결핵은 전 세계적으로 심각한 공중보건문제로 남아있다. 최근에는 결핵의 발병률이 증가하고 있는 추세이며 이에 따른 결핵의 정확한 조기치료와 심각한 부작용, 그리고 전염을 방지하기 위해서는 신속하고 정확한 결핵의 진단이 절실하게 필요하다. 본 연구에서는 결핵유전자를 빠르게 검출하는데 있어서 등온증폭법이 가지고 있는 높은 특이성과 신속성에 대하여 평가하였다. 결핵 DNA의 순차적 10배위 정량희석 DNA를 사용하였으며 일반PCR 방법과 등온증폭법의 실험방법의 검출한계, 민감성, 특이성, 재현성을 비교하였다. 그 결과 등온 증폭법은 빠른 증폭 시간과 높은 민감성, 높은 특이성을 가지고 있었으며 병원이나 연구실, 진단 검사실 등에서 결핵유전자를 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 유용한 방법이 될 수 있을 것이다.
결핵은 전 세계적으로 심각한 공중보건문제로 남아있다. 최근에는 결핵의 발병률이 증가하고 있는 추세이며 이에 따른 결핵의 정확한 조기치료와 심각한 부작용, 그리고 전염을 방지하기 위해서는 신속하고 정확한 결핵의 진단이 절실하게 필요하다. 본 연구에서는 결핵유전자를 빠르게 검출하는데 있어서 등온증폭법이 가지고 있는 높은 특이성과 신속성에 대하여 평가하였다. 결핵 DNA의 순차적 10배위 정량희석 DNA를 사용하였으며 일반PCR 방법과 등온증폭법의 실험방법의 검출한계, 민감성, 특이성, 재현성을 비교하였다. 그 결과 등온 증폭법은 빠른 증폭 시간과 높은 민감성, 높은 특이성을 가지고 있었으며 병원이나 연구실, 진단 검사실 등에서 결핵유전자를 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 유용한 방법이 될 수 있을 것이다.
Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major worldwide public health problem. In recent years, the incidence of MTB has been rising. Rapid and reliable diagnosis of Mycobacterium tuberculosis is essential to initiate correct treatment, avoid severe complications, and prevent transmission. LAMP w...
Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major worldwide public health problem. In recent years, the incidence of MTB has been rising. Rapid and reliable diagnosis of Mycobacterium tuberculosis is essential to initiate correct treatment, avoid severe complications, and prevent transmission. LAMP was used to develop a rapid and sensitive laboratory diagnostic system for the MTB. In this research, the loop-mediated isothermal amplification method (LAMP) that amplifies DNA with high specificity and rapidity at an isothermal condition was evaluated for rapid detection of MTB. Undiluted DNA (2.10 × 106 copy/mL), 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 and 10-6 (copy/mL) of MTB DNA were amplified by PCR and LAMP to determine the sensitivity of the assay. At results, the LAMP assay reported here has the advantages of rapid amplification, high sensitivity, and high specificity and will be useful for rapid and reliable clinical diagnosis of MTB in hospital clinical laboratory.
Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major worldwide public health problem. In recent years, the incidence of MTB has been rising. Rapid and reliable diagnosis of Mycobacterium tuberculosis is essential to initiate correct treatment, avoid severe complications, and prevent transmission. LAMP was used to develop a rapid and sensitive laboratory diagnostic system for the MTB. In this research, the loop-mediated isothermal amplification method (LAMP) that amplifies DNA with high specificity and rapidity at an isothermal condition was evaluated for rapid detection of MTB. Undiluted DNA (2.10 × 106 copy/mL), 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 and 10-6 (copy/mL) of MTB DNA were amplified by PCR and LAMP to determine the sensitivity of the assay. At results, the LAMP assay reported here has the advantages of rapid amplification, high sensitivity, and high specificity and will be useful for rapid and reliable clinical diagnosis of MTB in hospital clinical laboratory.
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문제 정의
본 저자는 앞으로 등온증폭법의 검출 한계를 넓혀서 현 결과보다 더 낮은 copy수의 주형 DNA에서도 검출 가능한 조건을 확립할 계획이며 결핵 균 이외에도 살모넬라, 브루셀라, 바실러스 시리우스, 스타필로코커스 등 다양한 병원성 미생물에 적용할 계획이다. 또한 결핵균 진단이 필요한 현장 및 기타 장소에서도 실험을 시행하여 임상 진단 시스템으로 사용 할 수 있도록 할 것이며, 진단시간을 획기적으로 단축 시켜 병원성 미생물의 조기 검출의 새로운 대안을 제시하고자 한다.
