[논문]해충저항성 유전자변형 벼 Agb0101에 대한 PCR 검정

신공식; 이진형; 임명호; 우희종; 친양; 서석철; 권순종; 조현석

doi:10.5010/jpb.2013.40.1.018

해충저항성 유전자변형 벼 Agb0101에 대한 PCR 검정
Qualitative and quantitative PCR detection of insect-resistant genetically modified rice Agb0101 developed in korea 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.40 no.1, 2013년, pp.18 - 26

신공식 (국립농업과학원 생물안전성과) , 이진형 (국립농업과학원 생물안전성과) , 임명호 (국립농업과학원 생물안전성과) , 우희종 (국립농업과학원 생물안전성과) , 친양 (국립농업과학원 생물안전성과) , 서석철 (국립농업과학원 생물안전성과) , 권순종 (국립농업과학원 생물안전성과) , 조현석 (국립농업과학원 생물안전성과)

초록
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살충성 유전자 mcry1Ac1을 포함하고 있는 해충저항성 유전자변형(GM) 벼 Agb0101이 국내에서 개발되었다. 향후 Agb0101 벼의 환경방출에 따른 모니터링과 이력추적을 위해서는 신뢰성 있는 검출방법의 개발이 필요하다. 따라서, 본 연구에서 해충저항성 GM벼의 사후 안전관리를 위한 정성적 및 정량적 PCR 검정 방법을 개발하였다. 벼 녹말분지효소 유전자 RBE4를 PCR 분석의 내재유전자로 사용하였고, 이의 primer쌍 RBEgh-1/-2는 101bp의 PCR 증폭산물을 형성하였다. 정성 PCR 분석을 위해서 삽입된 T-DNA를 바탕으로 특이 primer를 제작하였고, 이벤트 특이적 검출 primer의 경우 Agb0101의 도입유전자 및 벼 염색체 DNA 사이의 5' 또는 3' 인접염기부위를 정확하게 특이적으로 PCR 증폭하였다. 반면, 대조구인 각종 작물, 국내 벼 품종 및 Agb0101과 동일 형질전환 벡터를 갖는 해충저항성 벼에서는 어떠한 PCR 증폭산물도 형성하지 않았다. 표준물질로써 내재유전자 및 이벤트 특이적 단편으로 제조된 pRBECrR을 이용한 real-time PCR 분석에 의해서 정량한계(LOQ)가 10 copies 농도의 범위인 것으로 확인되었고, 이의 유효성을 검증하기 위하여 상이한 농도의 Agb0101시료(10, 5, 3 및 1%)를 real-time PCR 분석하여 정량검정에 대한 표준편차 및 상대표준편차가 각각 0.06 ~ 0.40 및 3.80 ~ 7.01%의 낮은 범위에 포함되는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과로 본 연구에서 개발된 정성 및 정량 PCR 검정 방법이 해충저항성 GM벼 Agb0101의 모니터링 및 이력추적에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 본다.

Abstract ▼ AI-Helper

Genetically modified (GM) rice Agb0101, which expresses the insecticidal toxin modified cry1Ac (mcry1Ac1) gene, was developed by the Rural Development Administration in Korea. To monitor the probable release of Agb0101 in the future, it is necessary to develop a reliable detection method. Here, we developed the PCR detection method for monitoring and tracing of GM rice. The primer pair (RBEgh-1/-2) from a starch branching enzyme (RBE4) gene was designed as an endogenous reference, giving rise to an expected PCR amplicon of 101 bp. For the qualitative PCR detection, construct- and event-specific primers were designed on the basis of integration sequence of T-DNA. Event-specific PCRs amplified specifically 5'- or 3'-junction region spanning the native genome DNA and the integrated gene construct, while none of amplified product was shown on crops, rice varieties, and other insect-resistant transgenic rice lines. The event-specific real-time PCR method was performed using TaqMan probe and plasmid pRBECrR containing both rice endogenous gene RBE4 sequence and 5'-junction sequence as the reference molecule. The absolute limit of quantification (LOQ) of real-time PCR was established with around 10 copies for one plasmid molecule pRBECrR. Thereafter, the different amounts of transgenic rice (1, 3, 5, and 10%, respectively) were quantified by using the established real-time PCR method, with a range below 19.55% of the accuracy expressed as bias, 0.06-0.40 of standard deviation (SD) and 3.80-7.01% of relative standard deviations (RSD), respectively. These results indicate that the qualitative and quantitative PCR methods could be used effectively to detect the event Agb0101 in monitoring and traceability.

