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문제 정의
- 따라서 이번 연구의 목적은 이런 단점을 개선하기 위해서 GenieⓇ II (OptiGene, UK) 장비를 이용하여 M. tuberculosis에만 존재하는 12.7-kb 절편부위로 M. bovis와 M. tuberculosis를 감별할 수 있는 LAMP assay를 개발하였으며, 소의 림프절 시료와 분리된 결핵균주에 적용하였다.
제안 방법
- LAMP 반응액은 1.6 μM의 FIP와 BIP, 0.2 μM의 F3와 B3, 0.4 μM의 FLP와 BLP, 1 μl의 template DNA 그리고 Isothermal Master Mix (OptiGene, UK) 12 μl를 첨가하고 총반응액은 20 μl가 되도록 증류수로 조절 하였다.
- M. bovis 유전자가 M. tuberculosis에 존재하는 12.7-kb 절편이 결여된 부위는 RD 7 부분에 해당하고 이번 연구에서는 LAMP assay로 이들 결핵균을 감별하기 위해서 BIP와 B3는 각각의 primer를 사용하였다. 그리고 F3, FIP, FLP, BLP는 M.
- M. bovis에 대한 LAMP의 검출한계 검사를 위해서 DNA를 10 ng/μl로 정량한 후 10배 계단 희석하여 실험하였다.
- M. bovis와 M. tuberculosis 감별을 위한 oligonucleotide 디자인은 Zumárraga 등(1999)이 보고한 M. bovis의 고유한 연속된 229-bp의 염기서열을 분석하여 M. bovis AF2122/97 전체 유전자서열(accession No. BX248339)과 M. tuberculosis에 특이적인 12.7-kb 절편 부위(accession no. BX842576)를 분석하여 Tomita 등(2008)의 방법과 PrimerExplorer V4 프로그램(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index. html)을 이용하여 primer (F3, B3, FIP 및 BIP)를 설계하였으며, 2개의 loop primer (FLP, BLP)는 직접 설계하였다(Table 1).
- M. bovis의 DNA를 10 ng/μl부터 10배 계단 희석하여 65°C와 67°C 조건에서 LAMP assay의 검출한계를 실험하였다.
- html)을 이용하여 primer (F3, B3, FIP 및 BIP)를 설계하였으며, 2개의 loop primer (FLP, BLP)는 직접 설계하였다(Table 1). Primer는 Bioneer (Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, FIP와 BIP는 HPLC 정제를 하였다. Primer는 표적 DNA에 대해서 Fig.
- bovis의 표준균주에 대한 LAMP assay에서 검출시간은 20분 이내이었지만, 육아종성 림프절 시료에서 추출한 template DNA에는 우결핵과 조직의 유전자가 혼재되어 있기 때문에 반응시간이 다소 지연되었다. 다만 이번 실험에 사용된 Isothermal Master Mix(OptiGene, UK)는 40분을 초과하여 실험하면 비특이적인 증폭산물이 생성되기 때문에 LAMP assay 반응시간을 30분으로 제한하였다. 그리고 임상시료의 template DNA는 다양한 유전자가 혼재되어 있기 때문에 LAMP peak가 표준균주에 비해 정상적인 증폭곡선(Fig.
- 따라서 이번 연구에서 림프절 시료에 대한 온도조건은 65°C에서 LAMP assay를 수행하였다.
- II (OptiGene, UK)을 이용하여 이중 나선 DNA에 형광물질 결합여부를 여기파장 488 nm, 방출파장 520 nm에 측정하였다. 반응시간은 30분이며, 이후 PCR 반응액을 95℃로 상승시킨 후 80oC까지 낮추면서 증폭산물의 re-annealing 온도를 측정하였다. 증폭결과는 GenieⓇ II software (Ver.
- 분리배양: 2010년부터 2012년까지 광주지역 도축장에서 발견된 소의 육아종성 림프절 병변 24개 시료로부터 결핵균 분리 배양을 위해서 Koh 등(2011) 방법에 따라 균질화된 시료 100 μl를 Lowenstein-Jensen (LJ) 배지에 접종하여 37℃에서 3∼6주 동안 배양하면서 균 발육을 관찰하였다.
- 소 결핵균(M. bovis)을 포함한 항산성 균주 10주와 E. coli 등 병원성 세균 10주에서 추출된 DNA를 대상으로 LAMP assay의 특이성 실험은 65°C에서 수행하였다.
- 이번 연구에서 M. bovis와 M. tuberculosis를 감별할 수 있는 LAMP assay를 개발하였고, 이를 이용하여 육안적으로 확인된 소의 육아종성 림프절 24건과 정상 림프절 32건의 시료와 육아종성 림프절에서 분리된 결핵균 21주에 대해서 진단 기법의 활용성을 평가하였다. M.
- 또한, Mori 등(2006)은 FITC와 ROX와 같은 형광물질로 표지된 probe를 첨가하여 LAMP 증폭산물에 양이온 물질인 polyethylenimine (PEI)를 첨가하여 두 개의 표적 DNA를 동시에 시각화하였다. 이번 연구에서는 DNA 증폭 부산물에서 유래한 탁도 형성을 억제하는 상품화된 premix 제품과 GenieⓇ II (OptiGene, UK) 기기로 결핵균 증폭 여부를 실시간으로 확인할 수 있었다.
