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문제 정의
- 본 연구에서는 유통 중인 딸기에 접촉으로 야기될 수 있는 생물학적 위해요소인 E. coli DH5α::gfp 균주를 인위적으로 접촉시켜 유통 온도 및 접촉경과 시간에 따른 미생물의 증식과 상처나 부패시 발생되는 추출물에 의해 E. coli DH5α::gfp의 증식가능 여부를 측정하여 현재 유통 중인 딸기의 수확과정 및 유통과정에서 주요 관리점을 모색하고 해결방안을 제시하고자 한다.
가설 설정
- 3)Values with different letters (w-z) within the same row differ significantly (P<0.05).
제안 방법
- E. coli DH5α::gfp에 접촉된 딸기 표면을 10 mm3 크기로 절단하고 2% (v/v) glutaraldehyde을 이용하여 48시간 동안 고정하였다.
- 균주의 GFP 유전자 삽입 여부를 확인하기 위해 형광 현미경(Nikon i30, Japan)을 이용하였다. GFP 유전자가 삽입된 균주는 형광현미경에서 UV(360~400 nm) 또는 청색광(440~480 nm)하에서 특이적인 녹색 형광을 발현하여 접종한 균의 증식 및 생존여부를 판단하였다. 또한 GFP 유전자에 대한 PCR 분석은 Dellaporta 등(27)에 따라 실시하여 확인하고 실험에 사용하였다.
- coli DH5α::gfp에 접촉된 딸기 표면을 10 mm3 크기로 절단하고 2% (v/v) glutaraldehyde을 이용하여 48시간 동안 고정하였다. 고정된 시료는 30, 50, 70, 80, 100% ethanol을 이용하여 순차적으로 탈수처리하고 isoamyl acetate를 이용하여 임계점 건조 후 골드 코팅하였다. 그 후 시료는 JSM-30 scanning electron microscope (JEOL, Japan)를 이용하여 딸기 표면에 분포한 E.
- coli DH5α::gfp 균주는 Hojberg 등(26)의 방법에 따라 형질전환을 실시하였다. 균주의 GFP 유전자 삽입 여부를 확인하기 위해 형광 현미경(Nikon i30, Japan)을 이용하였다. GFP 유전자가 삽입된 균주는 형광현미경에서 UV(360~400 nm) 또는 청색광(440~480 nm)하에서 특이적인 녹색 형광을 발현하여 접종한 균의 증식 및 생존여부를 판단하였다.
- 그 후 시료는 JSM-30 scanning electron microscope (JEOL, Japan)를 이용하여 딸기 표면에 분포한 E. coli DH5α::gfp를 조사하였다.
- 딸기 추출액은 멸균 전 추출액과 멸균 후 추출액으로 구분하여 실험을 실시하였다. 딸기 추출액 함량을 0, 25, 50 및 100%로 구분하였으며 다른 영양원에 의한 영향을 줄이기 위해 minimal broth를 이용하여 조절하였다. 접종원 E.
- 1에 나타내었다. 딸기 추출액은 멸균 전 추출액과 멸균 후 추출액으로 구분하여 실험을 실시하였다. 딸기 추출액 함량을 0, 25, 50 및 100%로 구분하였으며 다른 영양원에 의한 영향을 줄이기 위해 minimal broth를 이용하여 조절하였다.
- 딸기과실 표면에 108 CFU/mL 농도로 조절된 E. coli DH5α::gfp를 작업자 손 표면에 충분히 적신 다음 2, 4, 6회 누적하여 접촉하였다.
- 딸기는 수확작업과 유통과정 중 표면의 물리적 상처 및 손상에 의한 과즙 유출시 유해미생물의 정착 및 증식에 대한 영향을 살펴보고자 딸기 추출물에서의 E. coli DH5α::gfp의 밀도변화를 조사하여 Fig. 1에 나타내었다.
- 딸기는 유통온도 범위인 10~30℃에서 ampicillin과 rifampicin이 첨가된 Luria Bertani broth를 이용하여 각각 4일 동안 E. coli DH5α::gfp의 성장을 조사하였다(Table 1).
