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문제 정의
- 19,20) 본 연구에서는 기능성소재로 사용되고 있는 Sandalwood Essential Oil의 항염증성과 기초적인 생리활성에 관한 연구는 보고된 바가 없어 Sandalwood Essential Oil을 이용하여 RAW264.7 세포에서 NO의 생성, iNOS의 단백질과 유전자 발현정도와 염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α 분비량 등을 조사하여 Sandalwood Essential Oil의 항염증성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- iNOS는 세포내에 존재하지 않으나 자극에 의해 유도가 되면 NO를 생성하며 생성된 NO는 혈관확장, 세포독성, 조직손상과 같은 작용을 하며 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.31) LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포로부터 생성되는 NO의 합성효소인 iNOS의 유전자 발현에 대한 Sandalwood Essential Oil 의 효과를 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과(Fig.
- 1% Triton X-100), 250 µM dNTP, 1U Tag polymerase를 혼합한 후 denaturation을 위해 94℃에서 45초, annealing을 위해 55~60℃에서 45초 및 extension을 위해 72℃에서 60초 조건으로 30 cycles을 수행하였다. PCR 반응의 표준대조구로 GAPDH를 사용하였다(Table I). 이후 증폭된 DNA산물을 1.
- RAW264.7 세포를 96 well plate에 1.0×105 cells/well이 되도록 분주하고 18시간 동안 배양한 후 Sandalwood Essential Oil를 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml 전처리하고 1시간 후에 LPS 10 µg/ml 처리한 후 24시간 동안 배양한 후 세포배양액을 얻은 다음 배양액에 함유된 IL-1β, IL-6, TNF-α을 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
- RAW264.7 세포에서 발현되는 iNOS의 유전자 발현에 대한 Sandalwood Essential Oil의 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 먼저 RAW264.
- Sandalwood Essential Oil의 RAW264.7 세포에 대한 독성 Sandalwood Essential Oil의 세포독성을 보기 위하여 RAW264.7 대식세포에 Sandalwood Essential Oil을 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml 농도로 처리한 후 MTS assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다.
- 이어서 ECL system으로 반응시킨 후 X-ray film 상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
- 7 세포만 배양한 대조군에서 NO의 농도는 매우 낮게 측정되었으며, LPS를 처리한 군에서 NO의 농도는 현저히 증가되었다. 그러나 Sandalwood Essential Oil을 처리한 실험군은 NO 생성이 유의성 있게 억제되었으며, RAW 264.7 세포에 LPS로 처리 시 iNOS의 단백질과 유전자가 발현되어 NO를 생성하게 되므로 iNOS 단백질과 유전자 발현에 미치는 영향을 평가 하였다. LPS 처리시 iNOS 단백질과 유전자 발현이 유의하게 증가 되었으나, Sandalwood Essential Oil을 전 처리한 실험군에서 iNOS 단백질과 유전자의 발현이 감소하였다.
- 기능성소재로 활용할 수 있는 Sandalwood Essential Oil에 대한 항 염증성과 그 면역기전에 대한 기초적인 생리 활성을 측정 하였다. 실험결과 실험에 사용된 Sandalwood Essential Oil은 세포독성을 나타내지 않았다.
- 분리된 RNA를 QuantiTect® Reverse Transcription Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 40분간 세척한 다음, secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL system으로 반응시킨 후 X-ray film 상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
- PCR 반응의 표준대조구로 GAPDH를 사용하였다(Table I). 이후 증폭된 DNA산물을 1.5% agarose gel를 사용하여 100 volt에서 30분간 전기 영동하여 UV에서 관찰하였다.
- 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 cDNA 1 µg에 primers (sense, anti-sense) 1 µl 및 10×buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 µM dNTP, 1U Tag polymerase를 혼합한 후 denaturation을 위해 94℃에서 45초, annealing을 위해 55~60℃에서 45초 및 extension을 위해 72℃에서 60초 조건으로 30 cycles을 수행하였다.
