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문제 정의
- 본 연구에서는 GC/MS에 의한 혈액중 스트리크닌의 분석법을 확립하고 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율 등을 검증하여 유효화하였으며, 실제 스트리크닌의 검출사례로 화재사로 사망한 부검사례에서 심장혈액, 말초혈액 등 실제 법과학검체에 대한 스트리크닌의 분석결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 가스크로마토그라프/질량스펙트럼(GC/MS) 분석은 Agilent 5973N(USA) GC/MS를 이용하였으며, GC/MS 분석조건은 Table I 과 같이 Inlet 온도 260℃에서 Injection volume 1 µl를 주입하였고, 이온화는 EI mode를 사용하였으며, MS source 온도 230℃, Quadrupole 온도 150℃, mass range는 m/z 50-650에서 측정하였다.
- 검량선은 시험관에 공시험용 혈액 1ml에 각각 스트리크닌 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 5, 10 µg을 첨가하여 실온에서 30분간 방치한 다음, 이어서 SPE 방법으로 추출하여 농축하고, GC/MS에 주입하여 얻은 크로마토그람에서 스트리크닌의 경우 m/z 334을 선택하고, 내부표준물질의 경우 m/z 271을 선택하여 SIM 크로마토그램을 구하여 내부표준물질에 대한 피크면적비를 구하여 작성하였다.
- 검출한계(LOD) 및 검량한계(LOQ) − 검출한계(LOD)는 시험관에 스트리크닌 표준용액 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l을 각각 100 µl씩을 취하여 Scheme 1에 따라 조제하여 GC/MS에 주입하여 얻은 검량선에 1 mg/l 스트리크닌용액 100 µl씩 첨가하여 전술한 방법으로 10개의 시료를 준비한 후 GC로 측정한 다음 계산된 스트리크닌 농도의 표준편차(s)를 계산하여 S/N=3에서 표준편차의 3배로 결정하였고, S/N=10에서 표준편차의 10배 값을 정량한계(LOQ)로 하였다.
- 분석법의 유효화는 스트리크닌이 검색되지 않은 공혈액을 사용하여 검량선 범위, 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 시험내 정밀도(intraday precision), 시험간 정밀도(interday precision), 정확도(accuracy), 회수율을 검토하였다.
- 분석법의 유효화는 혈액을 사용하여 직선성, 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 시험내 정밀도(intraday precision), 시험간 정밀도(interday precision), 정확도(accuracy)를 검토하고, 혈액을 사용하여 회수율을 검증하였으며, Table II 및 Table III에 나타내었다.
- 변사자는 경제적인 문제로 아내와 떨어져 딸과 생활하던 중, 2009년 8월 경기도 ○○시 옥상 가건물에서 화재가 난 것을 제 3의 목격자가 119 신고하여 화재진압 후 소방관에 의해 사망한 상태로 방에서 발견되었다. 사인규명을 위하여 국립과학수사연구소에서 법의부검을 시행하였고, 특기할만한 외부소견이나 장기조직의 병변을 보지 못하는 등의 부검소견이 있었으며, 이에 생체시료인 혈액 및 위내용물중 약독물검사를 시행하였다.
- 시험간 정밀도는 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 첨가하여 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l으로 조제한 다음 Bond Elut Certify cartridge를 이용하는 고상추출법으로 18회 반복시험을 하여 3일 동안 연속적으로 시험하여 이의 CV%를 계산하였을 때 각각 24.0%, 18.5%, 13.8%이었다(n=18).
- 시험간 정밀도는 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 취하여 6회 반복시험을 하여 3일 동안 연속적으로 시험하여 얻은 결과값을 검량선에 적용하여 스트리크닌의 측정값을 산출하여 이의 CV%를 계산하여 검증하였다.
- 시험관에 생체시료인 혈액 또는 위내용물 일정량을 정확하게 취하여 Scheme 1의 SPE 방법으로 추출하여 얻은 추출물을 GC/ MS에 주입하여 측정한 GC/MS tic 크로마토그람에서 스트리크닌의 quantifier ion으로 m/z 334, 내부표준물질으로 m/z 271을 각각 선정하여 작성한 SIM chromatogram에서 각 이온피크의 면적을 구하여, 내부표준물질에 대한 스트리크닌의 피크면적비를 구하였다. 이어 생체시료중 스트리크닌의 함량은 희석배수를 고려하여 검량선에 적용하여 산출하였다.