- 또한 딸기추출물 농도가 E. coli DH5α::gfp의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 최소배지(minimal broth, Difco Laboratories, Sparks, MD, USA)를 이용하여 딸기 추출물 농도가 각각 0, 25, 50, 100%가 되도록 조절하여 E. coli DH5α::gfp를 104 CFU/mL 수준으로 접종한 다음 25℃에서 각각 96시간 동안 배양하면서 균주의 성장을 측정하였다.
- 미생물의 증식여부를 판단하기 위하여 GFP 마커를 삽입한 E. coli DH5α::gfp는 현미경에서 특이적인 형광반응 발현여부를 조사하였다(Fig. 2‐A).
- 배양온도와 시간이 E. coli DH5α::gfp의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해 10, 15, 20, 25, 30℃에서 각각 24, 48, 72시간 동안 배양하여 균주의 성장을 측정하였다.
- 본 연구는 딸기에 E. coli DH5α::gfp 균주를 인위적으로 접촉시켜 배양 온도(10, 15, 20, 25, 30℃), 시간(24, 47, 72, 96시간) 및 접촉횟수(0, 2, 4, 6회)에 따른 미생물의 증식가능성을 살펴보고, 딸기 추출물 함량에 의해 E. coli DH5α::gfp의 증식가능 여부를 측정하였다.
- 0 mm 두께로 채취하여 미생물 분석에 이용하였다. 시료 20 g에 멸균된 식염수(0.85%, NaCl) 180 mL를 첨가하여 Bag mixer (400, Interscience, France)를 사용하여 120초 동안 혼합한 후 10진 희석법으로 희석하였다. E.
- 이를 기초로 작업과정 중 유해미생물이 접촉에 따라 딸기표면에서 오염 및 증식여부를 구명하기 위해 E. coli DH5α::gfp 배양액에 작업자의 손을 담구었다.
- coli DH5α::gfp의 밀도변화를 조사한 결과는 Table 2에 나타내었다. 작업환경의 변화를 감안하여 배양온도 조건을 10, 15, 20, 25, 30℃로 구분하여 실시하였다. 딸기과실의 접촉횟수에 상관없이 10, 15℃에서는 E.
- 처리구와 동일하게 대조군도 동일한 시간 동안 실온에서 유지하였다. 접촉처리가 끝난 시료는 96시간 동안 배양온도 10, 15, 20, 25, 30℃에서 배양하며 접촉 미생물의 밀도 변화를 조사하였다.
대상 데이터
- 딸기(Fragaria spp.)는 2010년 1월에 대형마트(경기도 수원 소재)에서 구입하였다. 외관이 건전하고 상처가 없는 과실을 선별하여 실험에 사용하였다.
- )는 2010년 1월에 대형마트(경기도 수원 소재)에서 구입하였다. 외관이 건전하고 상처가 없는 과실을 선별하여 실험에 사용하였다. 딸기 추출액 제조를 위해서 시료 500 g을 분쇄기(SFM-353NK, SHINIL Co.
- 표면에 인위적으로 E. coli DH5α::gfp가 접종된 시료는 외피를 두께 5.0 mm 두께로 채취하여 미생물 분석에 이용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, 얻어진 결과들은 SAS software(28)에서 프로그램된 general linear model procedure을 수행하고 분산분석 후 유의적인 차이가 보일 때 평균값 간 차이를 Duncan의 다중검정법을 사용하여 평가하였다(p<0.05).
이론/모형
- GFP 유전자가 삽입된 균주는 형광현미경에서 UV(360~400 nm) 또는 청색광(440~480 nm)하에서 특이적인 녹색 형광을 발현하여 접종한 균의 증식 및 생존여부를 판단하였다. 또한 GFP 유전자에 대한 PCR 분석은 Dellaporta 등(27)에 따라 실시하여 확인하고 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 E. coli DH5α::gfp 균주는 Hojberg 등(26)의 방법에 따라 형질전환을 실시하였다.
