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문제 정의
- 향후 Rhizobium sp. RH84에 대한 균주의 특성을 파악하고, 실제 간척지 포장 실험에서의 헤어리베치의 생산량 증대 가능성에 관한 연구를 계속하고자 한다.
- , 2012). 본 연구에서는 뿌리혹박테리아에 의한 헤어리베치의 생육 증진에 초점을 맞추었으며, 특히 간척지에서도 활용 가능한 기술을 개발하고자 하였다. 즉 헤어리베치에 대한 감염 및 근류 형성능이 우수할 뿐 아니라 간척지의 불균일한 염 농도에서도 생장이 가능하며, 질소 고정력이 높은 균주를 분리 선발하여 그 활용 가능성을 검토하고자 하였다.
- 본 연구에서는 새만금 간척지의 특성을 고려하여 간척지 토양의 개량을 위한 녹비작물로서 헤어리베치를 기본적으로 이용하고자 하였으며, 후작물과 간척지 토양에 충분한 유기물 공급을 위해 헤어리베치의 질소 고정능을 높이는 방법을 찾고자 하였다. 지금까지 국내에 보고된 관련 연구는 헤어리베치의 생산성 및 헤어리베치 생장 후의 토양 변화가 주된 연구분야라 할 수 있다(Seo and Lee, 1998; Kim et al.
- 본 연구에서는 헤어리베치로부터 뿌리혹 형성능과 질소 고정 능이 우수한 Rhizobium 균주를 분리하고자 하였다. 전국의 일곱 군데 헤어리베치 재배 지역에서 수집 후 뿌리혹으로부터 균주를 분리하였고, 헤어리베치에 분리 균주를 재접종하여 뿌리혹 형성능과 질소 고정능을 확인하였다.
- 본 연구에서는 뿌리혹박테리아에 의한 헤어리베치의 생육 증진에 초점을 맞추었으며, 특히 간척지에서도 활용 가능한 기술을 개발하고자 하였다. 즉 헤어리베치에 대한 감염 및 근류 형성능이 우수할 뿐 아니라 간척지의 불균일한 염 농도에서도 생장이 가능하며, 질소 고정력이 높은 균주를 분리 선발하여 그 활용 가능성을 검토하고자 하였다. 향후 본 결과는 기존의 화학적 토양 개량 방법보다 더욱 친환경적이고 지속 가능한 방법으로서 간척지 토양의 개량 효과를 가져 올 것으로 사료된다.
제안 방법
- 0.5% 이상의 NaCl 농도에서 생육 가능한 16개의 Rhizobium 균주를 실제 헤어리베치 종자에 접종 시, 식물의 뿌리혹 발달에 영향을 주는지 pot test를 통해 확인하였다. 16개의 균주에 대하여 질석 시험구와 질석 + 상토 시험구로 나누어 각각 실험한 결과 두 시험구 모두 Rhizobium sp.
- 8주간 생육시킨 헤어리베치의 뿌리를 물로 가볍게 세척 후 수분을 제거하여 유리로 된 50 ml serum bottle에 넣고 고무마개로 막은 다음, 5 ml 공기를 뺀 후 동량의 acetylene gas를 주입하였다. 30℃에서 60분간 반응시킨 후 생성된 ethylene gas 양을 gas chromatograph-FID (Shimazu GC-2010, Japan)를 이용하여 정량분석하였다. 분석용 컬럼으로는 HP-AL/S (length 50 m, diameter 0.
- 53 mm, film 15 m, Agilent technologies, USA)를 사용하였고, Carrier gas는 He을 사용하였다. Injector, detector, column 온도는 각각 200℃, 250℃, 110℃로 2분 동안 분석하였다.
- Rhizobium sp. RH1, 3, 81, 82, 84, 93 균주는 0.5% NaCl 농도까지 생육하였고, RH10, 35, 129균주는 1% NaCl 농도까지, RH6, 76, 99, 101, 106, 122, 128은 3% NaCl 농도까지 생육하였다(Table 2). 현재까지 완공되었거나 개발 중인 재염되지 않은 간척지의 염 농도가 0.
- 1이 되게 증류수에 현탁 후, 6 well plate (SPL, Korea)에 5 μl씩 동량으로 접종 후 spreading하여 28℃에서 3–7일간 생장 유무 및 생육 정도를 확인하였다. 각 균주의 생장은 YM 배지에 기본적으로 0.01%의 NaCl을 첨가 후 비교하였다.