AI 본문요약
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문제 정의

2009), 최근 GM작물의 실용화를 위해서 이벤트 Agb0101에 대한 식품 및 환경위해성평가 연구를 수행하였다. 따라서, 본 연구는 GM작물의 실용화에 따른 모니터링 및 사후 안전관리를 위한 검출방법을 개발하고자 Agb0101에 대한 특이 primer를 작성하여 정성 PCR 분석법을 도출하였고, 삽입 인접염기서열을 포함하는 plasmid를 표준물질로 한 real-time PCR을 실시하여 정량분석의 정확성 및 정밀성을 확인하였다.
향후 Agb0101 벼의 환경방출에 따른 모니터링과 이력추적을 위해서는 신뢰성 있는 검출방법의 개발이 필요하다. 따라서, 본 연구에서 해충저항성 GM벼의 사후 안전관리를 위한 정성적 및 정량적 PCR 검정 방법을 개발하였다. 벼 녹말분지효소 유전자 RBE4를 PCR 분석의 내재유전자로 사용하였고, 이의 primer쌍 RBEgh-1/-2는 101bp의 PCR 증폭산물을 형성하였다.
2006). 따라서, 본 연구에서도 Agb0101의 지속적인 사후관리 및 이력추적을 위해서 genome 내 도입유전자의 삽입인접부위 염기서열을 바탕으로 특이적 primer를 설계하였고, 이들 이벤트 특이적 primer의 PCR 특이성을 확인하고자 Agb0101과 동일한 형질전환 운반체를 이용하여 유도된 다양한 해충저항성 벼 계통들에 대하여 분석하였다. Figure 4에 나타난 바와 같이 T-DNA 내의 검출 부위를 갖는 35sBr-1/-2에 있어서는 Agb0101을 비롯한 모든 계통에서 동일한 PCR 증폭산물을 생산하였다.
해충저항성 GM벼 Agb0101의 real-time PCR 정량분석을 위해서 표준 plasmid을 이용하고자 하였다. 표준 plasmid제작은 벼 내재유전자 primer쌍(RBEgh-1/-2) 및 이벤트 특이적 primer쌍(CrRB-1/-2)으로 증폭된 PCR 산물을 서로 연결하고 T-Vector에 도입하여 제조하였다(Fig.