성능/효과
- 각각의 온도에서 96시간 배양 후 15, 25℃ 조건에서 E. coli DH5α::gfp의 밀도가 가장 높았으며 10℃에서 가장 낮게 나타났다.
- 대조군으로 딸기 추출물 0%인 경우 minimal broth에서 E. coli DH5α::gfp의 증식은 배양기간 동안 1 log CFU/g 증가하는 수준으로 유지되었다.
- 대조군으로서 딸기 추출물 0%인 경우 minimal broth에서의 E. coli DH5α::gfp의 증식은 배양기간 동안 1 log CFU/g 증가하는 수준으로 유지되었다.
- coli DH5α::gfp의 증식이 유의적으로 높게 나타났으며, 50, 25% 추출액에서 각각 4, 5 log CFU/g 증가하였다. 딸기의 영양성분은 수분 90.1%, 단백질 0.9%, 지질 0.2%, 당질 7.5%이며 본 실험에 사용한 딸기의 당질 성분 중 glucose 2.5%, fructose 2.6%, sucrose 3.8%를 나타내어 당 함량이 높게 나타났다. 본 실험에서 딸기 추출액 100%인 시료군에서 배양 초기 E.
- 본 실험에서 딸기 추출액 100%인 시료군에서 배양 초기 E. coli DH5α::gfp가 접종수준의 밀도를 나타내었으나 배양시간이 경과함에 따라 증식이 감소한 것은 높은 당 함량에 의한 삼투압 등 영향으로 미생물의 증식이 이루어지지 않은 것으로 판단된다.
- 이는 딸기의 저장시 유해 미생물의 증식은 온도 및 영양성분에 의한 영향을 많이 받는 것으로 판단된다. 본 연구결과는 딸기 수확시 작업자와 과실의 접촉을 최소화하며 유통온도를 저온으로 유지하는 것은 유해미생물에 의한 위험성을 줄일 수 있음을 제시하였다.
- Yang(34)은 딸기를 0~20℃로 저장한 경우 20>4>0℃ 순서로 경도, vitamin C 함량, 당도가 감소할 뿐만 아니라 품질손상도 큰 것으로 나타났다. 이처럼 저장온도가 높을수록 유해미생물의 성장에 적합한 환경을 제공하는 것으로 판단되며 딸기의 경우 고온에서 저장하였을 경우 다양한 미생물의 활성이 활발해져 저장성이 저하되는 것으로 나타났다.
- 접종원 E. coli DH5α::gfp의 밀도는 4 log CFU/g 수준으로 접종하여 딸기 추출액 함량이 미생물의 증식에 미치는 영향을 살펴본 결과 추출액의 멸균여부에 상관없이 유사한 경향을 나타내었다.
- 접촉횟수에 따른 미생물 밀도의 변화를 살펴보면 2~6회 접촉한 시료군에서 저온보다는 25℃이상의 조건에서 E. coli DH5α::gfp의 밀도가 높게 나타났다.
- 접촉횟수에 의한 E. coli DH5α::gfp의 증식은 접촉횟수에 상관없이 10, 15℃에서는 E. coli DH5α::gfp의 성장이 이루어지지 않았으며 20℃에서는 접촉횟수 증가에 따라 1.52~3.26 log CFU/g 수준으로 증식하였으나 대조군과의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- 추출물 함량이 50% 미만인 경우 대조군에 비해 E. coli DH5α::gfp의 증식이 유의적으로 높게 나타났으며, 50, 25% 추출액에서 각각 4, 5 log CFU/g 증가하였다.
후속연구
- 실제로 배추(22), 유채(23), 담배(24), 메론(25)에 적용한 연구사례가 보고되었다. GFP가 삽입된 균주를 사용 할 경우 분석시료에서 증식 뿐만 아니라 현미경을 통한 분포양상 및 오염도를 좀 더 정확히 파악하는데 도움이 될 것이다.
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