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문제 정의
- 특히 콩 기질에 함유된 이소플라본 화합물과 GABA 등의 생리활성 물질은 홍국발효에 의해 그 농도가 증가하므로(15) 홍국발효 콩의 기능성 소재로의 활용은 매우 다양하게 시도될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 홍국발효 콩을 함유하는 현미 식초를 제조하여 이미 알려진 다양한 생리활성 이외에 피부미백 및 주름개선 효과 등의 가능성을 탐색하기 위해 tyrosinase와 elastase 효소들의 저해 기능 및 항산화 활성을 평가하여 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 2단 담금에서는 현미 1 kg, 생전분 분해효소 20 g과 증류수 1,500 mL를 넣고 현미 첨가량의 10%, 30%, 50%의 홍국발효 콩을 첨가하여 25°C에서 6일 동안 더 발효시켰다.
- ABTS[2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt; Sigma-Aldrich Co.] 라디칼 소거 활성 측정은 Re 등(19)의 방법을 변형하여 측정하 였다. ABTS를 7.
- DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거 활성능을 이용한 항산화력은 Brand-Williams 등(18)의 방법을 변형하여 측정하였으며 DPPH에 대한 전자공여능으로 시료에 대한 환원력을 측정하였다. 실험방법은 시료의 종류에 따라 5~10배로 희석한 시료 100 µL에 에탄올로 용해시킨 35 µM DPPH 용액 900 µL를 첨가한 후 10분 후에 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Elastase 저해 활성은 Kraunsoe 등(5)의 방법을 수정하여 사용하였다. 즉 농도별로 조정한 시료 0.
- 6% 더 증가한 것으로 비교되었다. 그러나 식초 제조 시 50%보다 많은 홍국발효 콩 시료를 첨가하면 비정상적인 초산발효가 발생하여 본 연구에서는 50% 첨가량까지 관찰하였다. 일반적으로총 폴리페놀의 함량은 초산발효가 진행되는 동안 변화되어 발효 전에 비해 초산발효 후에 유의적으로 감소하는 것으로 보고되어 왔다(8,20).
- 기질의 농도는 50 mM phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 N-succinyl-tri-L-alanine-4-nitroanilide(1 mg/mL)를 1.5 mL 첨가하였으며 이들 혼합액을 37°C에서 20분간 반응시킨 다음 흡광도를(410 nm) 측정하여 시료의 elastase 저해 활성을 대조군과 비교하였다.
- 노화의 가장 큰 원인인 산화 방지 효과와 라디칼 생성 때문에 유발되는 피부노화(3) 억제 효과를 측정하기 위해 식초 시료의 항산화 활성을 측정하였다. 현미 식초와 홍국발효콩 함유 식초의 시료를 희석한 후 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능을 측정하여 Trolox 등량 값으로 나타낸 결과는 Table 2와 같다.
- 5 mL 첨가하였으며 이들 혼합액을 37°C에서 20분간 반응시킨 다음 흡광도를(410 nm) 측정하여 시료의 elastase 저해 활성을 대조군과 비교하였다. 대조군은 시료 대신 완충용액을 사용하였고, 양성 대조군으로 epigallocatechin을 사용하여 elastase의 저해 활성을 다음 식을 이용하여 평가하였다. 저해 활성(%)＝(1－시료처리군의 흡광도/ 대조군의 흡광도)×100
- 라디칼이 형성된 ABTS 용액을 에탄올로 희석하여 734 nm에서 측정한 흡광도가 0.75±0.04가 되도록 조정하였다.
- 발효한 술을 원심분리 한 후 증류수로 모든 시료의 알코올 농도를 6%가 되도록 희석하여 60°C에서 20분간 살균한 다음, 종초 5%(v/v)를 접종하여 진탕배양기(30°C, 150 rpm)에서 20일간 발효한 후에 식초 종류에 따라 5~10배로 희석하여 시료로 사용하였다.
- 이동상 용매는 A(20% methanol)와 용매 B(acetonitrile)를 100:0으로 시작하여 55분 후에는 0:100이 되도록 1 mL/min의 유속에서 이동시켰다. 분리한 isoflavone 함량은 daidzin, genistin, daidzein, 그리고 genistein의 표준물질 UV spectrum을 통해 각각의 peak를 확인한 다음 농도에 따른 표준검량곡선(standard calibration curve)으로부터 산출하였다.