대상 데이터
- LAMP는 GenieⓇ II (OptiGene, UK)을 이용하여 이중 나선 DNA에 형광물질 결합여부를 여기파장 488 nm, 방출파장 520 nm에 측정하였다. 반응시간은 30분이며, 이후 PCR 반응액을 95℃로 상승시킨 후 80oC까지 낮추면서 증폭산물의 re-annealing 온도를 측정하였다.
- 1. The 229-bp contiguous sequences of M. bovis (accession No. BX248339) was used to design the six primers. The sequences of the LAMP primer sites are in rectangles.
- 공시 균주: 이번 연구에 이용한 10종의 결핵균은 M. bovis AN5, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. fortuitum, M. phlei, M. peregrinum, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. kansasii이며, 이들 균주는 농림축산검역본부에서 보유하고 있는 DNA를 사용하였으며, 이들 균주에 대한 LAMP 특이성 검사는 농림축산검역본부에서 수행하였다. 다른 병원성 세균 10종은 E.
- 1과 같이 loop primer (FLP, BLP)를 제외한 네개의 primer가 각기 다른 여섯 개 부위와 특이적으로 결합한다. 이번 연구에 사용된 F3, FIP, FLP, BLP는 M. bovis와 M. tuberculosis와 공통으로 사용되도록 설계하였다.
- 임상시료: 2010년부터 2012년까지 광주지역 도축장에서 발견된 소의 육아종성 림프절 병변 24건과 정상 림프절 32건을 LAMP assay 실험에 사용하였다.
- 최적의 온도조건을 찾기 위하여 60∼67℃ 범위에서 1℃ 차이로 7개 온도구역을 설정하였고, 사용된 균주는 M. bovis AN5를 template DNA로 이용하였다.
이론/모형
- coli 등 병원성 세균 10종은 균주별 배양액을 끓는 물에 15∼20분 처리한 후 원심분리하여 상층액을 실험에 사용하였다. 림프절 시료와 LJ 배지에서 분리 배양한 결핵균의 DNA 추출은 Koh 등(2011)의 방법에 따랐다. Proteinase K 처리 후 결핵균 사멸을 위해 95oC에서 5분간 처리하였다.
성능/효과
- 60°C에서 67°C까지 온도구배에 따른 최단시간에 결핵균을 검출할 수 있는 온도는 67°C이었고, 검출시간은 10분 11초였다.
- M. bovis에 대한 LAMP assay 증폭산물에 대한 melting temperature (Tm)를 측정한 결과 87.3±0.1oC이었다(Fig. 5).
- M. bovis와 M. tuberculosis에 대한 LAMP assay의 특이성은 100%이었고, M. bovis 검출한계는 10 fg/μl이었다.
- M. bovis의 표준균주에 대한 LAMP assay에서 검출시간은 20분 이내이었지만, 육아종성 림프절 시료에서 추출한 template DNA에는 우결핵과 조직의 유전자가 혼재되어 있기 때문에 반응시간이 다소 지연되었다. 다만 이번 실험에 사용된 Isothermal Master Mix(OptiGene, UK)는 40분을 초과하여 실험하면 비특이적인 증폭산물이 생성되기 때문에 LAMP assay 반응시간을 30분으로 제한하였다.
- bovis 검출한계는 10 fg/μl이었다. 결핵병변을 보이는 조직시료에 적용한 결과 균 분리율은 87.5% (21/24)이었으나, LAMP assay 적용결과 M. bovis 유전자를 100% 검출하였다. 따라서 이번 연구에서 개발된 LAMP assay는 소 림프절에 존재하는 M.
- 3B, 4B). 그리고 LAMP assay를 이용한 M. bovis의 검출시간은 20분 이내에 확인이 가능하였다(Fig. 3, Table 2). 따라서 이번 연구에서 림프절 시료에 대한 온도조건은 65°C에서 LAMP assay를 수행하였다.
- bovis로 확인되었다. 그리고 소의 육아종성 림프절 24건은 LAMP assay에서 모두 M. bovis가 검출되었으며, 정상 림프절 32건은 모두 음성이었다(Table 4).
- 세 번째 LAMP assay을 위한 spectrofluorimeter 등 다양한 기기들이 소개되고 있다(Ahmed 등, 2010; Gandelman 등, 2010; Tong 등, 2008). 그리고 이번 연구에서는 이전 Bst DNA polymerase보다 증폭속도가 개선된 Gsp DNA polymerase가 포함되어 있으면서 일반 PCR처럼 제품화된 premix 제품을 사용하였기 때문에 여러 가지 시약을 제조해야 되는 불편한 점이 개선되었다. 또한, 이 제품은 LAMP assay 후 증폭용기를 개방하여 발색시약을 첨가할 필요가 없으므로 실험실 오염방지에 매우 유용하였다.