본 연구에서는 결핵의 주요 원인균인 인형 Mycobacterium tuberculosis DNA를 등온증폭법을 이용하여 검출하여 이를 기존 PCR법과 비교하여 보고자 한다. 또한 등온증폭법의 검출한계와 재현성, 분석 시간에 대한 실험을 통하여 그 최적조건을 확립하고 결핵균 검출에 등온증폭법을 이용할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.
본 연구에서는 결핵의 주요 원인균인 인형 Mycobacterium tuberculosis DNA를 등온증폭법을 이용하여 검출하여 이를 기존 PCR법과 비교하여 보고자 한다. 또한 등온증폭법의 검출한계와 재현성, 분석 시간에 대한 실험을 통하여 그 최적조건을 확립하고 결핵균 검출에 등온증폭법을 이용할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.
제안 방법
1.5%(w/v) agarose gel을 이용하여 Mupid-a(Advance, Japan) 전기 영동장치로 PCR 산물을 분석하였다. Agarose 1.
DNA 추출 후 PCR primer set(Table 1) 및 LAMPprimer set(Table 2)을 이용하여 유전자를 증폭시킨 후 정제를 거쳐 DNA 염기서열분석법(ABI 3730xl DNA analyser) 을 통하여 인형 (Mycobacterium tuberculosis) 결핵균의 rpoB DNA를 최종 확인하였다.
Table 1의 PCR primer set를 이용하여 각 시료의 증폭 산물을 얻었다. 각각 25 pL의 반응 용액(Table 2)을 0.2 mL 반응 튜브에 넣은 후, GeneAmpPCR System 2700 (Applied Biosystems, USA)을 이용해 DNA를 증폭(Table 3)시켰다.
단국대학교병원에서 결핵으로 진단된 환자로부터 분리된 인형 (Mycobacterium tuberculosis) 결핵 균주를 대상으로 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 증폭하고자 하는 부위의 DNA 단편을 real-time PCR을 이용하여 등온증폭방법을 사용하여 증폭하고자 하는 부위의 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭산물을 정제하여 sequencing후 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 이용하여 확인한 결과 인형(Mycobacterium tuberculosis)결핵균의 rpoB 유전자가 증폭됐음을 확인하였다.
그 후에 gel을 떼어내어 EtBr(ethidium bromide)로 10 분간 염색하고 다시 10 분간 증류수로 DNA와 결합하지 못한 EtBr을 씻어냈다. 마지막으로 UV transilluminator 위에 agarose gel을 올려놓고 PCR 여부를 확인하였다.
인형 (Mycobacterium tuberculosis)결핵균 DNA(2.1 x 106copy/mL)을 일반 PCR방법과 등온증폭법을 이용하여 한번에 6개의 동일 시료를 30번 반복 시행하여 각 실험간 재현성을 테스트 하였다. 실시간 모니터링 시스템은 master mix속에 들어있는 SYBR Green I 이 DNA 이중나선 사이로 결합되어 나타나는 형광을 측정함으로써 Ct와 Tm을 알 수 있고 이를 통해 시료의 농도, 증폭여부 및 종을 확인 할 수 있다.
인형 (Mycobacterium tuberculosis)결핵균 DNA(2.10x 10%opy/mL)을 일반 PCR방법과 등온증폭법을 이용하여 한번에 6개의 동일 시료를 30번 반복 시행하여 각 실험간 재현성을 테스트 하였다.
인형(Mycobacterium tuberculosis) 결핵 균주에서 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 rpoB 유전자 부위를 증폭을 시킨 후 증폭된 DNA를 전기 영동법에 의해 확인하였고 이를 정제하였다. 정제된 증폭산물이 결핵균 DNA가 맞는지 최종적으로 확인하기 위해서 DNA 염기서열분석법을 시행하였다.
인형(Mycobacterium tuberculosis) 결핵 균주에서 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 rpoB 유전자 부위를 증폭을 시킨 후 증폭된 DNA를 전기 영동법에 의해 확인하였고 이를 정제하였다. 정제된 증폭산물이 결핵균 DNA가 맞는지 최종적으로 확인하기 위해서 DNA 염기서열분석법을 시행하였다.
