어 있을 것으로 생각된다. 이것을 증명하기 위하여 HMG-CoA 환원 효소의 대사물질인 mevalonate, FPP, 또는 GGPP를 첨가하여 로바스타틴에 의한 멜라닌 합성 촉진작용이 상쇄되는지를 확인하였다. 하지만 mevalonate(100 µM), FPP(10 µM), 또는 GGPP(10 µM)의 첨가는 로바스타틴(5 µM)의 효과에 유의한 영향을 끼치지 못했으며, 이 물질 자체도 멜라닌 합성에 유의한 변화를 초래하지 않았다(Fig.
대상 데이터
- B16 흑색종 세포는 서울대학교 한국세포주은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 10% FBS와 penicillin 100 IU/ml와 streptomycin 50 µg/ml을 함유한 DMEM 용액으로 37℃ 로 유지되는 5% CO2 배양기(Forma, 미국)에서 배양하였다.
- Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), Earle's basal salt solution(EBSS), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), mevalonolactone(mevalonate), geranylgeranyl pyrophosphate ammonium salt(GGPP), farnesyl pyrophosphate ammonium salt(FPP), dantrolene, 3,4,5-trimethoxybenzoic acid-8-(diethylamino)-octyl ester(TMB-8), ethylene glycol-bis-(aminoethyl ether)N,N,N',N'-tetraacetic acid(EGTA) 및 각종 용매와 염류는 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입하였고 lovastatin은 WAKO(일본)에서 구입하여 비활성 lactone형을 에탄올에 녹인 후 0.4 M NaOH 에탄올용액에 50℃에서 2 시간 동안 방치한 후 1 M HCl로 pH 7.2로 하여 dihydroxy open acid의 활성형으로 전환하여 농축액(10 mM)을 -20℃에서 보관하였다.
- Fetal bovine serum(FBS)와 penicillin-streptomycin 혼합액은 GIBCO(미국)에서 구입하였으며, 1-(2,5-carboxyoxazol-2-yl6-aminobenzfuran-5-oxyl)-2-(2'-amino-methylphenoxy)-ethaneN,N,N'N'-tetraacetoxylmethyl ester(Fura-2/AM)과 bis-(oaminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid/acetoxymethyl ester(BAPTA/AM)은 Molecular Probes(미국)에서 구입하였다.
- In these experiments mevalonate (100 µM), FPP (10 µM), and GGPP (10 µM) were used as a cholesterol metabolite.
- 구입한 세포는 10% FBS와 penicillin 100 IU/ml와 streptomycin 50 µg/ml을 함유한 DMEM 용액으로 37℃ 로 유지되는 5% CO2 배양기(Forma, 미국)에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균값±SEM으로 표시하고 ANOVA로 분석하며 각각의 유의성 비교는 StudentNewman-Keul's test를 이용하여 실시하였다.
이론/모형
- Cells were incubated with or without each concentration of lovastatin (Lova) for 48 hr. Cell viability assay was done by the MTT staining method. Results are expressed as percent change of control condition in which cells were grown in medium without drugs.
성능/효과
- 피부 기저층의 멜라닌생성세포가 합성한 멜라닌은 각질형성세포의 각화과정에 의해 세포질 돌기를 통하여 각질층으로 이동된다.1) 멜라닌은 태양광선으로부터 나오는 자외선의 투과를 방해하여 피부를 보호하는 기능을 하고 있지만 국소적으로 너무 많이 생성되거나, 노화 등에 의해 피부의 기능이 감소하게 되면 멜라닌이 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 등의 다양한 과색소 질환을 일으키게 된다.2) 멜라닌생성세포에서 멜라닌 합성은 멜라노좀에 존재하는 복합적인 cascade 효소 반응에 의해 일어난다.
- 12) 흥미롭게도 HMG-CoA 환원효소를 억제하여 콜레스테롤 합성을 방해하는 약물인 플루바스타틴에 의해 멜라닌 합성이 촉진된다는 상반된 결과도 발표되었다.13) 이처럼 아직까지 멜라닌 합성에 미치는 콜레스테롤 및 스타틴 계열의 효과와 자세한 작용기전에 대한 연구는 매우 부족한 상태이다.
- 1) 멜라닌은 태양광선으로부터 나오는 자외선의 투과를 방해하여 피부를 보호하는 기능을 하고 있지만 국소적으로 너무 많이 생성되거나, 노화 등에 의해 피부의 기능이 감소하게 되면 멜라닌이 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 등의 다양한 과색소 질환을 일으키게 된다.2) 멜라닌생성세포에서 멜라닌 합성은 멜라노좀에 존재하는 복합적인 cascade 효소 반응에 의해 일어난다.3) 이 중 멜라닌합성의 속도를 결정하는 효소로서 tyrosinase는 두가지 활성을 가지고 있는데 tyrosine을 3,4-dihydroxyphenylalanin(DOPA)로 전환하는 tyrosine hydroxylase 활성과 DOPA를 DOPA quinone으로 산화하는 DOPA oxidase 활성이 그것이다.
- 21) 흥미롭게도 사람 멜라닌 세포에서도 HMG-CoA 환원효소를 통하여 콜레스테롤이 합성될 수 있고 이 과정에 cAMP 경로가 중요한 매개 역할을 하고 있다는 사실이 밝혀졌다.12) 하지만 콜레스테롤 대사와 멜라닌 합성과는 상관관계가 없어 보이는 본 연구 결과의 이유는 현재로는 정확히 알 수 없으며 이를 위해선 향후 체계적이고 다양한 접근을 통한 연구가 필요하다고 하겠다.
