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문제 정의
- RAW 264.7 cell에 LPS와 CSL을 함께 처치하여 배양하였을 때 유도되는 세포사멸 현상에 대하여 알아보았다. 48 well plate에 RAW 264.
- 또한 蘇木의 항염증 활성을 조사하기위하여 RAW 264.7 cell과 HUVEC에 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 염증 반응을 유도시켜서, 얼마나 효과적으로 저해할 수 있는지 관찰하였는데 그 지표로서 pro-inflammatory cytokines인 IL-1β, IL-6, INF-γ, MCP-1, TNF-α 생성량을 알아 본 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 蘇木의 에탄올 추출물(CSL)을 사용하여 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서의 항산화 효과 및 항염증 효과를 검증하였고, 이를 바탕으로 사람의 혈관 내피 세포인 HUVEC에서 CSL의 항염증 효과에 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 24시간 동안 배양 한 후, 여기에 LPS 2 μg/ml및 CSL 각 10, 20, 40 μg/ml를 각각의 well에 첨가한 후, 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다.
- 24시간 동안 배양한 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-6, MCP-1, TNF-α를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정하였다.
- CSL에 대한 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서의 항염증 효과를 바탕으로 사람의 혈관 내피 세포인 HUVEC에서의 항염증 효과를 알아보았다.
- CSL의 세포독성 여부를 확인하기 위해 HUVEC을 이용하여 세포독성을 확인하였다. HUVEC은 5 ×103 cells/100 μl의 농도로 96 well plate에 분주한 다음 24시간 후에 새로운 배지로 씻어낸다.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
- N1 buffer 50 μl를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소반응 후, N2 buffer 50 μl를 각 well에 처리하고, 10분간 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
- PBS 400 μl를 추가로 넣고 부유한 다음 유세포 분석기를 이용하여FITC-labeled annexin Ⅴ, PI 염색 되어진 세포의 형광강도의 세기를 측정하여 세포사를 관찰하였다.
- RAW 264.7 cell 내에서 reactive oxygen speies (ROS)를 측정하기 위하여 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)를 이용하였다.
- RAW 264.7 cell을 96 well plates에 3×105 cells/well이 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, CSL를 각각 10, 20, 40 μg/ml의 농도로 처리하고, LPS 2 μg/ml을 처리하였다.
- 배양 후, 10 μl의 WST solution을 첨가한 후 CO2 배양기(37 ℃, 5% CO2)에서 30분 반응 시킨 후, 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.
- 본 연구에서는 蘇木을 에탄올 추출하고 그 추출물을 이용하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)및 RAW 264.7 cell에서의 reactive oxygen species(ROS)와 nitric oxide(NO)에 미치는 영향을 통해 항산화 활성을 측정하였다. 또한 蘇木의 항염증 활성을 조사하기위하여 RAW 264.
- 염색 후 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400 μl를 부유시켜 유세포분석기(flow cytometer, BECTON Dickinson, Franklin Lakes, NJ USA)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
- 이동상은 water(A)와 acetonitrile (B)로 gradient elution system을 적용시켜 5%(0분B), 5-10%(20분 B), 10-20%(10분 B), 20-40%(20분 B), 40-100%(10분 B)로 설정하였다.
- 이를 24시간 배양한 후 상청액을 모아ELISA kit로 IL-1β, IL-6, INF-γ, TNF-α 생성량을 측정하였다.
- 자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH를 사용하는 방법으로 에탄올에 용해시킨 0.2 nm의 DPPH 용액 150 μl와 CSL(각 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml) 100 μl 를 각각 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응 시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래의 식에 따라 계산하였다.
대상 데이터
- CSL의 세포에서의 항산화 효과를 알아보기 위해 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell을 이용하였다. RAW 264.
- HPLC는 Shimadzu(Japan)사의 system controller(CBM-20A), pump(LC-20AD), column oven(CTO-20A), UV/VIS detector(SPD-20A)를 사용하였으며, column은 ACE 5 C18(250×4.6 mm, 5 μm)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 소목(蘇木, 학명 : Caesalpinia sappan L.)은 동신대부속 순천한방병원에서 구입하여 정선한 후 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과를 multi t-test(JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구하였다. 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p<0.
- 24시간 동안 배양한 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-6, MCP-1, TNF-α를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정하였다. 분석은 Luminex system을 이용한 Milliplex analyst를 통해 이루어졌다.