제안 방법

Agb0101 벼의 정량 real-time PCR 분석을 위해서 사용된 표준 plasmid는 Table 1에 나타낸 도입유전자에 대한 이벤트 특이적 primer(CrRB-1/CrRB-2) 및 벼 내재유전자 primer(RBEgh-1/RBEgh-2)를 이용하여 증폭된 각 PCR 산물(amplicon)을 SmaI/SrfI 제한효소 인식부위를 갖도록 연결하고, pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 삽입하여 plasmid, pRBECrR을 제조하였다(Fig. 5). 이후, Escherichia coli strain DH5α (RBC Bioscience, Taiwan)에 cloning하여 얻어진 plasmid를 정량 PCR의 표준물질(reference molecule)로 이용하였다.
Agb0101의 검출을 위해 제작한 각 primer의 특이성 확인을 위해서 각종 작물에 대한 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응의 결과로, 이벤트 Agb0101의 경우에 구조 특이적 primer쌍 35sBr-1/-2와 RB 및 LB의 인접염기서열을 바탕으로 설계된 두 종의 이벤트 특이적 primer쌍인 CrRB-1/-2 및 CrLB-1/-2가 각각의 예상된 크기인 414 bp, 141 bp 및 127 bp를 명확하게 형성한 반면, non-GM작물의 대조구로 사용한 벼, 배추, 고추, 감자, 상추, 콩, 들깨, 토마토, 참외, 완두, 피망 및 고구마 등에 있어서는 어떠한 PCR 반응산물도 형성하지 않았다.
GM작물의 PCR 반응 시 검출 primer가 동일 작물의 품종에 따라 genome 상에 유사 염기서열의 존재로 비특이적인 반응산물을 형성하여 검정의 정확성을 감소시킬 수 있기 때문에 국내 벼 품종에 대한 primer의 특이성을 확인하였다. 그 결과 Figure 3에 나타난 바와 같이, primer쌍 35sBr-1/-2, CrRB-1/-2 및 CrLB-1/-2는 단지 Agb0101에서만 명확한 증폭산물을 나타냈고, 벼 내재유전자의 검출 primer쌍 RBEgh-1/-2는 71개 벼 품종 모든에서 PCR 반응 증폭산물을 형성하였다.
해충저항성 GM벼 Agb0101의 검출을 위해서 삽입된 T-DNA의 유전정보를 바탕으로 구조 특이적(construct-specific) primer쌍을 제작하였고, Agb0101만의 특이적인 검출과 이력추적이 가능하도록 도입 T-DNA와 벼 염색체 DNA사이의 5’ 및 3’ 삽입 인접염기서열을 바탕으로 이벤트 특이적(event-specific) primer를 제작하였다. PCR검정의 대조 마커로써 벼 내재유전자의 검출 primer는 RBE4(starch branching enzyme) 유전자의 염기로부터 작성하였다. 본 연구에 이용된 RBE4 유전자는 벼 염색체 내에 단일 copy 유전자로 존재하고 PCR 검정을 위한 내재유전자로 이용되고 있다(Jeong et al.
25 unit 첨가하고, 20 ng/μL의 template DNA를 사용하여 반응을 수행하였다. PCR반응조건은 Dyad Peltier Thermal cycler(Bio-Rad, USA)를 이용하여, 95℃에서 15분간 실시하고, 95℃에서 20초, 60℃에서 40초, 72℃에서 1분간 35cycle로 하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 5분간 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 전기영동 장치를 이용하여 2% agarose gel 상에서 전개한 후 UV로 확인하였다.
Real time-PCR 분석은 시료 당 3 반복 분석하였고, 반응은 각 반응당 총 20 μL로 하여 내재유전자 및 도입유전자에 대한 반응액을 준비하였다.
Real-time PCR 반응은 Brilliant II QPCR Master Mix 10 μL, primer/probe mix 8 μL 및 Template DNA (50 ng/μL) 2 μL를 혼합하고, Stratagene Mx3005P system(Agilent Technologies, USA)을 이용하여 95℃에서 10분간 실시 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 총40 cycle을 수행하였다.
대조구(NTC, no template control)는 시료 DNA를 넣지 않은 음성대조구로 ColE1/TE DNA용액(5 ng/μL)을 넣어 분석하였다. Real-time PCR 분석은 10 ~ 2,000,000 copies 범위에서 단계별 희석하여 얻어진 표준 plasmid의 내재유전자 및 도입유전자에 대한 각 표준검량선(Standard curves)으로부터 산출하였다. 또한 pRBECrR를 표준물질로 한 real-time PCR 분석의 검정 보정계수(C_f, Conversion factor) 및 GMO 정량의 정확성 확인을 위해서 Agb0101의 종자로부터 100, 10, 5, 3 및 1% DNA 시료를 조제하여 PCR 분석을 수행하였다.
pRBECrR을 E. coli DH5α로부터 회수하여 제한효소 SmaI으로 절단하고, 0 ~ 2,000,000 copies 범위에서 농도를 단계별로 희석한 후 real-time PCR 분석의 표준물질로 사용하였다.
따라서 Agb0101 벼를 특이적으로 PCR 검출하기 위해서 T-DNA내의 염기서열을 바탕으로 구조 특이적(construct-specific) primer와 T-DNA와 벼 게놈 내 삽입부위 사이의 인접염기서열을 바탕으로 이벤트 특이적(eventspecific) primer를 선발하여 Table 1에 나타내었다. 구조 특이적 primer는 P35S::bar 부위를 증폭하고, 이벤트 특이적 primer는 삽입된 T-DNA의 right 및 left border(RB 및 LB)의 인접염기서열을 증폭하도록 하였다. 벼의 내재유전자로 식물 게놈 내에 단일 copy로 존재하는 전분분지 효소 유전자, RBE4를 작물 검출을 위한 대조 유전자로 사용하여 예상된 크기인 101bp의 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다.