- 술의 발효기간은 총 8일로 1단 담금에서는 현미, 생전분 분해효소, 효모, 증류수를 혼합하여 25°C에서 발효한 후 대조군 시료의 식초 제조에 사용하였다.
- 시료의 전처리는 현미 식초와 홍국발효 콩 식초를 80% ethanol과 혼합하여 ultrasonicator(3210-DTH, Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, USA)에서 30분간 추출한 다음 원심분리(2,000×g, 10 min) 하였다.
- 식초의 isoflavone 분석은 HPLC를 사용하여 gradient solvent system으로 분석하였다(17). 시료의 전처리는 현미 식초와 홍국발효 콩 식초를 80% ethanol과 혼합하여 ultrasonicator(3210-DTH, Branson Ultrasonic Co.
- 실험방법은 시료의 종류에 따라 5~10배로 희석한 시료 100 µL에 에탄올로 용해시킨 35 µM DPPH 용액 900 µL를 첨가한 후 10분 후에 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 반응용액에 7% Na2CO3 용액 450 µL를 넣어 다시 혼합한 다음 실온에서 1시간 동안 정치한 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 gallic acid를 이용하여 작성된 검량선으로 총 페놀화합물 함량을 계산하였다. 시료의 총 폴리페놀 함량은 mg gallic acid equivalents(mg GAE)/mL로 나타내었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 현미와 백태는 서울에 위치한 대형 마트에서 구입하였다. 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에서 분양받은 홍국균(Monascus pilosus KCCM 60084)은 PDA(potato dextrose agar, Difco, Detroit, MI, USA) 배지에 접종하여 활성화한 후, 홍국균 종배양액(rice powder 34 g/L, peptone 11 g/L, glycine 26 g/L, glucose 129 g/L) 제조에 사용하였다.
- 분석에 사용된 column은 ODS C18 column(4.6 mm×150 mm, 3.9 µm)이었고 254 nm에서 UV detector로 검출하였다.
- 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에서 분양받은 홍국균(Monascus pilosus KCCM 60084)은 PDA(potato dextrose agar, Difco, Detroit, MI, USA) 배지에 접종하여 활성화한 후, 홍국균 종배양액(rice powder 34 g/L, peptone 11 g/L, glycine 26 g/L, glucose 129 g/L) 제조에 사용하였다. 술 발효에 사용된 생 전분 분해효소와 효모는 제품명 바이오 누룩-R(Korea Enzyme Co., Ltd., Hwaseong, Korea)을 구입하여 사용하였다. 식초 제조에 사용한 초산균(Acetobacter aceti KCCM 40229)은 yeast extract 0.
- 식초 제조에 사용한 초산균(Acetobacter aceti KCCM 40229)은 yeast extract 0.5%, peptone 0.3%, mannitol 2.5%, agar 1.5%, pH 7의 배지조성에서 계대 배양한 후 5%(v/v) 농도로 술에 접종하여 배양한 다음 종초(균수 5.4×106 CFU/mL)로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 현미와 백태는 서울에 위치한 대형 마트에서 구입하였다. 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에서 분양받은 홍국균(Monascus pilosus KCCM 60084)은 PDA(potato dextrose agar, Difco, Detroit, MI, USA) 배지에 접종하여 활성화한 후, 홍국균 종배양액(rice powder 34 g/L, peptone 11 g/L, glycine 26 g/L, glucose 129 g/L) 제조에 사용하였다. 술 발효에 사용된 생 전분 분해효소와 효모는 제품명 바이오 누룩-R(Korea Enzyme Co.
데이터처리
- 각 평균치 간의 유의성은 SPSS program(ver. 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 통계적 유의성은 Duncan's multiple range test로 5% 수준에서(P<0.05) 검정하였다.
- 실험 결과는 3회 반복 측정한 후 평균±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- DPPH와 ABTS 라디칼 소거 능으로 측정한 항산화 활성은 현미 식초에 비해 홍국발효 콩이 첨가된 시료가 첨가량에 비례하여 최대 7배 이상 증가하였다(P<0.05).
- Fig. 1에서와 같이 홍국균으로 20일간 발효시킨 홍국발효 콩 분말의 daidzein과 genistein 의 함량은 건조 중량 g당 각각 1,536.5 µg과 2,853.5 µg으로 높게 나타났으며 특히 genistein의 함량이 가장 높았다.