이론/모형
- 24시간 동안 배양한 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-6, MCP-1, TNF-α를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정하였다. 분석은 Luminex system을 이용한 Milliplex analyst를 통해 이루어졌다.
성능/효과
- 1. CSL이 가진 DPPH 소거 활성을 측정한 결과농도 의존적으로 소거 활성을 증가시켰다.
- 2. CSL이 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell의 ROS및 NO 생성 억제를 농도 의존적으로 증가시켰다.
- 3. CSL이 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell의 염증Cytokine 성분의 생성 억제를 농도 의존적으로 증가시켰으며, 특히 CSL 40 μg/ml에서 유의성 있게 증가시켰다.
- 4. CSL이 LPS로 유도된 HUVEC의 염증 Cytokine성분의 생성 억제를 유의성 있게 증가시켰다.
- CSL을 HPLC로 pattern 분석한 결과 288 nm에서 retention time이 23.4분, 26.6분, 30.2분대에 peak가 확인되었고 이 중 23.4분대의 peak는 지표성분인 brazilin이었다(Fig. 1).
- CSL의 HUVEC에 대한 세포독성을 측정한 결과대조군의 세포생존율 100±0.5%로 했을 때, CSL의50, 100, 200 μg/ml 농도에서는 각각 100.7±2.0%, 98.4±2.2%, 85.7±1.2%로 나타났다.
- CSL의 RAW 264.7 cell에 대한 세포독성을 관찰한 결과 대조군의 세포생존율 100±13.9%로 했을때, CSL의 10, 20, 40 μg/ml 농도에서는 각각 119.4±16.0%, 115.2±9.4%, 106.6±3.3%로 나타났다.
- CSL의 항산화 활성에 미치는 영향에 대해 알아보고자 DPPH의 소거활성을 측정한 결과 농도에 따라 소거활성 효과가 증가하였다.
- HUVEC에서 LPS에 의해 유도된 Cytokine 성분인 IL-1β, IL-6, INF-γ, TNF-α 생성억제 효과를 측정한 결과 모든CSL의 투여군은 IL-1β(p<0.001), IL-6(p<0.001), INF-γ(p<0.01), TNF-α(p<0.001) 유의성 있게 감소하였다(Fig. 5, 6, 7, 8).
- HUVEC에서 LPS에 의해 유도된 IL-1β 생성량은 대조군을 100%로 하였을 때, 정상군이 32.1±1.4%, CSL50투여군에서 56.4±1.8%, CSL100투여군에서 53.5±1.6%로 CSL투여군에서 모두 유의성(p<0.001) 있게 감소하였다(Fig. 5).
- HUVEC에서 LPS에 의해 유도된 IL-6 생성량은 대조군을 100%로 하였을 때, 정상군이 2.4± 0.3%, CSL50투여군에서 51.6±2.1%, CSL100투여군에서 37.4±2.4%로 CSL투여군에서 모두 대조군에 비하여 유의성(p<0.001) 있게 감소하였다(Fig. 6).
- HUVEC에서 LPS에 의해 유도된 INF-γ 생성량은 대조군을 100%로 하였을 때, 정상군이 40.3±2.6%, CSL50투여군에서 60.4±3.7%, CSL100투여군에서 61.9±2.9%로 CSL투여군에서 모두 유의성(p<0.01) 있게 감소하였다(Fig. 7).
- HUVEC에서 LPS에 의해 유도된 TNF-α 생성량은 대조군을 100%로 하였을 때, 정상군이 34.8± 4.2%, CSL50투여군에서 63.5±0.8%, CSL100투여군에서 53.4±1.9%로 CSL투여군에서 모두 대조군에 비하여 유의성(p<0.001) 있게 감소하였다(Fig. 8).
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 세포사멸을 측정한 결과 정상군에서 0.53%, 대조군에서 29.68%, CSL10 투여군에서 18.22%, CSL20 투여군에서 14.54%, CSL40 투여군에서 10.68%로 나타나 CSL군에서 농도 의존적으로 감소하였다.
- LPS에 의해 유도된 IL-6 생성량은 대조군을 100%로 하였을 때, 정상군이 0%, CSL10투여군에서 95.0±5.0%, CSL20투여군에서 74.0±13.0%, CSL40투여군에서 34.0±3.8%로 나타나 CSL투여군에서 대조군에 비하여 농도 의존적으로 감소하였고, CSL40투여군에서 유의성(p<0.001) 있게 감소하였다(Fig. 2).