기본적인 정성 PCR 반응액은 한 시료 당 총 25 μL로 하여, 2.5 μL의 10×PCR buffer(Ampliqon, Herlev, Denmark), 2 μL의 dNTP(2.5 mM each, Ampliqon), 1.5 μL의 1.5 mM MgCl2(Ampliqon), 각각 10 μM의 forward와 reverse primer, Taq DNA polymerase는 TEMPase Hot Start DNA polymerase(Ampliqon)를 1.25 unit 첨가하고, 20 ng/μL의 template DNA를 사용하여 반응을 수행하였다.
대조구(NTC, no template control)는 시료 DNA를 넣지 않은 음성대조구로 ColE1/TE DNA용액(5 ng/μL)을 넣어 분석하였다.
Real-time PCR 분석에 의한 표준검량선의 정확성과 보정계수의 확인으로 Agb0101에 대한 정밀분석이 가능할 것으로 판단되었다. 따라서 Agb0101 벼를 1, 3, 5 및 10%농도로 각각 조제하고 real-time PCR 반응을 동일하게 수행하여 정량성을 확인하였다. Table 4에 나타낸 바와 같이 0.
PCR반응에 이용되는 primer 및 probe의 적절한 설계는 민감도 있고 정확한 GM작물의 검정분석을 위해서 매우 중요하다. 따라서 Agb0101 벼를 특이적으로 PCR 검출하기 위해서 T-DNA내의 염기서열을 바탕으로 구조 특이적(construct-specific) primer와 T-DNA와 벼 게놈 내 삽입부위 사이의 인접염기서열을 바탕으로 이벤트 특이적(eventspecific) primer를 선발하여 Table 1에 나타내었다. 구조 특이적 primer는 P35S::bar 부위를 증폭하고, 이벤트 특이적 primer는 삽입된 T-DNA의 right 및 left border(RB 및 LB)의 인접염기서열을 증폭하도록 하였다.
Real-time PCR 분석은 10 ~ 2,000,000 copies 범위에서 단계별 희석하여 얻어진 표준 plasmid의 내재유전자 및 도입유전자에 대한 각 표준검량선(Standard curves)으로부터 산출하였다. 또한 pRBECrR를 표준물질로 한 real-time PCR 분석의 검정 보정계수(C_f, Conversion factor) 및 GMO 정량의 정확성 확인을 위해서 Agb0101의 종자로부터 100, 10, 5, 3 및 1% DNA 시료를 조제하여 PCR 분석을 수행하였다. 보정계수는 내재유전자의 copy수에 대한 도입유전자의 copy 수의 비로 계산되었고, GMO의 혼입율(%)은 다음 식을 이용하여 산출하였다(Toyota et al.
반응용액은 primer 1.25 μM와 TaqMan probe 0.5 μM을 혼합액으로 하고, Brilliant II QPCR Master Mix(Agilent Technologies, USA)와 1:1.25의 비율로 조제하였다.
따라서, 본 연구에서 해충저항성 GM벼의 사후 안전관리를 위한 정성적 및 정량적 PCR 검정 방법을 개발하였다. 벼 녹말분지효소 유전자 RBE4를 PCR 분석의 내재유전자로 사용하였고, 이의 primer쌍 RBEgh-1/-2는 101bp의 PCR 증폭산물을 형성하였다. 정성 PCR 분석을 위해서 삽입된 T-DNA를 바탕으로 특이 primer를 제작하였고, 이벤트 특이적 검출 primer의 경우 Agb0101의 도입유전자 및 벼 염색체 DNA 사이의 5’ 또는 3’ 인접염기부위를 정확하게 특이적으로 PCR 증폭하였다.
식물체의 genomic DNA는 각 시료 1g씩을 취하여 막자사발에서 액체질소를 넣고 분말화 한 후, DNeasy Plant kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop Spectrophotometer ND-1000(NanoDrop Technologies, Inc.
염기서열의 분석은 특이 primer로부터 증폭된 PCR산물을 agarose gel에 전기영동 하고 Gel Extraction kit(Qiagen, USA)로 정제하여 pGEM-T easy vector에 삽입한 후, Escherichia coli strain DH5α로 형질전환 하여 염기서열을 확인하였다.
이와 같이 본 연구에서는 해충저항성 GM벼에 대하여 각종 특이 프라이머를 이용한 검출 특이성을 확인함으로써 정성 PCR 검정법으로 개발하였고, 이벤트 특이적 염기서열을 포함하는 표준 plasmid로 정량 real-time PCR을 수행하여 실제 측정값의 정확성과 정밀성을 갖는 분석법을 도출하였다. 따라서 이의 분석법이 Agb0101에 대한 모니터링 및 사후 이력추적에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
정량 real-time PCR 검정분석을 위해서 RBE4 내재유전자 및 Agb0101의 5’ 삽입 인접염기서열 부위에 대한 TaqMan probe를 제작하여 사용하였다.
해충저항성 GM벼 Agb0101의 real-time PCR 정량분석을 위해서 표준 plasmid을 이용하고자 하였다. 표준 plasmid제작은 벼 내재유전자 primer쌍(RBEgh-1/-2) 및 이벤트 특이적 primer쌍(CrRB-1/-2)으로 증폭된 PCR 산물을 서로 연결하고 T-Vector에 도입하여 제조하였다(Fig. 5). 표준 plasmid, pRBECrR은 검출단편으로 5’ 삽입 인접염기서열이 포함되도록 제작하였기 때문에 이를 이용하여 Agb0101의 이벤트 특이적 정량검정이 가능하다.
해충저항성 GM벼 Agb0101의 검출을 위해서 삽입된 T-DNA의 유전정보를 바탕으로 구조 특이적(construct-specific) primer쌍을 제작하였고, Agb0101만의 특이적인 검출과 이력추적이 가능하도록 도입 T-DNA와 벼 염색체 DNA사이의 5’ 및 3’ 삽입 인접염기서열을 바탕으로 이벤트 특이적(event-specific) primer를 제작하였다.
2009). 형질전환 계통 중 분자생물학적으로 안정하고 수량 및 임실율이 높은 고정계통 C7-1-9-1-1을 우량계통으로 육성하고, GM작물 실용화를 위한 이벤트 Agb0101로 설정하여 인체 및 환경위해성 연구를 수행하였다. 본 실험에서는 C7-1-9-1-1-1(T5 세대)를 해충저항성 GM벼의 PCR 검출을 위한 실험재료로 이용하였다.