- 도축장에서 발견된 소의 육아종성 림프절 병변 24개 시료 중 21건에서 결핵균이 분리되었으며, M. bovis와 M. tuberculosis에 대한 LAMP assay 실험결과 21개 분리주 모두 M. bovis로 확인되었다. 그리고 소의 육아종성 림프절 24건은 LAMP assay에서 모두 M.
- 따라서 이번 연구에서 사용된 모든 template DNA는 96oC에서 3분간 변성과정을 거친 후 LAMP 반응액에 첨가하여 실험하였고, M. bovis의 검출한계는 10 fg/μl 즉, 2 genome에 상당하는 DNA 농도였다.
- 그리고 이번 연구에서는 이전 Bst DNA polymerase보다 증폭속도가 개선된 Gsp DNA polymerase가 포함되어 있으면서 일반 PCR처럼 제품화된 premix 제품을 사용하였기 때문에 여러 가지 시약을 제조해야 되는 불편한 점이 개선되었다. 또한, 이 제품은 LAMP assay 후 증폭용기를 개방하여 발색시약을 첨가할 필요가 없으므로 실험실 오염방지에 매우 유용하였다.
- 4A). 이들 두 가지 온도조건에 대한 전기영동 결과 사다리 모양의 LAMP assay 증폭산물이 확인되었으며, 검출한계도 실시간 그래프와 일치하였다(Fig. 3B, 4B). 그리고 LAMP assay를 이용한 M.
- 기존의 PCR은 한번에 많은 시료를 검사할 수 있으며, 동시에 두 개 이상의 표적 유전자를 검출할 수 있는 장점이 있다. 이번 연구에 사용된 LAMP assay에는 값비싼 시약과 고가의 장비가 필요하고 1회 처리건수가 16건으로 다소 제약은 있었지만, 기기를 이용한 객관적인 결과 판정, 간소화된 실험방법, 검사시간 단축 그리고 전기영동을 할 필요가 없다는 장점이 있었다.
- 이번 연구에서 M. bovis의 검출한계는 10 fg/μl 즉, 2 genome에 상당하는 DNA 농도로 이들 연구결과와 대등하거나 보다 우수하였다.
- 이번 연구에서, 도축장에서 발견된 육아종성 림프절 시료 24건 중 21건에서 결핵균을 분리하는데 4주 이상의 시간이 필요하였고 분리율은 87.5%이었지만, LAMP assay에서는 신속하게 모든 시료에서 M. bovis DNA가 검출되었다. 기존의 PCR은 한번에 많은 시료를 검사할 수 있으며, 동시에 두 개 이상의 표적 유전자를 검출할 수 있는 장점이 있다.
- 제조사에서 제시한 LAMP 실험의 최적 온도조건은 65°C로 이때 우결핵 검출된 시간은 11분 19초로 67°C일 때보다 약 1분 정도 지연되었다(Fig. 2).
- LAMP assay는 현재 다양한 방법으로 개선되고 있다. 첫 번째 Gandelman 등(2011)이 제시한 stem-LAMP에서 stem primer를 loop primer와 병용하거나 loop primer 설계가 곤란할때 대체하여 사용함으로써 속도, 민감도 그리고 재현성이 동시에 향상됨을 입증하였다. 두 번째 다른 실험법과 병용한 신속한 검출과 multiplex 기능으로 진화되어 가고 있다(Jung 등, 2010; Liang 등, 2012).
후속연구
- 국내에서 2010년 이후 매년 1,100여 두 이상 한․육우에서 우결핵이 검색되고 있으며, 이들 감염개체 중일부분은 도축장에서 발견되고 있기 때문에, 이번 연구에서 개발된 LAMP assay가 도축장에서 결핵병을 검사하는데 유용하게 활용될 수 있다. 그리고 M.
- 국내에서 2010년 이후 매년 1,100여 두 이상 한․육우에서 우결핵이 검색되고 있으며, 이들 감염개체 중일부분은 도축장에서 발견되고 있기 때문에, 이번 연구에서 개발된 LAMP assay가 도축장에서 결핵병을 검사하는데 유용하게 활용될 수 있다. 그리고 M. bovis와 M. tuberculosis를 감별할 수 있으며, 동물 임상시료에 존재하는 M. bovis를 신속하게 검출해낼 수 있었을 뿐만 아니라 사람 결핵 진단에도 매우 유용하게 사용될 것으로 생각한다.
- 다만 이번 실험에 사용된 Isothermal Master Mix(OptiGene, UK)는 40분을 초과하여 실험하면 비특이적인 증폭산물이 생성되기 때문에 LAMP assay 반응시간을 30분으로 제한하였다. 그리고 임상시료의 template DNA는 다양한 유전자가 혼재되어 있기 때문에 LAMP peak가 표준균주에 비해 정상적인 증폭곡선(Fig. 2)처럼 보이지 않거나 높이가 낮으면 반드시 Tm값을 확인할 것을 권장한다.
- bovis 유전자를 100% 검출하였다. 따라서 이번 연구에서 개발된 LAMP assay는 소 림프절에 존재하는 M. bovis를 신속․정확하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 의학적 진단에 매우 유용하게 사용될 것으로 생각한다.
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