- Table 2에서와 같이 홍국발효 콩 식초의 elastase 저해 활성은 현미 식초의 41.2 ±0.08%에 비해 50% 첨가군에서 77.2±1.08%로 나타나 87.4% 더 높은 저해 활성으로 비교되었으나, 양성 대조군의 epigallocatechin의 89.2±1.06%보다는 낮은 것으로 나타 났다.
- 이같은 결과는 식초의 극성 기질에서 소수성의 특성을 갖는 daidzein과 genistein의 용해도가 낮기 때문으로 초산 발효일이 지나도 식초에 함유된 aglycone isoflavones의 농도는 증가하지 않는 것으로 보고되었다(22,23). 그럼에도 불구하고 본 실험에서 홍국발효 콩을 혼합한 현미 식초의 주요 이소플라본의 이성체는 genistein과 daidzein으로 나타났으며 특히 genistein의 농도는 전체의 48.1%로 나타났다. 이것은 원료인 홍국발효 콩의 성분에 기인한 것으로 Fig.
- 따라서 현미와 홍국발효 콩을 혼합하여(w/w) 제조한 식초의 총 페놀 함량은 홍국발효 콩의 첨가량이 증가함에 따라 유의적으로(P<0.05) 증가하는 경향을 나타내었다.
- 본 실험의 결과는 Chen 등(23)이 보고한 홍국발효 식초로 배아 콩을 절임할 때 기질의 주요 이소플라본은 malonyl daidzin이라는 결과와는 다르게 genistein과 daidzein이 주요 성분으로 비교되었다. 따라서 홍국균을 콩기질에 직접 접종하여 식초발효를 하는 것보다 먼저 기질을 홍국발효한 후에 식초의 원료로 활용하는 것이 비배당체형의 이소플라본을 효율적으로 활용할 수 있음을 알 수 있다.
- 따라서 홍국발효 콩과 현미를 1:1(w/w)의 비율로 혼합하여 식초를 제조하면 항산화 활성뿐 아니라 tyrosinase와 elastase의 저해 활성이 유의적으로 강화됨을 알 수 있었다(P<0.05).
- 특히 genistein은 daidzein에 비해 보다 강력한 생리활성을 나타내어 nutraceuticals 혹은 cosmeceuticals의 소재로 그 활용가치가 높은 것으로 알려져 왔다(6,23). 본 실험의 결과는 Chen 등(23)이 보고한 홍국발효 식초로 배아 콩을 절임할 때 기질의 주요 이소플라본은 malonyl daidzin이라는 결과와는 다르게 genistein과 daidzein이 주요 성분으로 비교되었다. 따라서 홍국균을 콩기질에 직접 접종하여 식초발효를 하는 것보다 먼저 기질을 홍국발효한 후에 식초의 원료로 활용하는 것이 비배당체형의 이소플라본을 효율적으로 활용할 수 있음을 알 수 있다.
- 이들 성분은 식초발효 기간 동안 원료인 발효 콩에 비해 식초의 기질에 daidzein은 23.9%인 367.21 µg, genistein은 24.1%인 687.32 µg/mL의 농도로 측정되어 이들 성분들이본 시료의 항산화 활성에 일부 기여한 것으로 평가할 수 있다.
- 8배로 높게 측정되어 현미 식초보다 다양한 폴리페놀 물질이 함유된 것을 알 수있다. 즉 초산발효한 현미 식초의 4.15 mg GAE/mL에 비해 홍국발효 콩을 혼합한 시료(10%, 30%, 50%)는 평균 14.26 mg GAE/mL로 나타나 현미 식초에 비해 243.6% 더 증가한 것으로 비교되었다. 그러나 식초 제조 시 50%보다 많은 홍국발효 콩 시료를 첨가하면 비정상적인 초산발효가 발생하여 본 연구에서는 50% 첨가량까지 관찰하였다.
- 이 같은 결과는 Huang 등(26)이 보고한 UVB 조사로 유도한 실험동물의 광산화적 스트레스에 의한 피부노화에서 daidzein과 genistein이 보호 효과를 나타내었다는 결과와 유사한 경향으로 설명할 수 있다. 즉 홍국발효 콩의 함유율이 높은 시료일수록 elastase에 대한 저해 활성이 증가하는 경향은 시료에 함유된 daidzein과 genistein의 농도와 밀접한 관계(r2 =0.946)가 성립되었다. 따라서 홍국발효 콩과 현미를 1:1(w/w)의 비율로 혼합하여 식초를 제조하면 항산화 활성뿐 아니라 tyrosinase와 elastase의 저해 활성이 유의적으로 강화됨을 알 수 있었다(P<0.
