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문제 정의
- 현재까지 산청목에 대한 약리연구로는 간보호,6,7) 항산화8) 및 항염증9) 활성 등이 보고되고 있으며, 주성분으로는 quercetin, catechin과 같은 phenol계 화합물을 포함하고 있다고 알려져 있다.10) 전통적으로 산청목이 다양한 통증의 개선에 효과적으로 사용되어 왔음에도 불구하고 진통 효과에 대한 연구는 미비한 실정이며, 이에 본 연구에서는 생쥐를 이용하여 산청목이 중추성 통증 및 말초성 통증에 어떠한 영향을 미치는지 다양한 통증모델을 통하여 확인하였다. 또한, opioid 수용체의 비선택적 길항제인 naloxone의 전처리를 통해 산청목의 진통효능이 opioid 수용체와 관련이 있는지 여부를 조사하였다.
- 10) 전통적으로 산청목이 다양한 통증의 개선에 효과적으로 사용되어 왔음에도 불구하고 진통 효과에 대한 연구는 미비한 실정이며, 이에 본 연구에서는 생쥐를 이용하여 산청목이 중추성 통증 및 말초성 통증에 어떠한 영향을 미치는지 다양한 통증모델을 통하여 확인하였다. 또한, opioid 수용체의 비선택적 길항제인 naloxone의 전처리를 통해 산청목의 진통효능이 opioid 수용체와 관련이 있는지 여부를 조사하였다.
제안 방법
- Acetic Acid-induced Writhing Test − ICR mouse의 복강에 생리 식염수를 용매로 acetic acid(0.8%)를 주사한 후 나타나는 writhing motion의 횟수를 투여 후 5분 뒤부터 20분간 측정하였다.
- Hot-plate Test − Hot-plate test 에서 ICR mouse를 각 군으로 구획한 후, hot-plate를 55±1℃에서 유지시킨 상태에서 실험 동물을 그 위에 올려놓은 뒤 통증 반응(앞발 물기, 뒤로 가기, 제자리 뛰기)을 보일 때까지의 시간을 측정하였다.
- Tail Immersion Test − ICR mouse의 꼬리 절반을 50±0.2℃의 온도가 유지되는 water bath 안에 담근 후 꼬리를 다시 들어 올리는 시간을 측정하였다.
- 실험 동물은 진통 실험을 위해 8마리에서 10마리가 무작위로 선택되어 구획되었다. 각각의 실험에서 산청목은 증류수를 용매로 하여 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다. 양성대조군으로 사용된 약물 중 tramadol(15 mg/kg)은 복강 주사하였고, indomethacin(5 mg/kg)은 경구투여 하였다.
- 다음으로 산청목의 진통 효능이 opioid 수용체와 관련이 있는지 알아보기 위하여 opioid 수용체의 선택적 길항제인 naloxone을 전 처리한 다음 진통효과의 변화를 관찰하였다. 양성대조군인 tramadol의 경우 naloxone의 전 처리 후 그 정도의 감소가 있으나 여전히 약간의 효과가 유지됨을 확인하였다.
- 말초성 통증에서의 산청목의 진통 효과는 acetic acidinduced writhing test를 통해 검정하였다. Acetic acidinduced writhing test는 prostaglandins(PGs), 그 중에서도 복막 유동체 내의 PGE2의 증가와 밀접한 관련이 있으며12) 염증성 통증에 주로 연관되어 있다고 알려져 있다.
- 모든 실험동물은 22±1℃의 온도와 12시간 주기의 또한 일정한 양의 사료와 식수를 주기적으로 공급하였다.
- 본 연구에서는 산청목이 중추성 통증에 미치는 영향을 알아보기 위해서 tail immersion test와 hot-plate test 같은 열자극으로 유도된 통증모델을 사용하였다. Tail immersion test 결과, 산청목은 농도 의존적으로 열자극에 견디는 시간을 증가시켰으며, 비교 대조군으로 사용된 tramadol 역시 유의적인 진통효능을 나타내었다(Fig.