대상 데이터
- IL-1β, IL-6, Tumor necrosis factor-α (TNF-α), ELISA kit는 eBioscience사(San Diego, CA, USA)에서 구입하였고 NO(Nitric Oxide) detection kit는 iNtRON Biotechnology사(Suwon, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- Total RNA를 분리시 Easy Blue®시약(iNtRON Biotechnology, Korea)을 이용하였고 분리된 RNA를 QuantiTect® Reverse Transcription Kit(Qiagen, USA)를 구입하여 cDNA 합성에 사용하였다.
- 세포 배양액인 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)과 fetal bovine serum(FBS), streptomycin-penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사(Grand Island, USA), Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA), Cell Titer 96® AQueous One Solution은 Promega사(Madison, USA) 에서 구입하여 사용하였다.
- 기능성소재로 활용할 수 있는 Sandalwood Essential Oil에 대한 항 염증성과 그 면역기전에 대한 기초적인 생리 활성을 측정 하였다. 실험결과 실험에 사용된 Sandalwood Essential Oil은 세포독성을 나타내지 않았다. 세포 독성이 없음을 확인 한 후 LPS 로 처리한 RAW 264.
- 실험에 사용한 Sandalwood Essential Oil(Sandalum album)은 유기농 인증기관으로부터 인정받은(ECOCERT-F-32600) 100%순도의 천연 에션셜 오일인 NEW DIRECTIONS LABORATORY LTD사(Australia) 제품을 사용하였으며 에탄올과 essential oil을 4:1로 먼저 희석한 후 세포배양용 배지에 희석하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하였다.
- Total RNA를 분리시 Easy Blue®시약(iNtRON Biotechnology, Korea)을 이용하였고 분리된 RNA를 QuantiTect® Reverse Transcription Kit(Qiagen, USA)를 구입하여 cDNA 합성에 사용하였다. 이외에 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma Chemical사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 모두 분석용 시약 특급을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균±표준편차(Mean±SD)로 계산하였고, 각군간의 유의성 검증은 students' t-test를 사용하였다.
이론/모형
- 31) 염증성 사이토카인은 염증을 나타내는 중요한 지표로 Sandalwood Essential Oil이 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 RAW 264.7 세포에 LPS(10 µg/ml) 단독 처리 또는 LPS와 Sandalwood Essential Oil을 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml 농도 의존적으로 처리한후, 배지에 생성된 TNF-α, IL-1β, IL-6의 농도를 ELISA방법으로 측정하였다.
- Sandalwood Essential Oil의 세포에 대한 독성은 Desai 등의 방법18)에 준하여 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetrazolium inner salt(MTS) assay 방법으로 측정하였다. 이는 Mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTS가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로 96 well plate에 1.
- iNOS 단백질 발현조사를 위하여 Western blot analysis를 이용 하여 세포내에서의 단백질발현을 확인하였다. RAW264.
성능/효과
- p>Sandalwood Essential Oil(Santalum album)은 단향과(Santalaceae)에 속하는 12~15미터크기의 상록교목으로 India, Malaysia, Australia, Indonesia 등에서 자생하거나 재배하며,1) 연한 노란색에서 노란색을 띤 점성액체로 매우 부드럽고 달콤한 나무향과 약간의 발삼향이 나타나며 향의 지속성 때문에 상당한 시간동안 일정한 향을 유지한다.2) 인도는 Sandalwood Essential Oil의 주요생산국이며, 오일 제조를 위해서는 30년 이상 된 나무의 심재만을 사용한다.3) Sandalwood Essential Oil의 연구보고를 보면 아토피 피부염의 주 증상인 가려움증과 피부염증을 경감시킨다는 보고와,4) 항산화 효과,5) 항균 효과,6) 방등은 ICR 마우스에게 Sandalwood Essential Oil처리시 세포내 reactive oxygen species(ROS)와 지질과산화도(Malondialdehyde, MDA)가 억제됨을 보고하였다.
- 32) LPS에 의해 유도되는 TNF-α 생성에 미치는 영향을 조사한 결과(Fig. 5A), 농도 의존적으로 억제 되는 것을 관찰할 수 있었으며 특히 500 µg/ml에서는 유의한 수준이었다.
- Essential Oil을 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml 처리한 실험군은 각각 37.49±2.98 µM, 34.62±2.89 µM, 21.42±3.58 µM 측정되어 농도 의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 관찰할 수있었으며 500 µg/ml에서 유의한 억제를 보였다.
