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문제 정의
- 탕제는 서늘한 곳에 보관하도록 복약 지도하고 있는 실정이나 탕액 파우치의 보관 기간에 대한 과학적인 근거는 설정되어 있지 않다. 따라서 본 연구는 식품의약품안전처가 의약품 유통기간 기준 평가 시에 요구되는 장기보존시험에 따라 보중익기탕 탕액의 전탕팩에 대한 연구를 수행하였다.
- 이와 같이 한방의료기관에서 처방하는 다빈도 처방15) 중 하나인 보중익기탕에 대하여 식품의약품안전처에서 제시하고 있는 장기보존시험을 근거로 보중익기탕 내용 액제에 대하여 성상, 확인시험, pH, 비중, 중금속, 미생물 및 함량시험 등과 같은 물리 · 화학적 시험을 실시하여 품질 안정성에 미치는 영향을 평가하고 사용기간을 설정에 대한 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- (1) 감초 − 감초 대조생약 가루 약 1.0 g에 메탄올 100 mL를 넣고 1시간 환류 추출하였다.
- (2) 당귀, 백출, 승마 및 인삼 − 4종 생약의 대조생약 가루약 1.0 g에 메탄올 100 mL를 넣고 1시간 환류 추출하였다.
- (3) 시호 − 시호 대조생약 가루 1.0 g에 메탄올 50 mL를 넣고 1시간 환류 추출하였다.
- 감초의 주요 성분인 glycyrrhizin의 함량을 분석하고자 Table III의 조건을 이용하여 기울기용리(0분, 10% B; 0-10분, 10-15% B; 10-25분, 15-25% B; 25-40분, 25-30% B;40-55분, 30-50% B; 55-58분, 50-10% B; 58-60분, 10% B)로 분석하였다.
- 당귀의 주요 성분인 nodakenin의 함량을 분석하고자 Table III의 조건을 이용하여 기울기용리(0분, 20% B; 0-3분, 20% B; 3-8분, 20-30% B; 8-18분, 30% B; 18-19분, 30-50% B; 19-40분, 50% B; 40-41분, 90% B, 41-50분, 90% B)로 분석하였다.
- 전탕팩은 3개의 lot로 나누어 전탕하였으며 상대습도 60±5%, 보관 온도 25±2℃ 및 차광하여 보관하였다. 보관기간별 전탕팩의 분석은 0, 3, 6, 9 및 12개월마다 측정항목을 분석하였다.
- 보중익기탕 전탕팩의 성상, 확인시험, pH, 비중, 중금속및 미생물 시험 등에 대하여 12개월 동안 장기보존시험을 통한 안정성 시험을 실시하고, 보중익기탕의 구성 생약의 주요성분에 대한 함량의 변화를 분석함으로써 보중익기탕전탕팩의 유통기한을 예측하였다. 그 결과 90% 함량기준으로 23개월의 유통기한이 예측되었다.
- 보중익기탕의 구성 생약 중 감초의 주요성분인 liquiritin과 glycyrrhizin, 당귀의 nodakenin 및 진피의 hesperidin 함량을 Agilent 1200 series HPLC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.
- 본 처방을 구성하는 생약 중 감초, 당귀 및 진피의 주요 성분인 liquiritin, glycyrrhizin, nodakenin 및 hesperidin 등 4종 성분의 함량 변화를 바탕으로 6개월 가속시험에 의한 주요 성분들의 유의적인 변화가 없다고 가정한 후 의약품등의 안정성 시험 기준18)의 선형회귀분석을 이용하여 전탕팩의 유통기한을 예측하였다. 최초 0개월째 함량 시험 결과를 100%로 하여 진행하였으며 초기 농도 대비 90.
- 유통기한 산정을 위해 보중익기탕 전탕액 중 liquiritin, glycyrrhizin, nodakenin 및 hesperidin의 함량 변화를 이용하여 의약품등의 안정성 시험 기준18)에 따라 유통기한을 예측하였다.
- 이 약을 가지고 식약청고시 “의약품 등의 미생물한도기준 및 시험방법”17)에 따라 시험하였으며, 세균수, 진균 수, 대장균, 녹농균, 황색포도구균 및 살모넬라균에 대하여 미생물 시험을 실시하였다.
- 장기보존시험 동안 보중익기탕의 구성 생약인감초, 당귀, 백출, 승마, 시호, 인삼, 진피 및 황기의 대조생약과 보중익기탕 전탕액을 대상으로 TLC에 의한 확인시험을 실시하였다. 확인시험 결과 Rf 값 0.
- 전탕팩은 3개의 lot로 나누어 전탕하였으며 상대습도 60±5%, 보관 온도 25±2℃ 및 차광하여 보관하였다.
- 조제된 대조생약과 검액을 각각 20 µL씩 실리카겔 GF254에 점적하여 Table II의 조건으로 각각 10 cm 전개한 후 주요 반점의 Rf 값과 색상을 비교하였다.