대상 데이터

본 실험에서는 C7-1-9-1-1-1(T5 세대)를 해충저항성 GM벼의 PCR 검출을 위한 실험재료로 이용하였다. 대조구로는 Agb0101과 동일한 형질전환 운반체 (Fig. 1)로 낙동벼 및 화영벼에 형질전환하여 선발된 계통들을 PCR 검출 특이성 확인에 사용하였다. 또한, 벼를 포함한 콩, 배추, 감자, 고추, 상추, 참외, 들깨, 토마토, 완두, 피망, 고구마 등 non-GM작물을 이용하였으며, 특히, 국내의 벼 품종으로 간척벼, 계화벼, 그루벼, 금남벼, 금오벼, 금호1호, 금호2호, 낙동벼, 남감벼, 남원벼, 남천벼, 남평벼, 내풍벼, 농안벼, 다산벼, 대립1호, 대산벼, 대안벼, 대야벼, 대진벼, 대청벼, 동안벼, 동진벼, 동해벼, 둔내벼, 만금벼, 봉광벼, 삼백벼, 상산벼, 상주벼, 상주찰벼, 삼천벼, 서안벼, 서진벼, 소백벼, 신선찰벼, 신운봉벼, 장안벼, 조령벼, 주안벼, 중화벼, 진부벼, 진부올벼, 진부찰벼, 진미벼, 청명벼, 추청벼, 아랑향찰, 안산벼, 안중벼, 양조벼, 영남벼, 영해벼, 오대벼, 오봉벼, 운봉벼, 운장벼, 일미벼, 화남벼, 화동벼, 화서벼, 화선찰벼, 화성벼, 화신벼, 화영벼, 화중벼, 향남벼, 향미1호, 향미2호, 탐진벼, 팔공벼등 총 71개 품종을 PCR 검출 특이성 분석의 대조구로 사용하였다.
1)로 낙동벼 및 화영벼에 형질전환하여 선발된 계통들을 PCR 검출 특이성 확인에 사용하였다. 또한, 벼를 포함한 콩, 배추, 감자, 고추, 상추, 참외, 들깨, 토마토, 완두, 피망, 고구마 등 non-GM작물을 이용하였으며, 특히, 국내의 벼 품종으로 간척벼, 계화벼, 그루벼, 금남벼, 금오벼, 금호1호, 금호2호, 낙동벼, 남감벼, 남원벼, 남천벼, 남평벼, 내풍벼, 농안벼, 다산벼, 대립1호, 대산벼, 대안벼, 대야벼, 대진벼, 대청벼, 동안벼, 동진벼, 동해벼, 둔내벼, 만금벼, 봉광벼, 삼백벼, 상산벼, 상주벼, 상주찰벼, 삼천벼, 서안벼, 서진벼, 소백벼, 신선찰벼, 신운봉벼, 장안벼, 조령벼, 주안벼, 중화벼, 진부벼, 진부올벼, 진부찰벼, 진미벼, 청명벼, 추청벼, 아랑향찰, 안산벼, 안중벼, 양조벼, 영남벼, 영해벼, 오대벼, 오봉벼, 운봉벼, 운장벼, 일미벼, 화남벼, 화동벼, 화서벼, 화선찰벼, 화성벼, 화신벼, 화영벼, 화중벼, 향남벼, 향미1호, 향미2호, 탐진벼, 팔공벼등 총 71개 품종을 PCR 검출 특이성 분석의 대조구로 사용하였다.
형질전환 계통 중 분자생물학적으로 안정하고 수량 및 임실율이 높은 고정계통 C7-1-9-1-1을 우량계통으로 육성하고, GM작물 실용화를 위한 이벤트 Agb0101로 설정하여 인체 및 환경위해성 연구를 수행하였다. 본 실험에서는 C7-1-9-1-1-1(T5 세대)를 해충저항성 GM벼의 PCR 검출을 위한 실험재료로 이용하였다. 대조구로는 Agb0101과 동일한 형질전환 운반체 (Fig.
PCR검정의 대조 마커로써 벼 내재유전자의 검출 primer는 RBE4(starch branching enzyme) 유전자의 염기로부터 작성하였다. 본 연구에 이용된 RBE4 유전자는 벼 염색체 내에 단일 copy 유전자로 존재하고 PCR 검정을 위한 내재유전자로 이용되고 있다(Jeong et al. 2007). 정량 real-time PCR 검정분석을 위해서 RBE4 내재유전자 및 Agb0101의 5’ 삽입 인접염기서열 부위에 대한 TaqMan probe를 제작하여 사용하였다.
식물체의 genomic DNA는 각 시료 1g씩을 취하여 막자사발에서 액체질소를 넣고 분말화 한 후, DNeasy Plant kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop Spectrophotometer ND-1000(NanoDrop Technologies, Inc. USA)를 이용하여 260/280 nm 값이 1.8 ~ 2.0 사이인 DNA액을 각 실험의 주형DNA로 사용하였다.