- 7 세포에 LPS로 처리 시 iNOS의 단백질과 유전자가 발현되어 NO를 생성하게 되므로 iNOS 단백질과 유전자 발현에 미치는 영향을 평가 하였다. LPS 처리시 iNOS 단백질과 유전자 발현이 유의하게 증가 되었으나, Sandalwood Essential Oil을 전 처리한 실험군에서 iNOS 단백질과 유전자의 발현이 감소하였다. Sandalwood Essential Oil에 의한 iNOS 단백질과 유전자의 발현 억제는 NO 생성억제를 유도하였음을 의미한다.
- LPS에 의해 유도되는 IL-1β, IL-6의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과(Fig. 5B and C), 농도 의존적으로 감소하는 경향은 보였으나 유의성은 없었다.
- Proinflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6 분비 억제를 살펴본 결과 Sandalwood Essential Oil를 처리한 군에서 TNF-α 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 농도 의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었으며 특히 500 µg/ml에서는 유의한 수준이었다.
- RAW264.7 세포에 LPS를 처리시 iNOS 단백질 발현이 증가 되었으나 Sandalwood Essential Oil를 처리한 군에서는 iNOS 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소하였으며, 250 µg/ml, 500 µg/ml에서 유의한 억제를 보였다(Fig. 3).
- Results of the experiments were the mean values of three independent experiments and asterisks indicate the significant differences (*: p<0.05 compared to LPS: **: p<0.01 compared to LPS).
- Results of the experiments were the mean values of three independent experiments and asterisks indicate the significant differences (*: p<0.05 compared to LPS; **: p<0.01 compared to LPS).
- 7 cells. Results of three independent experiments were averaged mean value of three independent experiments (SD=bars), and are shown as percentage cell viability compared with the viability of untreated control cell. SEO: Sandalwood Essential Oil.
- Results of three independent experiments were averaged mean value of three independent experiments (SD=bars), and asterisks indicate significantly different from treatment with LPS alone (*: p<0.05 compared to LPS).
- 그 결과(Fig. 4), RAW264.7 세포만 배양한 대조군에서는 iNOS의 유전자발현이 나타나지 않았으나 LPS 10 µg/ml를 처리한 군에서는 iNOS의 유전자 발현이 대조군에 비하여 현저히 증가하였다.
- 실험결과 실험에 사용된 Sandalwood Essential Oil은 세포독성을 나타내지 않았다. 세포 독성이 없음을 확인 한 후 LPS 로 처리한 RAW 264.7 세포에서 Sandalwood Essential Oil의 NO 생성억제를 평가한 결과 RAW264.7 세포만 배양한 대조군에서 NO의 농도는 매우 낮게 측정되었으며, LPS를 처리한 군에서 NO의 농도는 현저히 증가되었다. 그러나 Sandalwood Essential Oil을 처리한 실험군은 NO 생성이 유의성 있게 억제되었으며, RAW 264.
- 실험 결과 각각 99.6±2.98%, 100.9±3.02%, 99.0±2.97%로 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 1).
- 7세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성억제, iNOS 단백질과 유전자의 발현을 억제시켰으며, proinflammatory cytokines인 TNF-α의 분비량도 억제시켰다. 이러한 실험 결과들은 기능성소재로 사용되고 있는 Sandalwood Essential Oil의 항 염증성과 그 면역기전에 대한 기초적인 생리 활성을 객관적으로 입증한 것으로 사료된다.
- 그러나 IL-1β, IL-6의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과농도 의존적으로 감소하는 경향은 보였으나 유의성은 없었다. 이상과 같은 결과로 Sandalwood Essential Oil은 RAW 264.7세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성억제, iNOS 단백질과 유전자의 발현을 억제시켰으며, proinflammatory cytokines인 TNF-α의 분비량도 억제시켰다. 이러한 실험 결과들은 기능성소재로 사용되고 있는 Sandalwood Essential Oil의 항 염증성과 그 면역기전에 대한 기초적인 생리 활성을 객관적으로 입증한 것으로 사료된다.
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