- 17에서 관찰되었고, 드라겐돌프시액에 의해 주황색으로, 산성염화백금산 요오드시액에 의해 진청색이 혼재된 보라색으로 정색되었다. 이 TLC 반점을 확인하기 위하여 위내용물 추출물을 preparative TLC로 다시 전개하여 정색된 일정한 위치의 반점을 정제하여 가스크로마토그라피/질량분석법(GC/MS)에 주입하여 Fig. 3의 mass spectrum을 측정하였다. Fig.
- 0 mg/ml 표준원액을 조제하였다. 이를 메탄올로 희석하여 1, 10, 100 mg/l의 표준용액을 조제하였다. 내부표준용액은 dextromethorphan를 메탄올에 10 mg/l의 농도로 용해하여 사용하였다.
- 즉, 주석산성하에서 주정으로 추출한 농축분획을 액성을 알카리성으로 한 다음, 초산에칠로 추출한 분획에 대하여 박층크로마토그라프(TLC)를 시행하였을 때, 일정한 위치의 반점에서 드라겐돌프시액 및 요오드백금산용액에 의해 정색되었으며, GC/MS분석에 적용하기 위하여, 이 반점을 preparative TLC로 정제하였다. 이어 가스크로마토그라피/질량분석기(GC/MS)에 주입하여 NIST, Wiley 등 상용 Library를 적용하여 스트리크닌이 검색되었으며, 이를 대조품과 비교하여 확증하였다.
- 시험관에 생체시료인 혈액 또는 위내용물 일정량을 정확하게 취하여 Scheme 1의 SPE 방법으로 추출하여 얻은 추출물을 GC/ MS에 주입하여 측정한 GC/MS tic 크로마토그람에서 스트리크닌의 quantifier ion으로 m/z 334, 내부표준물질으로 m/z 271을 각각 선정하여 작성한 SIM chromatogram에서 각 이온피크의 면적을 구하여, 내부표준물질에 대한 스트리크닌의 피크면적비를 구하였다. 이어 생체시료중 스트리크닌의 함량은 희석배수를 고려하여 검량선에 적용하여 산출하였다.
- 정밀도(Precision) − 시험내 정밀도는 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1ml에 스트리크닌 농도 1, 10, 100 mg/l의 표준용액을 각각 100 µl씩 첨가하여 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l으로 조제한 다음 Bond Elut Certify cartridge를 이용하는 고상추출법으로 6회 반복시험을 하여 이의 CV%를 계산하였을 때, 각각 6.4%, 10.4%, 1.2%이었다(n=6).
- 정밀도(Precision) − 시험내 정밀도는 시험관에 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1ml를 취한 다음 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 취하여 6회 반복시험을 하여 얻은 결과값을 검량선에 적용하여 스트리크닌의 측정값을 구하여 이의 CV%를 계산하여 검증하였다.
- 4 min)에서 관찰되었다. 즉, 이들을 Wiley library를 사용하여 검색하고, GC/MS에 의해 산출된 mass spectrum의 fragmentation pattern을 검토하고 표준품과 대조, 확인한 결과, 위내용물에서 스트리크닌 및 브루신을 확인하였다. 이상과 같이, 위내용물의 알칼리성 추출물을 박층크로마토그라피를 시행하여 반점을 확인하였으며, 이를 preparative TLC로 정제하여 EI-GC/MS를 측정하여 약독물 검사를 시행한 결과, 위내용물에서 스트리크닌 및 브루신이 검출되었다.