성능/효과

Agb0101벼는 pRBECrR을 이용한 real-time PCR분석에서 비교적 낮은 주형DNA 농도 범위(50 ng/μL)로 충분히 정확성과 정밀성이 있는 분석이 가능한 것으로 확인되었다.
Agb0101의 검출을 위해 제작한 각 primer의 특이성 확인을 위해서 각종 작물에 대한 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응의 결과로, 이벤트 Agb0101의 경우에 구조 특이적 primer쌍 35sBr-1/-2와 RB 및 LB의 인접염기서열을 바탕으로 설계된 두 종의 이벤트 특이적 primer쌍인 CrRB-1/-2 및 CrLB-1/-2가 각각의 예상된 크기인 414 bp, 141 bp 및 127 bp를 명확하게 형성한 반면, non-GM작물의 대조구로 사용한 벼, 배추, 고추, 감자, 상추, 콩, 들깨, 토마토, 참외, 완두, 피망 및 고구마 등에 있어서는 어떠한 PCR 반응산물도 형성하지 않았다. 또한, 벼 내재유전자의 검출을 위한 primer쌍 RBEgh-1/-2는 Agb0101과 non-GM벼인 낙동벼 및 화영벼에서 만 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다(Fig.
coli DH5α로부터 회수하여 제한효소 SmaI으로 절단하고, 0 ~ 2,000,000 copies 범위에서 농도를 단계별로 희석한 후 real-time PCR 분석의 표준물질로 사용하였다. Real-time PCR 반응의 수행으로 얻어진 각 표준물질에 대한 검량선에서 내재유전자 RBE4에 대하여 기울기(slope)와 선형성(R²)은 각각 -3.371와 0.999을 나타냈고, Agb0101의 이벤트 특이적 단편은 기울기와 선형성이 각각 -3.371와 1.000을 보여 두 검량선 모두 98.0% 이상의 높은 검량 효율성을 나타내었다(Fig. 6).
Real-time PCR 분석에 의한 표준검량선의 정확성과 보정계수의 확인으로 Agb0101에 대한 정밀분석이 가능할 것으로 판단되었다. 따라서 Agb0101 벼를 1, 3, 5 및 10%농도로 각각 조제하고 real-time PCR 반응을 동일하게 수행하여 정량성을 확인하였다.
pRBECrR을 이용한 real-time PCR 분석에 대하여 각 표준물질의 분석 감도 및 재현성을 확인한 결과, RBE4는 단계별 농도의 Ct값(fluorescence values)이 17.87 ~ 35.85 내에서 반응하였으며, 표준편차(SD) 및 상대표준편차(RSD)는 각각 0.03 ~ 0.21 및 0.09% ~ 0.78% 범위로 나타났다. 이벤트 특이적 단편에 대해서는 Ct값이 17.
GM작물의 PCR 반응 시 검출 primer가 동일 작물의 품종에 따라 genome 상에 유사 염기서열의 존재로 비특이적인 반응산물을 형성하여 검정의 정확성을 감소시킬 수 있기 때문에 국내 벼 품종에 대한 primer의 특이성을 확인하였다. 그 결과 Figure 3에 나타난 바와 같이, primer쌍 35sBr-1/-2, CrRB-1/-2 및 CrLB-1/-2는 단지 Agb0101에서만 명확한 증폭산물을 나타냈고, 벼 내재유전자의 검출 primer쌍 RBEgh-1/-2는 71개 벼 품종 모든에서 PCR 반응 증폭산물을 형성하였다. 이의 결과는 Agb0101의 검출을 위한 특이 primer가 국내 벼 품종들과 비특이적으로 반응할 수 있는 여타 염기서열을 포함하고 있지 않다는 것을 보여주고 있으며, 추후 다양한 벼 품종에 Agb0101이 혼재되어 있을 경우라도 이들 특이 primer의 이용으로 쉽게 구분할 수 있을 것으로 본다.
2006; Zhang and Guo 2011). 따라서 Agb0101 벼의 정량 분석용 pRBECrR을 제작하였고, 이의 목적하는 내재유전자 및 도입유전자의 단편들이 벡터 내에 삽입되어 있는지 염기서열 분석을 수행한 결과, 예상한 염기서열과 정확하게 일치하는 237 bp의 단편을 확인 하였다(Fig. 5B).