- 헤어리베치의 뿌리혹으로부터 Rhizobium 균주를 분리하기 위해 7개 지역의 재배지에서 채집 한 뿌리혹으로부터 총 107점의 세균 콜로니를 분리하였다(Table 1). 각 분리 균주들은 NCBI BLAST로 분석하여 분리 균의 동정 및 염기서열의 유사도를 분석하였다. 전남 장흥에서 분리된 6개의 colony 모두, 전남 강진에서 분리된 5개의 colony 중 3개인 60%가 Rhizobium 속이었다.
- 각 처리구는 3반복하였고 20–22℃로 유지되는 유리 온실 내에서 자연광의 상태로 8주간 생육시킨 후, 형성된 뿌리혹의 수, 크기, 색깔과 모양을 비교 관찰하였다.
- RH84의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였으며, phylogenetic tree를 통하여 Rhizobium sp. 간의 유전적 관계를 분석하였다(Fig. 3). 그 결과, R.
- 고체 배양 시에는 각 Rhizobium 속 균주를 OD 0.1이 되게 증류수에 현탁 후, 6 well plate (SPL, Korea)에 5 μl씩 동량으로 접종 후 spreading하여 28℃에서 3–7일간 생장 유무 및 생육 정도를 확인하였다.
- 분리된 Rhizobium 속 균주들의 염 저항성을 평가하기 위해서 YM 액체 및 고체배지 상에 0.5, 1, 3, 5%의 NaCl을 첨가한 후 균 생육 정도를 조사하였다. 액체 배양 시에는 Rhizobium 속 균주를 OD 0.
- 분리된 여러 종류의 colony 중 Rhizobium 속만을 선별하기 위해 배양된 균체에서 genomic DNA를 추출 후 27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CAG-3′)와 1492R (5′-GGT TAC TTG TTA CGA CTT-3′) 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 증폭하여 염기서열을 분석하였고, Rhizobium 속으로 확인된 균주만 본 실험에 사용하였다.
- 분리한 Rhizobium 속 각 균주들에 의한 질소 고정능 측정을 위해서 헤어리베치를 8주간 생육시킨 후 이때 형성된 뿌리혹을 채취하여 acetylene (C2H2) 환원에 의한 ethylene (C2H4) 생성량을 gas chromatography로 확인하였다. 앞의 뿌리혹 형성능 검정 실험과 동일하게 질석을 사용한 시험구와 상토와 질석을 동량으로 섞은 시험구로 나누어 각각 실시하였다.
- ) 생성량을 gas chromatography로 확인하였다. 앞의 뿌리혹 형성능 검정 실험과 동일하게 질석을 사용한 시험구와 상토와 질석을 동량으로 섞은 시험구로 나누어 각각 실시하였다.
- 액체 배양 시에는 Rhizobium 속 균주를 OD 0.1이 되게 접종하여 28℃에서 130 rpm으로 3–7일간 배양하여 그 생육 정도를 580 nm에서 흡광도로 비교하였다(Ultrospec 3000, Amersham Pharmacia Biotech).
- 본 연구에서는 헤어리베치로부터 뿌리혹 형성능과 질소 고정 능이 우수한 Rhizobium 균주를 분리하고자 하였다. 전국의 일곱 군데 헤어리베치 재배 지역에서 수집 후 뿌리혹으로부터 균주를 분리하였고, 헤어리베치에 분리 균주를 재접종하여 뿌리혹 형성능과 질소 고정능을 확인하였다. 그 결과, 52개의 Rhizobium 속 균주를 분리하였고, 이 중 0.
- 질석을 2/3 가량 채운 유리 시험관(지름 3 cm, 길이 15 cm)과 상토와 질석을 동량으로 섞어 채운 플라스틱 비닐 pot (가로 8 cm, 세로 8 cm)의 두 가지 시험구로 나누어 실험하였고, 상토와 질석은 121℃에서 30분간 멸균한 후 사용하였다. 종자에 처리할 균주는 고체 배지 상에서 3–4일간 배양 후 멸균 증류수로 회수하여 2ⅹ109 CFU/ml 농도의 균체 현탁액으로 만들었다.
- 채집한 헤어리베치의 뿌리는 95% 에탄올 1분, 2% 차아염소산 나트륨으로 2분간 표면 살균하고, 증류수로 충분히 세척 후 메스로 뿌리혹을 절개하여 그 단면을 YM agar (0.04% yeast extract, 1% mannitol, 0.05% K2HPO4, 0.02% MgSO4․7H2O, 0.01% NaCl, 1.8% agar) 배지에 직접 획선으로 그어 28℃ 항온기에서 3–4일간 배양하였다.
- 헤어리베치에 대한 뿌리혹 형성능을 확인하기 위하여 분리한 균주들을 헤어리베치 종자에 접종한 후 뿌리혹 형성 유무를 관찰하였다. 헤어리베치 종자는 농촌진흥청 국립식량과학원에서 개발 육성된 청풍보라 품종을 분양 받아 사용하였으며, 경실종자 제거 후 표면 살균하여 실험에 사용하였다.