- 이러한 통증 반응을 formalin 주사 직후 5분간 및 주사 후 25부터 15분 간 각각 2회 측정하였다. 산청목(250, 500 mg/kg)은 증류수를 용매로 하여 formalin 투여 60분 전에 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다. 양성대조군으로 사용된 약물 중 tramadol(15 mg/kg)은 formalin 투여 30분 전에 복강주사 하였고, indomethacin(5 mg/kg)은 formalin 투여 60분 전 구강 투여하였다.
- 8%)를 주사한 후 나타나는 writhing motion의 횟수를 투여 후 5분 뒤부터 20분간 측정하였다. 산청목(250, 500 mg/kg)은 증류수를 용매로 하여 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다. 양성대조군으로 사용된 indomethacin(5 mg/kg) 또한 구강을 통해 투여되었다.
- 산청목의 중추성 및 말초성 통증에 대한 진통효과를 최종적으로 검정하기 위해서 두 가지 통증을 모두 확인할 수 있는 formalin test를 수행하였다. 말초성 유해 자극원인 formalin을 피하주사하게 되면 두 가지 통증 매커니즘을 통해 통증반응을 유도하게 된다.
- 2℃의 온도가 유지되는 water bath 안에 담근 후 꼬리를 다시 들어 올리는 시간을 측정하였다. 시간 측정은 산청목(250, 500 mg/kg)와 tramadol(15 mg/kg) 투여 후 0, 30, 60, 90, 120 분이 지난 뒤에 시행되었다. 또한 조직 손상을 피하기 위해 측정시간은 20초를 최대로 하였다.
- 산청목(250, 500 mg/kg)은 증류수를 용매로 하여 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다. 양성대조군으로 사용된 indomethacin(5 mg/kg) 또한 구강을 통해 투여되었다. 또한 이들은 모두 acetic acid를 복강 주사하기 60분 전에 투여되었다.
- 산청목(250, 500 mg/kg)은 증류수를 용매로 하여 formalin 투여 60분 전에 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다. 양성대조군으로 사용된 약물 중 tramadol(15 mg/kg)은 formalin 투여 30분 전에 복강주사 하였고, indomethacin(5 mg/kg)은 formalin 투여 60분 전 구강 투여하였다. 또한 opioid 수용체와의 연관성을 알아보기 위해 병용 투여한 naloxone(5 mg/kg)은 각각의 약물 처리 15분 전에 복강 주사로 투여되었다.
- 각각의 실험에서 산청목은 증류수를 용매로 하여 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다. 양성대조군으로 사용된 약물 중 tramadol(15 mg/kg)은 복강 주사하였고, indomethacin(5 mg/kg)은 경구투여 하였다.
- 5%, 20 µl)을 ICR mouse의 족부에 투여하였을 때 실험 동물은 주사부위를 핥는 행동을 보인다. 이러한 통증 반응을 formalin 주사 직후 5분간 및 주사 후 25부터 15분 간 각각 2회 측정하였다. 산청목(250, 500 mg/kg)은 증류수를 용매로 하여 formalin 투여 60분 전에 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다.
대상 데이터
- 기기 및 시약 − Indomethacin과 naloxone은 SigmaAldrich(CA, USA)에서 구입하였다. Acetic acid, formalin은 Samchun Chemical(Korea)에서 구입하였다. Hot-plate apparatus(JD-A-10A, Jungdo BNP, Korea)와 항온수조는 열성 자극에 의한 통증 억제 실험을 위해 사용되었다.
- Acetic acid, formalin은 Samchun Chemical(Korea)에서 구입하였다. Hot-plate apparatus(JD-A-10A, Jungdo BNP, Korea)와 항온수조는 열성 자극에 의한 통증 억제 실험을 위해 사용되었다.
- 기기 및 시약 − Indomethacin과 naloxone은 SigmaAldrich(CA, USA)에서 구입하였다.
- 시료의 준비 − 실험에 사용된 약재는 2012년 10월 강원 원주 소재의 강원약초에서 구입하였다.
- 실험 동물 − ICR mice(5주령, 수컷) 는 한국 대전 소재의 다물 사이언스에서 구입하였다.