- B16 흑색종 세포에 대한 로바스타틴의 세포독성을 측정한 결과, 10 µM 이하의 농도로 처리했을 때 세포생존율은 90% 이상으로 나타났으며, 50 µM을 처리했을 때 생존율이 유의성 있게 저하되었다(Fig. 1).
- 로바스타틴에 의한 멜라닌 합성 촉진작용은 mevalonate, FPP 및 GGPP 등 HMG-CoA 환원효소의 억제를 상쇄시킬 수 있는 대사체의 처리에 의해 유의성 있는 변화를 보이지 않았으므로 로바스타틴의 작용은 콜레스테롤 대사과정과는 무관한 것으로 생각된다. 또한 로바스타틴은 세포내 cAMP 농도를 변화시키지 않았고 PKA 억제제인 H89를 처리해도 로바스타틴에 의한 멜라닌 합성은 영향을 받지 않은 결과는 로바스타틴의 작용에 cAMP 경로가 매개 신호로 작용하고 있지 않음을 시사한다. 하지만 로바스타틴은 세포내 칼슘 농도를 농도의존적으로 증가시켰고 세포내 칼슘 킬레이트인 BAPTA/AM 의 처리에 의해 로바스타틴의 멜라닌 합성촉진 작용이 유의성있게 감소되었다.
- 하지만 로바스타틴은 세포내 칼슘 농도를 농도의존적으로 증가시켰고 세포내 칼슘 킬레이트인 BAPTA/AM 의 처리에 의해 로바스타틴의 멜라닌 합성촉진 작용이 유의성있게 감소되었다. 로바스타틴에 의한 칼슘 증가 및 멜라닌 합성 작용은 세포외 칼슘 킬레이트인 EGTA에 의해서는 변화가 엇었으나 세포내 칼슘 유리 억제 약물인 dantrolene 과 TMM-8에 의해서는 완전히 차단되는 것으로 보아 칼슘신호는 로바스타틴의 이런 작용에 깊이 연루되어 있다고 판단된다. 본 연구에서 밝힌 로바스타틴의 멜라닌 합성 촉진 작용은 멜라닌 합성장애에 의한 저색소질환의 치료제 개발연구에 활용될 충분한 가치가 있다고 판단된다.
- 로바스타틴은 멜라닌을 촉진하는 농도(1~10 µM)에서 cAMP 농도의 변화를 초래하지 않았으나 cAMP 경로를 상향조절하는 양성 대조 물질인 FK(10 µM)에 의해서는 현저한 cAMP 농도의 증가를 보였다(Fig. 4A).
- 배양 후 B16 세포를 수집하여 멜라닌 양을 측정한 결과, 로바스타틴을 처리한 군에서 농도 의존적으로 멜라닌 합성이 증가되었으며 20 µM 농도 처리군에서 대조군에 비해 약 2배가 증가하여 통계적으로 유의한 촉진 효과를 나타내었다(Fig. 2).
- 3). 이 결과로 미루어 보아 로바스타틴에 의한 멜라닌 합성 촉진 효과와 HMG-CoA 환원효소의 억제를 통한 콜레스테롤의 합성 저해와는 서로 상관관계가 없음을 시사한다.
후속연구
- 21) 흥미롭게도 사람 멜라닌 세포에서도 HMG-CoA 환원효소를 통하여 콜레스테롤이 합성될 수 있고 이 과정에 cAMP 경로가 중요한 매개 역할을 하고 있다는 사실이 밝혀졌다.12) 하지만 콜레스테롤 대사와 멜라닌 합성과는 상관관계가 없어 보이는 본 연구 결과의 이유는 현재로는 정확히 알 수 없으며 이를 위해선 향후 체계적이고 다양한 접근을 통한 연구가 필요하다고 하겠다.
- 그럼에도 불구하고 본 연구에서 밝힌 로바스타틴이 멜라닌 합성을 촉진한다는 사실은 이 약물이 백반증과 같은 멜라닌 합성 조절 이상에 의한 저색소질환의 치료용도로 활용될 가치가 충분하다고 판단된다.
- 24) 하지만 이 연구에서는 verapamil의 멜라닌 합성 촉진 작용과 세포내 칼슘 동태와의 상관성에 대해선 연구하지 않았다. 본 연구 결과에서도 보듯이 세포내 칼슘은 멜라닌 합성을 촉진시키는 과정에 관여할 것으로 생각되지만 좀 더 확실한 결론을 도출 하기 위해서는 이를 입증하는 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 로바스타틴에 의한 칼슘 증가 및 멜라닌 합성 작용은 세포외 칼슘 킬레이트인 EGTA에 의해서는 변화가 엇었으나 세포내 칼슘 유리 억제 약물인 dantrolene 과 TMM-8에 의해서는 완전히 차단되는 것으로 보아 칼슘신호는 로바스타틴의 이런 작용에 깊이 연루되어 있다고 판단된다. 본 연구에서 밝힌 로바스타틴의 멜라닌 합성 촉진 작용은 멜라닌 합성장애에 의한 저색소질환의 치료제 개발연구에 활용될 충분한 가치가 있다고 판단된다.
- 17) 하지만 본 연구의 결과로는 콜레스테롤의 대사과정과 멜라닌 합성과는 연관관계가 없는 것으로 판단된다. 서로 상반된 결과에 대한 이유는 현재로선 정확히 알 수 없으나 각 연구에서 사용한 세포의 종류가 다르기 때문일 가능성이 있으며 이에 대해선 향후 좀 더 체계적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 실제로 이전의 많은 연구에서도 본 연구의 결과와 마찬가지로 스타틴 약물의 작용이 HMG-CoA 환원효소를 억제하는 능력과 관계없이 일어나는 경우가 보고된 바 있다.
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