pRBECrR은 표준물질로써 단계별 희석액의 최저 농도인 10 copies에서도 실질적인 농도와 높은 정확성(accuracy)을 나타냄으로써, 이의 농도 범위를 real-time PCR분석에 대한 정량한계(LOQ, limit of quantitation)일 것으로 본다. 또한 pRBECrR에 의한 표준검량선으로부터 해충저항성 GM벼 Agb0101의 내재유전자, RBE4와 도입유전자의 copy 수를 산출하여 real-time PCR 정량분석에 대한 보정계수(Cv, coefficient value)를 확인한 결과 1.06을 나타내었다(Table 3).
5의 측정치가 얻어졌으며 실제값 (true value)에 가까운 수치를 보였다. 또한 측정값과 실제 값의 오차(Bias)가 최대 20% 이하로 나타나 정량분석의 정확성을 보였으며, 각 실험구에 대한 상대표준편차는 3.80 ~ 7.01%의 범위로 매우 낮은 편차를 나타내어 분석의 정밀성(precision)이 확인되었다. Agb0101벼에 대한 분석의 편차값은 옥수수, 콩, 감자 및 벼 등의 기존 보고들 (Kuribara et al.
반면, 계통에 특이적인 primer쌍 CrRB-1/-2 및 CrLB-1/-2의 경우에는 Agb0101에서만 명확한 증폭산물을 나타냈으며, 그 외 계통에서는 PCR 산물을 형성하지 않았다. 또한, 벼 내재유전자의 primer와 이벤트 특이적 primer를 이용한 duplex-PCR 반응에서도 명확하게 Agb0101를 판별할 수 있었다.
PCR 반응의 결과로, 이벤트 Agb0101의 경우에 구조 특이적 primer쌍 35sBr-1/-2와 RB 및 LB의 인접염기서열을 바탕으로 설계된 두 종의 이벤트 특이적 primer쌍인 CrRB-1/-2 및 CrLB-1/-2가 각각의 예상된 크기인 414 bp, 141 bp 및 127 bp를 명확하게 형성한 반면, non-GM작물의 대조구로 사용한 벼, 배추, 고추, 감자, 상추, 콩, 들깨, 토마토, 참외, 완두, 피망 및 고구마 등에 있어서는 어떠한 PCR 반응산물도 형성하지 않았다. 또한, 벼 내재유전자의 검출을 위한 primer쌍 RBEgh-1/-2는 Agb0101과 non-GM벼인 낙동벼 및 화영벼에서 만 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
구조 특이적 primer는 P35S::bar 부위를 증폭하고, 이벤트 특이적 primer는 삽입된 T-DNA의 right 및 left border(RB 및 LB)의 인접염기서열을 증폭하도록 하였다. 벼의 내재유전자로 식물 게놈 내에 단일 copy로 존재하는 전분분지 효소 유전자, RBE4를 작물 검출을 위한 대조 유전자로 사용하여 예상된 크기인 101bp의 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다.
정성 PCR 분석을 위해서 삽입된 T-DNA를 바탕으로 특이 primer를 제작하였고, 이벤트 특이적 검출 primer의 경우 Agb0101의 도입유전자 및 벼 염색체 DNA 사이의 5’ 또는 3’ 인접염기부위를 정확하게 특이적으로 PCR 증폭하였다.
반면, 대조구인 각종 작물, 국내 벼 품종 및 Agb0101과 동일 형질전환 벡터를 갖는 해충저항성 벼에서는 어떠한 PCR 증폭산물도 형성하지 않았다. 표준물질로써 내재유전자 및 이벤트 특이적 단편으로 제조된 pRBECrR을 이용한 real-time PCR 분석에 의해서 정량한계(LOQ)가 10 copies 농도의 범위인 것으로 확인되었고, 이의 유효성을 검증하기 위하여 상이한 농도의 Agb0101시료(10, 5, 3 및 1%)를 real-time PCR 분석하여 정량검정에 대한 표준편차 및 상대표준편차가 각각 0.06~ 0.40 및 3.80 ~ 7.01%의 낮은 범위에 포함되는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과로 본 연구에서 개발된 정성 및 정량 PCR 검정 방법이 해충저항성 GM벼 Agb0101의 모니터링 및 이력추적에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 본다.