- 본 연구에서 수행된 진통 실험은 International association for the study of pain 및 우석대학교에서 규정하는 동물실험 윤리규정을 준수하였다. 실험 동물은 진통 실험을 위해 8마리에서 10마리가 무작위로 선택되어 구획되었다. 각각의 실험에서 산청목은 증류수를 용매로 하여 구강을 통해 투여되었고 음성대조군에서는 같은 양의 증류수를 투여하였다.
데이터처리
- Differences between groups were statistically analysed by Student’s test.
- 통계 분석 − 모든 자료는 mean±S.E.M. Data 로 표시 되었으며 두 군 간의 비교는 Student's t-test 를 이용하여 pvalues 값을 구하였다.
이론/모형
- 모든 실험동물은 22±1℃의 온도와 12시간 주기의 또한 일정한 양의 사료와 식수를 주기적으로 공급하였다. 본 연구에서 수행된 진통 실험은 International association for the study of pain 및 우석대학교에서 규정하는 동물실험 윤리규정을 준수하였다. 실험 동물은 진통 실험을 위해 8마리에서 10마리가 무작위로 선택되어 구획되었다.
성능/효과
- p>통증이란 실제적인 또는 잠재적인 조직 손상에 따라 수반되는 혹은 그러한 손상의 관점에서 표현되는 불쾌한 감각적, 정서적 경험을 의미한다.1) 우리 몸은 이러한 통증을 통해서 조직을 손상시킬 수 있는 위협을 감지하여 2차 손상을 방지하거나 그 정도를 최소화 할 수 있다.2) 그러나 통증의 정도가 지나치거나 손상된 조직의 치료가 완료되었음에도 불구하고 계속되는 경우 또는 암과 같은 질병으로 기인하거나 원인불명의 만성 통증의 경우에는 인간의 삶의 질을 심각하게 떨어뜨릴 수 있으며, 이러한 경우에는 통증이 효과적으로 조절될 필요가 있다.
- Acetic acidinduced writhing test는 prostaglandins(PGs), 그 중에서도 복막 유동체 내의 PGE2의 증가와 밀접한 관련이 있으며12) 염증성 통증에 주로 연관되어 있다고 알려져 있다.13) 따라서, NSAID계 약물은 이러한 PG synthesis를 효과적으로 저해시켜 말초성 통증을 억제시킬 수 있으며, 본 실험에서 비교대조군으로 사용된 indomethacin 역시 ICR mouse의 writhing motion을 뚜렷하게 감소시켰다. 또한 산청목도 고농도에서 유의적인 진통효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 이러한 결과는 이미 보고된 다수의 논문과 일치하는 것으로서 주로 중추신경계에 작용하는 약물은 formalin test의 두 phase에 모두 작용하는 반면, 말초신경계에 작용하는 스테로이드나 NSAIDs 계열 약물은 first phase에서 거의 효과가 나타나지 않는다.16) 한편, 산청목은 first phase와 second phase에서 모두 실험동물의 반응을 효과적으로 저해했으며 이는 산청목이 중추성 통증과 말초성 통증 모두를 억제 한다는 것을 보여주며, 이러한 결과를 통해 앞선 연구에서 나타난 중추성 및 말초성 통증 억제효과를 재확인 할 수 있었다(Table I).
- 1) 우리 몸은 이러한 통증을 통해서 조직을 손상시킬 수 있는 위협을 감지하여 2차 손상을 방지하거나 그 정도를 최소화 할 수 있다.2) 그러나 통증의 정도가 지나치거나 손상된 조직의 치료가 완료되었음에도 불구하고 계속되는 경우 또는 암과 같은 질병으로 기인하거나 원인불명의 만성 통증의 경우에는 인간의 삶의 질을 심각하게 떨어뜨릴 수 있으며, 이러한 경우에는 통증이 효과적으로 조절될 필요가 있다.
- 본 연구에서는 산청목이 중추성 통증에 미치는 영향을 알아보기 위해서 tail immersion test와 hot-plate test 같은 열자극으로 유도된 통증모델을 사용하였다. Tail immersion test 결과, 산청목은 농도 의존적으로 열자극에 견디는 시간을 증가시켰으며, 비교 대조군으로 사용된 tramadol 역시 유의적인 진통효능을 나타내었다(Fig. 1). 흥미롭게도 tramadol은 opioid계 약물와 유사하게 약물 투여 30분 후에 가장 뛰어난 진통효과를 나타낸 반면에, 산청목은 저농도와 고농도 모두 약물 투여 60분 뒤에 가장 뛰어난 효과를 보였다.