- 조제된 보중익기탕 전탕액에 대하여 pH meter를 이용하여 장기보존시험에 대한 시료의 pH를 측정하였다.
- 조제된 보중익기탕 전탕액에 대하여 보관기간에 따라 육안으로 관찰하였다.
- 진피의 주요 성분인 hesperidin의 함량을 분석하고자 Table III의 조건을 이용하여 기울기용리(0분, 5% B; 0-40분, 5-65% B; 40-41분, 65-100% B; 41-48분, 100% B; 48-49분, 100-5% B; 49-60분, 5% B)로 분석하였다.
- 의 선형회귀분석을 이용하여 전탕팩의 유통기한을 예측하였다. 최초 0개월째 함량 시험 결과를 100%로 하여 진행하였으며 초기 농도 대비 90.0%, 80.0% 및 70.0% 수준으로 함량 기준을 설정하여 유통기한을 예측하였다. 총 12개월의 장기보존시험 기간의 시험결과를 이용하여 선형회귀분석법에 의해 95% 신뢰한계로 하한의 단측검정을 수행하여 사용기간 등을 외삽하고, 3 lot 시험하여 외삽한 결과, 유통기한은 90.
- 함량시험은 Agilent 1200 series HPLC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 전탕팩 보관을 위한 항온항습기는 SH-CTH288(Samheung Instrument, Korea)을 사용하였다. 분광광도계와 초음파추출기는 각각 X-ma 2000(Human Co.
대상 데이터
- (Osaka, Japan)와 Biopurify Phytochemicals Ltd.(Chengdu, China)로부터 각각 구입하였다. 이들 표준물질의 순도는 HPLC 분석에 의해 98%이상으로 확인되었다.
- - 본 실험에 사용된 보중익기탕의 구성 한약재인 감초(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma), 당귀(Angelicae Gigantis Radix, Yeongcheon, Korea), 백출(Atractylodis Rhizoma Alba), 승마(Cimicifugae Rhizoma), 시호(Bupleuri Radix), 인삼(Ginseng Radix Alba), 진피(Citri Unshii Pericarpium) 및 황기(Astragali Radix, Jeongseon, Korea)는 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 구입하였다. 각각의 구성 한약재들의 표본(2012-KE12-1~2012-KE12-8)은 한국한의학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다.
- Baker (Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입하였다. Water는 MR-RU1690(Mirae Science Co., Korea)을 이용하여 여과하여 사용하였으며, 그 외의 시약은 HPLC 또는 특급시약을 구입하여 사용하였다.
- 함량시험은 Agilent 1200 series HPLC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 전탕팩 보관을 위한 항온항습기는 SH-CTH288(Samheung Instrument, Korea)을 사용하였다. 분광광도계와 초음파추출기는 각각 X-ma 2000(Human Co., Korea)과 8510R-DTH(Branson, Danbury, CT, USA)를 사용하였으며, 건조기는 J-300M(JISICO, Korea), pH meter는 Orion 3 star(Thermo, San Jose, CA, USA)를 사용하였다. 보중익기탕의 전탕 및 포장은 초고속 진공 저온 농축 추출기(Cosmos 660, Kyungseo machine, Korea)와 자유조절 롤 포장기(MH 205 Tower, Kyungseo machine, Korea)를 사용하였다.
- 포장지는 레토르트 포장지로 포장지 밖은 폴리에틸렌 재질, 중간막은 알루미늄 및 안은 폴리프로필렌 재질로 이루어져 있다. 추출 및 정량분석에 사용된 methanol과 acetonitrile은 HPLC grade용으로 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입하였다. Water는 MR-RU1690(Mirae Science Co.
이론/모형
- 보중익기탕 전탕액 1.0 mL를 달아 대한약전 일반시험법16) 중금속시험법 중 제 3 법에 따라 조작하여 시험하였으며, 비교액에는 납표준액 3.0 mL를 넣어 시험하였다.
- 조제된 보중익기탕 전탕액을 이용하여 대한약전 일반시험법16)의 비중 및 밀도측정법 제 3 법 부칭에 의한 시험법에 따라 비중 시험을 하였다.
성능/효과
- HPLC를 이용한 12개월간 실온보관에 따른 장기보존시험에서 한약처방 중 liquiritin, glycyrrhizin, nodakenin 및 hesperidin의 함량을 분석한 결과 67.6–71.1 µg/mL, 93.9–97.1 µg/mL, 51.6–54.1 µg/mL 및 49.9–51.8 µg/mL로 각각 나타났다(Fig. 3 및 Table VII).