- 생체시료인 위내용물중 약독물 분석은 Stas-Otto법으로 추출하여 적용하였다. 즉, 주석산성하에서 주정으로 추출한 농축분획을 액성을 알카리성으로 한 다음, 초산에칠로 추출한 분획에 대하여 박층크로마토그라프(TLC)를 시행하였을 때, 일정한 위치의 반점에서 드라겐돌프시액 및 요오드백금산용액에 의해 정색되었으며, GC/MS분석에 적용하기 위하여, 이 반점을 preparative TLC로 정제하였다. 이어 가스크로마토그라피/질량분석기(GC/MS)에 주입하여 NIST, Wiley 등 상용 Library를 적용하여 스트리크닌이 검색되었으며, 이를 대조품과 비교하여 확증하였다.
- 직선성 − GC/MS에 의하여 혈액 및 위내용물에서 스트리크닌을 정량하기 위하여 0.05~10.0 µg 범위의 스트리크닌 표준용액에 대하여 검량선을 작성하였다.
- 회수율(recovery) − 회수율은 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1ml에 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 첨가하여(최종농도 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 µg/ml), 실온에서 30분간 방치한 다음, 이어서 시료와 동일한 SPE 방법으로 추출하여 GC/MS에 주입하여 얻은 내부표준 물질에 대한 시료의 피크면적비를 6회 반복시험을 하여 얻은 결과값을 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액을 사용하여 제조한 스트리크닌 표준용액 0.05~10 mg/l 각각 취하여 작성한 검량선에 적용하여 스트리크닌의 함량값으로 계산하여 회수율을 검증하였다.
대상 데이터
- 4)과 dextromethorphan은 Chem Service사의 표준품을 사용하였으며, 그 이외의 시약은 시판 특급을 사용하였다. Bond Elut Certify cartridge(130 mg, 3 cc)은 Varian(USA)사 제품을 사용하였다.
- Strychnine(C21H22N2O2, mw 334.4)과 dextromethorphan은 Chem Service사의 표준품을 사용하였으며, 그 이외의 시약은 시판 특급을 사용하였다. Bond Elut Certify cartridge(130 mg, 3 cc)은 Varian(USA)사 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 정확도(Accuracy) − 정확도는 시험관에 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1ml를 취한 다음 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 취하여 6회 반복시험을 하여 얻은 결과값을 검량선에 적용하여 스트리크닌의 측정값을 구하여 이의 bias%를 계산하여 검증하였다.
이론/모형
- 본 연구에서 혈액 및 위내용물중 스트리크닌의 함량은 Bond Elut Cartridge(130 mg, 3 ml)를 사용하는 Scheme 1의 고상추출법에 따라 추출하였으며, GC/MS를 측정하여 산출하였다. Fig.
- 본 연구에서 혈액중 스트리크닌의 분석은 혈액 1ml를 취하여 Bond Elut Certify cartridge(130 mg, 3 ml)를 사용하는 SPE 자동추출법으로 추출하였으며, GC/MS 분석법을 적용하였다. 분석법의 유효화는 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율 등 분석파라미터를 검토하였으며, 검토한 유효화 파라미터는 법독성학실험실 가이드라인의 허용기준11,12)에 모두 적합하였다.
- 생체시료인 위내용물중 약독물 분석은 Stas-Otto법으로 추출하여 적용하였다. 즉, 주석산성하에서 주정으로 추출한 농축분획을 액성을 알카리성으로 한 다음, 초산에칠로 추출한 분획에 대하여 박층크로마토그라프(TLC)를 시행하였을 때, 일정한 위치의 반점에서 드라겐돌프시액 및 요오드백금산용액에 의해 정색되었으며, GC/MS분석에 적용하기 위하여, 이 반점을 preparative TLC로 정제하였다.
- 혈액 중 스트리크닌의 확인 − 또한, 혈액에서 스트리크닌 및 브루신 등 약독물의 추출은 Bond Elut Cartridge(130 mg, 3 ml)를 사용하는 고상추출법을 사용하였다.
성능/효과
- 또한, 화재가 발생한 점, 경제고를 겪은 점 등을 종합해볼 때 다른 요인을 고려해볼 수도 있다. 그리고 문헌에 보고된 스트리크닌의 사후재분포는 심혈농도/말초혈 농도비 1.8, 15으로 2례만이 보고되어 있으며, 본 사례는 긴급히 화재신고된 사망사고로 심장혈액/말초혈액 스트리크닌의 농도비가 0.94으로 거의 사후재분포가 일어나지 않았는데, 이러한 이유는 사망 후 즉시 발견되었고 곧 바로 부검이 이루어져, 즉, 사망후 부검시 까지의 시간이 단시간이었으므로 사후 재분포가 거의 이루어지지 않았음을 추정할 수 있었다.