- 산청목 메탄올 추출물의 진통효능을 알아보기 위해 여러 가지 실험을 수행한 결과는 다음과 같다. Tail immersion test와 hot-plate test의 결과 산청목은 효과적인 중추성 통증 억제능을 나타내었다. 또한 acetic acid-induced writhing test의 결과, 산청목은 효과적인 말초성 통증 억제능을 나타내었다.
- Tail immersion test와 hot-plate test의 결과 산청목은 효과적인 중추성 통증 억제능을 나타내었다. 또한 acetic acid-induced writhing test의 결과, 산청목은 효과적인 말초성 통증 억제능을 나타내었다. 마지막으로 formalin test를 통해 산청목의 중추성, 말초성 통증 억제능을 재확인 하였으며 naloxone의 전처리를 통해 opioid 수용체와 상이한 경로를 통해 진통 효능을 보임이 확인되었다.
- 13) 따라서, NSAID계 약물은 이러한 PG synthesis를 효과적으로 저해시켜 말초성 통증을 억제시킬 수 있으며, 본 실험에서 비교대조군으로 사용된 indomethacin 역시 ICR mouse의 writhing motion을 뚜렷하게 감소시켰다. 또한 산청목도 고농도에서 유의적인 진통효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 특히, 산청목은 NO, TNF-α, PGE2 등을 포함하여 다양한 염증성 매개물질의 합성을 억제한다고 알려져 있으며8) 이러한 산청목의 항염증 활성을 통해서 말초성 통증이 억제되는 것으로 생각된다.
- 또한 acetic acid-induced writhing test의 결과, 산청목은 효과적인 말초성 통증 억제능을 나타내었다. 마지막으로 formalin test를 통해 산청목의 중추성, 말초성 통증 억제능을 재확인 하였으며 naloxone의 전처리를 통해 opioid 수용체와 상이한 경로를 통해 진통 효능을 보임이 확인되었다.
- 다음으로 산청목의 진통 효능이 opioid 수용체와 관련이 있는지 알아보기 위하여 opioid 수용체의 선택적 길항제인 naloxone을 전 처리한 다음 진통효과의 변화를 관찰하였다. 양성대조군인 tramadol의 경우 naloxone의 전 처리 후 그 정도의 감소가 있으나 여전히 약간의 효과가 유지됨을 확인하였다. 이는 tramadol이 부분적으로 opioid 수용체에 영향을 줌과 동시에 다른 기전으로도 진통효능을 나타냄을 의미한다.
- 17) 그러나 산청목이나 indomethacin은 naloxone의 전처리에 의해 유의적인 진통효능의 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 통해서 산청목이 opioid 수용체와는 다른 기전으로 중추성 및 말초성 통증을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과로 산청목이 중추성 통증과 말초성 통증 모두를 억제하는데 좋은 효과가 있으며 이러한 진통효능은 opioid 수용체와는 다른 경로를 통해 나타난다는 것을 알 수 있었다. 그러나 산청목의 보다 정확한 약리기전을 알아보기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 1). 흥미롭게도 tramadol은 opioid계 약물와 유사하게 약물 투여 30분 후에 가장 뛰어난 진통효과를 나타낸 반면에, 산청목은 저농도와 고농도 모두 약물 투여 60분 뒤에 가장 뛰어난 효과를 보였다. 이러한 차이는 약물 투여의 방법이 복강투여와 경구 투여로 다른 점에서 기인하였거나 상이한 약물의 대사 과정에서 비롯된 것으로 추측된다.
후속연구
- 이상의 결과로 산청목이 중추성 통증과 말초성 통증 모두를 억제하는데 좋은 효과가 있으며 이러한 진통효능은 opioid 수용체와는 다른 경로를 통해 나타난다는 것을 알 수 있었다. 그러나 산청목의 보다 정확한 약리기전을 알아보기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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