- LPS에 의해 유도된 MCP-1 생성량은 대조군을100%로 하였을 때, 정상군이 1.0±0%, CSL10투여군에서 96.0±7.5%, CSL20투여군에서 83.0±6.8%, CSL40투여군에서 74.0±3.4%로 나타나 CSL투여군에서 대조군에 비하여 농도 의존적으로 감소하였고, CSL40투여군에서 유의성있게(p<0.05) 감소하였다(Fig. 3).
- LPS에 의해 유도된 TNF-α 생성량은 대조군을 100%로 하였을 때, 정상군이 16.0±0%, CSL10투여군에서 104.0±4.2%, CSL20투여군에서 93.0±10.8%, CSL40투여군에서 72.0±0.8%로 나타나 CSL투여군에서 대조군에 비하여 농도 의존적으로 감소하였고, CSL40투여군에서 유의성 (p<0.001) 있게 감소하였다(Fig. 4).
- RAW 264.7 cell에서 NO의 생성량(%)을 측정한 결과, 정상군에서 29.5±4.4%, 대조군에서 100.0±4.1%, CSL10에서 71.2±5.5%, CSL20에서 42.8±6.2%, CSL40에서 20.0±5.8%로 나타나 CSL군에서 농도 의존적으로 감소하였다.
- RAW 264.7 cell에서 ROS의 생성량(%)을 측정한 결과, 정상군에서 0.59%, 대조군에서 31.89%, CSL10에서 20.03%, CSL20에서 17.73%, CSL40에서 13.68%로 나타나 CSL군에서 농도 의존적으로 감소하였다.
- 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p<0.05 일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 그리고 CSL은 RAW 264.7 cell 뿐만 아니라 사람의 혈관 내피 세포인 HUVEC에서의 IL-1β, IL-6, INF-γ, TNF-α 생성억제 효과가 있음을 확인하였으며 이는 혈관 염증성 질환 등에도 적용할 수 있을 것이다.
- 먼저, MTT assay를 수행한 결과, CSL의 적정농도 범위 내에서는 HUVEC의 생존율에 크게 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다. HUVEC에서 LPS에 의해 유도된 Cytokine 성분인 IL-1β, IL-6, INF-γ, TNF-α 생성억제 효과를 측정한 결과 모든CSL의 투여군은 IL-1β(p<0.
- 본 연구에서는 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에 LPS와 CSL을 함께 첨가하여 세포 사멸에미치는 영향을 측정한 결과 세포 사멸이 정상군에 비해 CSL 투여군에서는 감소하는 것을 확인하였고, RAW 264.7 cell에 LPS의 의해 유도된 Cytokine성분인 IL-6, MCP-1, TNF-α 생성억제 효과를 측정한 결과 CSL의 농도가 증가함에 따라 억제 효과가 증가함을 확인하였으며, 특히 CSL 40 μg/ml 농도 투여군은 IL-6(p<0.001), MCP-1(p<0.05), TNF-α (p<0.001)에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 2, 3, 4).
- 이 결과로 CSL은 LPS로 유도된 염증 유관인자로부터 세포를 보호하는 효과가 있으며, CSL에 의한 IL-6, MCP-1, TNF-α 생성억제 효과는 염증매개 cytokine의 생성 억제에도 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- 이상의 실험 결과 CSL은 DPPH의 소거 활성효과가 있음을 확인하였으며 마우스 대식세포주인RAW 264.7 cell에서의 ROS 및 NO의 활성 억제효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 그와 함께 RAW 264.
- 이의 결과로 CSL의 IL-6, MCP-1, TNF-α 생성억제 효과는 염증매개인 cytokine의 생성 억제에도 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 그와 함께 RAW 264.7 cell에서의 IL-6, MCP-1, TNF-α 생성억제 효과를 확인하여 이를 통해 CSL은 세포 내에 생성되는 항산화 및 항염증에 효과가 있을 것으로사료되며, 이를 바탕으로 활성 산소 및 염증성 질환인 류마티스 관절염, 암 등에 효과가 있을 것이다.
- 이러한 蘇木의 항산화 및 항염증 효능은 蘇木을활용한 염증성 질환의 예방 및 면역치료 약물의 개발 가능성을 제시한다.
- 최근 항산화 및 항염증의 연구가 피부과, 산부인과, 심혈관계, 호흡기계 등 여러 분야에서 연구가이루어지고 있으니 蘇木 또한 지속적인 후속 연구를 통해 여러 방면의 응용도 생각해볼 수 있다.
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