- 9%(n=18)이었다. 따라서 본 연구 방법에 대한 정확도는 모두 20% 미만으로 독성학실험실 가이드라인의 허용기준(20%)11,12)에 적합하였다.
- 또한, 시험간 정밀도를 검토한 결과, 1.0, 10.0 mg/l의 표준용액 농도에서는 CV%가 18.5%, 13.8%으로 법독성학실험실 가이드라인의 허용기준(20%)11,12)에 적합하였으며, 특히 정량한계와 근접한 농도인 0.1 mg/l에서 CV%가 24%로 LOQ에 대한 법독성학실험실 가이드라인의 허용기준(±30%)11,12)에 적합하였다.
- 분석법의 유효화는 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율 등 분석파라미터를 검토하였으며, 검토한 유효화 파라미터는 법독성학실험실 가이드라인의 허용기준11,12)에 모두 적합하였다. 또한, 화재사로 사망한 실제사례 1례의 혈액에서 스트리크닌이 검출되었고, 위내용물에서는 TLC 및 GC/MS에 의해 스트리크닌 및 브루신이 검출되었으며, 스트리크닌의 함량은 혈액에서 0.083~0.088 mg/l, 위내용물에서 4.0 mg/kg이었다. 즉, 본 사례의 혈액중 농도는 문헌에 보고된 혈액중 스트리크닌의 독성농도 범위였으며, 위내용물중 농도는 치사농도 이상으로 검출된 점으로 보아 스트리크닌이 포함된 약제인 마전자 등 한약제를 약용량 이상 경구로 복용한 사망사례로 추정되었다.
- 본 연구에서 혈액중 스트리크닌의 분석은 혈액 1ml를 취하여 Bond Elut Certify cartridge(130 mg, 3 ml)를 사용하는 SPE 자동추출법으로 추출하였으며, GC/MS 분석법을 적용하였다. 분석법의 유효화는 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율 등 분석파라미터를 검토하였으며, 검토한 유효화 파라미터는 법독성학실험실 가이드라인의 허용기준11,12)에 모두 적합하였다. 또한, 화재사로 사망한 실제사례 1례의 혈액에서 스트리크닌이 검출되었고, 위내용물에서는 TLC 및 GC/MS에 의해 스트리크닌 및 브루신이 검출되었으며, 스트리크닌의 함량은 혈액에서 0.
- 이상과 같이, 위내용물의 알칼리성 추출물을 박층크로마토그라피를 시행하여 반점을 확인하였으며, 이를 preparative TLC로 정제하여 EI-GC/MS를 측정하여 약독물 검사를 시행한 결과, 위내용물에서 스트리크닌 및 브루신이 검출되었다. 스트리크닌은 브루신과 함께 마전자 나무 씨에 함유되어 있는 알칼로이드류의 고유 성분이므로, 변사자는 생약인 마전자를 복용한 것으로 추정되었다.
- 5~282 mg/kg라 보고되어 있다. 실제 법과학 검체에의 적용예에서 스트리크닌의 함량은 Table V에서와 같이, 혈액중 스트리크닌의 농도가 심장혈액에서 0.083 mg/l, 말초혈액에서 0.088 mg/l으로 스트리크닌이 이상반응을 일으키는 혈액중 농도범위(0.075~0.1 mg/l) 로 검출되었고, 위내용물에서는 4.0 mg/ kg으로 혈액에 비해 상대적으로 높은 농도이고 문헌에서 제시한 위내용물중 스트리크닌의 치사농도(0.1 mg/kg) 이상인 점, 위액/말초혈액 농도비가 45.4로 매우 높게 나온 점, 이외에 위내용물에서만 브루신이 검출된 점으로 보아 혈액순환개선 등의 치료목적으로 스트리크닌이 포함된 약제인 마전자 등 한약제를 고용량 경구로 복용한 사망사례로 추정되었다. 또한, 화재가 발생한 점, 경제고를 겪은 점 등을 종합해볼 때 다른 요인을 고려해볼 수도 있다.