후속연구

이와 같이 본 연구에서는 해충저항성 GM벼에 대하여 각종 특이 프라이머를 이용한 검출 특이성을 확인함으로써 정성 PCR 검정법으로 개발하였고, 이벤트 특이적 염기서열을 포함하는 표준 plasmid로 정량 real-time PCR을 수행하여 실제 측정값의 정확성과 정밀성을 갖는 분석법을 도출하였다. 따라서 이의 분석법이 Agb0101에 대한 모니터링 및 사후 이력추적에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
01%의 낮은 범위에 포함되는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과로 본 연구에서 개발된 정성 및 정량 PCR 검정 방법이 해충저항성 GM벼 Agb0101의 모니터링 및 이력추적에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 본다.
2012). 이상의 각종 특이 primer를 이용한 PCR의 결과로부터 확인한 바와 같이 본 연구에서 개발된 정성 PCR 검정방법은 이벤트 Agb0101가 실용화 되어 재배 또는 유통 시 GMO의 모니터링 및 이력추적을 위해서 정확하고 효율적인 판별법으로 이용될 수 있을 것이다.
그 결과 Figure 3에 나타난 바와 같이, primer쌍 35sBr-1/-2, CrRB-1/-2 및 CrLB-1/-2는 단지 Agb0101에서만 명확한 증폭산물을 나타냈고, 벼 내재유전자의 검출 primer쌍 RBEgh-1/-2는 71개 벼 품종 모든에서 PCR 반응 증폭산물을 형성하였다. 이의 결과는 Agb0101의 검출을 위한 특이 primer가 국내 벼 품종들과 비특이적으로 반응할 수 있는 여타 염기서열을 포함하고 있지 않다는 것을 보여주고 있으며, 추후 다양한 벼 품종에 Agb0101이 혼재되어 있을 경우라도 이들 특이 primer의 이용으로 쉽게 구분할 수 있을 것으로 본다.
살충성 유전자 mcry1Ac1을 포함하고 있는 해충저항성 유전자변형(GM) 벼 Agb0101이 국내에서 개발되었다. 향후 Agb0101 벼의 환경방출에 따른 모니터링과 이력추적을 위해서는 신뢰성 있는 검출방법의 개발이 필요하다. 따라서, 본 연구에서 해충저항성 GM벼의 사후 안전관리를 위한 정성적 및 정량적 PCR 검정 방법을 개발하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	국제생명공학응용정보서비스에 따르면 2011년 기준 전 세계적으로 유전자변형 작물은 어느정도 재배되었는가?	국제생명공학응용정보서비스(ISAAA)에 따르면 전 세계적으로 유전자변형(genetically modified, GM) 작물은 2011년 29개 국가에서 1억6,000만 헥타르가 재배되어, 1996년에 상업적인 재배를 시작한 이후보다 무려 94배 증가한 것으로 재배면적이 급속히 확대되고 있음을 보여주고 있다(James 2011). 최근에는 기존의 제초제저항성, 해충저항성 등 농업적 재배 이득이 강한 작물의 개발에서, 영양성분 개선, 에너지 생산, 의약품 생산, 환경오염 개선 등 인류의 직면한 문제해결을 위한 방향으로 생명공학작물의 개발이 이루어지고 있다.
	최근 유전자변형 작물의 개발 방향은 어떠한가?	국제생명공학응용정보서비스(ISAAA)에 따르면 전 세계적으로 유전자변형(genetically modified, GM) 작물은 2011년 29개 국가에서 1억6,000만 헥타르가 재배되어, 1996년에 상업적인 재배를 시작한 이후보다 무려 94배 증가한 것으로 재배면적이 급속히 확대되고 있음을 보여주고 있다(James 2011). 최근에는 기존의 제초제저항성, 해충저항성 등 농업적 재배 이득이 강한 작물의 개발에서, 영양성분 개선, 에너지 생산, 의약품 생산, 환경오염 개선 등 인류의 직면한 문제해결을 위한 방향으로 생명공학작물의 개발이 이루어지고 있다. 국내에서 GM농산물은 재배 목적이 아닌 식품, 사료 및 이의 가공목적으로 2011년 기준 총 7,853천 톤(식용 1,875천 톤 및 사료용 5,978천 톤)이 수입 승인되었다(KBCH Database, htt://www.
	mcry1Ac1은 무엇인가?	살충성 유전자 mcry1Ac1을 포함하고 있는 해충저항성 유전자변형(GM) 벼 Agb0101이 국내에서 개발되었다. 향후 Agb0101 벼의 환경방출에 따른 모니터링과 이력추적을 위해서는 신뢰성 있는 검출방법의 개발이 필요하다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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