- 보중익기탕 전탕팩의 성상, 확인시험, pH, 비중, 중금속및 미생물 시험 등에 대하여 12개월 동안 장기보존시험을 통한 안정성 시험을 실시하고, 보중익기탕의 구성 생약의 주요성분에 대한 함량의 변화를 분석함으로써 보중익기탕전탕팩의 유통기한을 예측하였다. 그 결과 90% 함량기준으로 23개월의 유통기한이 예측되었다. 이러한 결과는 보중익기탕 전탕팩의 유통기한 설정을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 보중익기탕 전탕액을 대한약전 일반시험법16)의 중금속시험법 중 제 3법에 따라 장기보존시험 한 결과 모든 측정 기간에서 총중금속이 대한약전 기준치인 30 mg/kg 이하에 적합하였다.
- 본 처방의 장기보존시험에 따른 pH를 측정한 결과 lot별로 5.71–5.72, 5.54–5.55 및 5.40–5.41로 각각 나타났으며(Table IV), 보관기간이 지남에 따라 pH 변화는 관찰되지 않았다.
- 식약청고시 “의약품 등의 미생물한도기준 및 시험방법”17) 기준에 따라 최초 0개월 시점의 보중익기탕 전탕액 시료 10 mL을 이용하여 세균수 및 진균수와 같은 총호기성세균과 대장균, 살모넬라, 녹농균 및 황색포도상구균과 같은 특정 세균에 대하여 미생물 실험 결과 세균과 진균은 모두 0 CFU/mL로 나타났으며, 특정세균에 대하여는 모두 검출되지 않았다.
- 보중익기탕 전탕액의 최초 조제시 성상은 투명한 파우치에 든 황갈색의 액제였다. 이 후 장기보존시험 분석에 따라 3, 6, 9 및 12개월 시점의 전탕액 성상을 확인한 결과 황갈색의 액제로서 별다른 변화 없이 유지되었다.
- 이러한 TLC에 의한 확인시험은 최초 0개월에서부터 3, 6, 9 및 12개월 시점에서 각각 확인한 결과 모두 동일한 Rf 값과 같은 색의 반점을 확인하였다. 이상의 TLC 결과로 보중익기탕을 구성하는 8종의 생약은 감초, 당귀, 백출, 승마, 시호, 인삼, 진피 및 황기로부터 유래된 것임을 알 수 있다.
- 기준에 따라 최초 0개월 시점의 보중익기탕 전탕액 시료 10 mL을 이용하여 세균수 및 진균수와 같은 총호기성세균과 대장균, 살모넬라, 녹농균 및 황색포도상구균과 같은 특정 세균에 대하여 미생물 실험 결과 세균과 진균은 모두 0 CFU/mL로 나타났으며, 특정세균에 대하여는 모두 검출되지 않았다. 이후 3, 6, 9 및 12개월 시점에서도 미생물 시험 결과 모두 적합하였다(Table VI).
- 조제된 보중익기탕 전탕액을 이용하여 대한약전 일반시험법16)의 비중 및 밀도측정법 제 3 법 부칭에 의한 시험법에 따라 비중 시험한 결과 1.010–1.013 g/mL로 나타났다(Table V).
- 0% 수준으로 함량 기준을 설정하여 유통기한을 예측하였다. 총 12개월의 장기보존시험 기간의 시험결과를 이용하여 선형회귀분석법에 의해 95% 신뢰한계로 하한의 단측검정을 수행하여 사용기간 등을 외삽하고, 3 lot 시험하여 외삽한 결과, 유통기한은 90.0%, 80.0% 및 70.0% 함량 기준시 23개월, 45개월 및 67개월로 나타났다(Fig. 4 및 Table VIII). 이상의 유통기한 설정 결과는 단순히 이화학적 결과 즉, 보중익기탕 전탕액의 주요 성분인 liquiritin, glycyrrhizin, nodakenin 및 hesperidin의 함량 변화에 따라 유통기한이 계산된 것으로 보다 정확한 유통기한 설정을 위해서는 다른 약리학적 효능 비교가 병행되어야 할 것이다.
- 장기보존시험 동안 보중익기탕의 구성 생약인감초, 당귀, 백출, 승마, 시호, 인삼, 진피 및 황기의 대조생약과 보중익기탕 전탕액을 대상으로 TLC에 의한 확인시험을 실시하였다. 확인시험 결과 Rf 값 0.3에서 감초의 대조생약에서 나타나는 황색의 반점을 확인하였으며, Rf 값 0.6과 0.4에서 당귀와 황기의 적색과 자색의 반점을 각각 확인하였다. 또한 Rf 값 0.
후속연구
- 그 결과 90% 함량기준으로 23개월의 유통기한이 예측되었다. 이러한 결과는 보중익기탕 전탕팩의 유통기한 설정을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 4 및 Table VIII). 이상의 유통기한 설정 결과는 단순히 이화학적 결과 즉, 보중익기탕 전탕액의 주요 성분인 liquiritin, glycyrrhizin, nodakenin 및 hesperidin의 함량 변화에 따라 유통기한이 계산된 것으로 보다 정확한 유통기한 설정을 위해서는 다른 약리학적 효능 비교가 병행되어야 할 것이다.
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