- 위내용물 중 스트리크닌의 확인 − 사인규명을 위한 약독물의 대표적인 생체시료인 위내용물을 알칼리성에서 추출하여 Fig. 2와 같이 silica gel 60 GF254(Merck Co.) aluminium plate, 전개 용매 chlorform : ethanol (9 : 1)에서 박층크로마토그라피에 의한 약독물을 검색한 결과, UV 반점이 Rf 값 약 0.17에서 관찰되었고, 드라겐돌프시액에 의해 주황색으로, 산성염화백금산 요오드시액에 의해 진청색이 혼재된 보라색으로 정색되었다.
- 즉, 이들을 Wiley library를 사용하여 검색하고, GC/MS에 의해 산출된 mass spectrum의 fragmentation pattern을 검토하고 표준품과 대조, 확인한 결과, 위내용물에서 스트리크닌 및 브루신을 확인하였다. 이상과 같이, 위내용물의 알칼리성 추출물을 박층크로마토그라피를 시행하여 반점을 확인하였으며, 이를 preparative TLC로 정제하여 EI-GC/MS를 측정하여 약독물 검사를 시행한 결과, 위내용물에서 스트리크닌 및 브루신이 검출되었다. 스트리크닌은 브루신과 함께 마전자 나무 씨에 함유되어 있는 알칼로이드류의 고유 성분이므로, 변사자는 생약인 마전자를 복용한 것으로 추정되었다.
- 정확도(Accuracy) − 정확도는 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1ml에 스트리크닌 농도 1, 10, 100 mg/l의 표준용액을 각각 100 µl씩 첨가하여 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l으로 조제한 다음, Bond Elut Certify cartridge를 이용하는 고상추출법으로 6회 반복시험을 하여 이의 bias%를 계산하였을 때 각각 12.0%, 9.3%, 6.9%(n=18)이었다.
- 0 mg/kg이었다. 즉, 본 사례의 혈액중 농도는 문헌에 보고된 혈액중 스트리크닌의 독성농도 범위였으며, 위내용물중 농도는 치사농도 이상으로 검출된 점으로 보아 스트리크닌이 포함된 약제인 마전자 등 한약제를 약용량 이상 경구로 복용한 사망사례로 추정되었다.
- 8%이었다(n=18). 즉, 본 연구방법의 유효화 파라미터를 검토한 결과 시험내 정밀도는 모두 20% 미만으로 기준에 적합하였다. 또한, 시험간 정밀도를 검토한 결과, 1.
- 2%이었다(n=6). 즉, 시험내 정밀도를 검토한 결과 모두 20% 미만으로 독성학실험실 가이드라인의 허용기준(20%)11,12)에 적합하였다. 시험간 정밀도는 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 첨가하여 최종농도로 스트리크닌 0.
- 직선성 − 시험관에 혈액 1ml를 넣고 내부표준용액을 넣은 후 표준용액을 0.05~10 mg/l으로 하여 SPE 추출하여 GC/MS에 주입하여 얻은 크로마토그람에서 스트리크닌의 quantifier ion으로 m/z 334을 선택하고, 내부표준용액의 quantifier ion으로 m/z 271을 선택하여 SIM 크로마토그램을 구하여 내부표준물질에 대한 피크면적비를 구하여 검량선을 작성한 결과, 우수한 직선성을 얻었다(상관계수 0.999).
- 회수율(Recovery) − 회수율은 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1ml에 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l 으로 조제한 다음 Bond Elut Certify cartridge를 이용하는 고상 추출법으로 6회 반복시험을 하여 얻은 결과값을 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액을 사용하여 제조한 스트리크닌 표준용액 0.05~10 mg/l의 검량선에 적용하여 스트리크닌의 함량값으로 회수율을 계산하여 검증하였을 때 각각 114.9%, 99.3%, 87.4%이었으며, Table III에 나타내었다.
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