- 홍국발효 콩 첨가량에 따른 현미 식초의 이소플라본 함량은 Table 1과 같다. 첨가량의 혼합비율이 늘어날수록 이소플라본 화합물의 농도가 높아지는 것으로 나타났다. 이것은 총 페놀 함량의 경향과 유사한 결과로 홍국발효 콩에 함유된 이소플라본 화합물 등이 식초발효 중에 용출하였기 때문이다.
- Table 1에서와 같이 현미 식초와 홍국발효 콩 함유 식초에 들어 있는 총 페놀 함량은 홍국발효 콩 재료의 첨가량이 증가할수록 증가하는 경향으로 나타났다. 특히 50%의 홍국발효 콩을 첨가한 시료의 총 페놀 함량은 현미 식초에 비해 4.8배로 높게 측정되어 현미 식초보다 다양한 폴리페놀 물질이 함유된 것을 알 수있다. 즉 초산발효한 현미 식초의 4.
- 특히 tyrosinase 저해 활성은 50% 첨가량의 시료에서 kojic acid의 저해 활성과 유사하게 나타나 미백 소재로서의 가능성을 보였으며, elastase 저해 활성 역시 첨가량에 비례하여 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
- 이 같은 결과는 홍국발효 콩에 함유된 이소플라본을 비롯한 여러 플라보노 이드 성분들이 작용한 결과로 추정된다. 특히 비배당체형의 이소플라본의 농도와 이들 두 효소의 저해 활성 간의 평균 상관계수는 r 2 =0.915로 높게 나타나 이들 물질이 주요 기여 성분으로 평가되었다. 이소플라본 특히 daidzein과 genistein의 미백 기능은 여러 연구에 의해 오래전부터 밝혀진 바있다(25-27).
- 특히 홍국발효 콩 50% 함유 식초의 tyrosinase 저해 활성은 현미 식초의 35.6±1.02%에 비해 2.5배 이상 높은 90.3± 1.43%로 나타났으며 양성 대조군인 kojic acid의 91.5± 1.18%와 유사한 저해 활성을 보여 주었다.
- 특히 홍국발효 콩 원료의 주요 이소플라본인 daidzein과 genistein의 식초 기질의 용출량은 각각 23.9%와 24.1%에 비해 β-glycoside형의 daidzin과 genistin의 용출량은 각각 53.1%와 47.2%로 나타나 비배당체에 비해 높게 비교되었다.
- 현미 식초(rice vinegar)와 홍국발효 콩을 10%, 30%, 50% 함유한 세 종류의 현미 식초(이하 홍국발효 콩 식초, soy-koji vinegar)의 아세트산 함량은 각각 평균 4.1±0.5%, 4.8±0.6%였으며 고형물의 함량(solid content)은 각각 평균 12.7±1.1%와 18.3±1.3%로 나타났다.
- 현미 식초에 비해 홍국발효 콩 식초의 tyrosinase와 elastase 효소의 저해 활성은 홍국발효 콩 첨가량이 증가할 수록 모두 유의적으로 높은 활성을 나타내었다(P<0.05).
- 현미 식초와 홍국발효콩 함유 식초의 시료를 희석한 후 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능을 측정하여 Trolox 등량 값으로 나타낸 결과는 Table 2와 같다. 현미 식초에 비해 홍국발효 콩 함유 식초의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 최대 6.3~7.9배 더 높은 것으로 나타났다. 이 같은 결과는 홍국발효 콩에 함유된 이소플라본 등의 항산화 물질이 식초 기질에 용출되어 나타난 결과로, 비배당체형의 이소플라본과 항산화 활성 측정치 간의 평균 상관계수는 r2=0.
- 05). 현미 식초에 비해 홍국발효 콩을 1:1(w/w)의 비율로 첨가한 식초의 높은 생리활성은 시료에 함유된 총 페놀 함량, 특히 이소플라본 비배당체형의 genistein과 daidzein의 농도와 높은 상관관계가 성립되었다.
후속연구
- 05). 이 같은 결과는 현미와 홍국발효 콩으로 제조한 식초를 음용하거나 화장품 소재로 활용한다면 라디칼 생성에 의해 유발되는 피부 노화 억제 효과뿐 아니라 피부의 미백 및 탄력성 강화에도 도움이 될 수 있음을 시사한다.
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