Table 4의 등온증폭 반응 primer set를 이용하여 각 시료의 증폭산물을 얻었다. 총 20 pL의 등온증폭 반응용액(Table 5)은 premix 18.5 pL오｝ DNA 1.5 pL로 구성되었으며 premix는 한번에 제조하여 0.2 mL PCR 반응 튜브에 18.5 卩L씩 동량 분주한 후, DNA를 첨가하여 Table 6의 등온 증폭법을 이용해서 DNA를 증폭(Table 6)시켰다.
대상 데이터
결핵균에서 DNA 추출에는 PrimePrep™ Genomic DNA Isolation Kit(GeNet Bio, Korea)를 사용하였고, 전기영동의 agarose는 QA-Agaros^M(Q-bio gene, USA)을 이용하였다.
본 연구에서는 단국대학교병원의 결핵으로 진단된 환자에서 분리된 인형 (Mycobacterium tuberculosis) 결핵 균주를 대상으로 하였다.
이론/모형
3. Detection limit of rpoB gene using LAMP assay. Varying dilutions of the rpoB gene genomic DNA ranging undiluted DNA to 10° were used for the reactions.
결핵의 진단방법으로는 tuberculin 반응, 흉부 X선 촬영, ROREKA 도말 검사, 면역학적 검사에 의하여 진단한다. 현재 결핵을 진단하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법에서는 여러 종류의 유전자 부위를 사용하고 있는데 일반적으로 IS6110과 rpoB gene, hsp65 gene 등이 이용되고 있다.
성능/효과
General PCR에 사용된 primer와 등온증폭법에 사용된 primer 중 forward 와 reverse만을 사용하여 얻은 증폭산물을 정제하여 sequencing 한 결과 결핵균임을 확인하였다(Fig. 4).
검출 가능한 농도 범위 테스트 결과는 일반 PCR의 경우는 2.10씨03~2.10씨06 copy/mL의 범위내에서 검출되었고, 등온증폭법의 경우는 2.10x10~2.10x106copy/mL의 범위내에서 검출되어 등온증폭법이 일반 PCR의 경우보다 더 높은 검출 한계를 가지고 있음을 알 수 있었다.
등온 증폭법에 사용된 primer 중 forward 와 reverse primer만을 이용해 얻은 DNA증폭산물을 염기서열분석법 (ABI 3730刈 DNA analyser, Applied Biosystem, USA)으로분석하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 비교 후 결핵군임을 확인하였다.
인형 (Mycobacterium tuberculosis) 균 DNA 원액(2.10x10'copy/mL)을 단계희석을 하여 2.10乂10'~ 2.10x10° copy/mL의 농도에서 검출 테스트를 한 결과 등온증폭법 에서 농도별 Ct 값의 간격 이 3~4 cycle을 유지하며 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 7).
이 특정 온도를 이용하여 타겟 DNA가 맞는지 확인할 수 있다. 재현성 테스트 결과 General PCR의 경우 2.1乂106~2.1x103 copy/mL 에서만 증폭을 확인할 수 있었고, 등온증폭법의 경우는 88.3 ± 0.7C와 18.5 ± 0.4 cycle로 나타났다(Table 7, Fig. 5, 6).
단국대학교병원에서 결핵으로 진단된 환자로부터 분리된 인형 (Mycobacterium tuberculosis) 결핵 균주를 대상으로 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 증폭하고자 하는 부위의 DNA 단편을 real-time PCR을 이용하여 등온증폭방법을 사용하여 증폭하고자 하는 부위의 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭산물을 정제하여 sequencing후 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 이용하여 확인한 결과 인형(Mycobacterium tuberculosis)결핵균의 rpoB 유전자가 증폭됐음을 확인하였다.
후속연구
본 저자는 앞으로 등온증폭법의 검출 한계를 넓혀서 현 결과보다 더 낮은 copy수의 주형 DNA에서도 검출 가능한 조건을 확립할 계획이며 결핵 균 이외에도 살모넬라, 브루셀라, 바실러스 시리우스, 스타필로코커스 등 다양한 병원성 미생물에 적용할 계획이다. 또한 결핵균 진단이 필요한 현장 및 기타 장소에서도 실험을 시행하여 임상 진단 시스템으로 사용 할 수 있도록 할 것이며, 진단시간을 획기적으로 단축 시켜 병원성 미생물의 조기 검출의 새로운 대안을 제시하고자 한다.
참고문헌 (22)
Simon A.; Watterson, Stuart M.; J. Cli. Microbiology. 1998. 1969
Bodmer, T.; J. Antimicrob. Chemother. 1995, 35, 345
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