- 헤어리베치의 뿌리혹으로부터 Rhizobium 균주를 분리하기 위해 7개 지역의 재배지에서 채집 한 뿌리혹으로부터 총 107점의 세균 콜로니를 분리하였다(Table 1). 각 분리 균주들은 NCBI BLAST로 분석하여 분리 균의 동정 및 염기서열의 유사도를 분석하였다.
대상 데이터
- 16개의 균주에 대하여 질석 시험구와 질석 + 상토 시험구로 나누어 각각 실험한 결과 두 시험구 모두 Rhizobium sp. RH1, RH3, RH81, RH82, RH84, RH93의 6개 균주를 접종한 헤어리베치에서 뿌리혹이 형성되었다. 그러나 두 시험구간의 뿌리혹의 크기나 개수에는 차이가 있었다.
- 본 연구에서 분리된 Rhizobium sp. RH84는 미생물자원센터(Korea Collection for Type Culture)에 균주를 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC12024BP를 부여받았다.
- 30℃에서 60분간 반응시킨 후 생성된 ethylene gas 양을 gas chromatograph-FID (Shimazu GC-2010, Japan)를 이용하여 정량분석하였다. 분석용 컬럼으로는 HP-AL/S (length 50 m, diameter 0.53 mm, film 15 m, Agilent technologies, USA)를 사용하였고, Carrier gas는 He을 사용하였다. Injector, detector, column 온도는 각각 200℃, 250℃, 110℃로 2분 동안 분석하였다.
- 그러나 이러한 결과만으로는 염의 분포가 불균일한 간척지에 헤어리베치를 적용하는 데는 한계가 있을 것으로 판단되었다. 이에 본 연구에서는 전국의 헤어리베치 재배지에서 뿌리혹에 공생하는 Rhizobium을 분리하였고, 그 중 0.5% 이상의 염 농도에서 생육이 가능한 Rhizobium을 헤어리베치에 각각 적용하였다. 그 결과 헤어리베치의 뿌리혹에 공생하는 Rhizobium의 종류에 따라 질소 고정능이 달라지는 것을 확인하였다.
- 헤어리베치 유래의 뿌리혹박테리아 선발을 위하여, 헤어리베치가 재배되고 있는 지역으로서 장흥군, 강진군, 당진군, 예산군, 부안군, 예천군 그리고 평택시 일원에서 헤어리베치를 채집하였다. 채집한 헤어리베치의 뿌리는 95% 에탄올 1분, 2% 차아염소산 나트륨으로 2분간 표면 살균하고, 증류수로 충분히 세척 후 메스로 뿌리혹을 절개하여 그 단면을 YM agar (0.
- 헤어리베치에 대한 뿌리혹 형성능을 확인하기 위하여 분리한 균주들을 헤어리베치 종자에 접종한 후 뿌리혹 형성 유무를 관찰하였다. 헤어리베치 종자는 농촌진흥청 국립식량과학원에서 개발 육성된 청풍보라 품종을 분양 받아 사용하였으며, 경실종자 제거 후 표면 살균하여 실험에 사용하였다. 표면 살균은 95% 에탄올(absolute for analysis, Merck)로 1분 30초, 2% sodium hypochlorite solution (JUNSEI)으로 3분간 처리 후 멸균된 증류수로 여러 번 세척하였다.
성능/효과
- 뿌리혹 형성능은 16개 균주 중 Rhizobium sp. RH1, RH3, RH81, RH82, RH84, RH93의 균주를 접종한 시험구에서 우수하였다. 또한, 질소 고정능을 확인한 결과 Rhizobium sp.
- , 2005). 결과적으로 뿌리혹의 색, 모양, 크기가 유사한 RH3, RH81, RH84 중 가장 높은 질소 고정력을 보이는 RH84를 최종적으로 선발하였다. RH84의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였으며, phylogenetic tree를 통하여 Rhizobium sp.
- 5% 이상의 염 농도에서 생육이 가능한 Rhizobium을 헤어리베치에 각각 적용하였다. 그 결과 헤어리베치의 뿌리혹에 공생하는 Rhizobium의 종류에 따라 질소 고정능이 달라지는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 판단할 때 본 연구에서 분리한 Rhizobium sp.
- 전국의 일곱 군데 헤어리베치 재배 지역에서 수집 후 뿌리혹으로부터 균주를 분리하였고, 헤어리베치에 분리 균주를 재접종하여 뿌리혹 형성능과 질소 고정능을 확인하였다. 그 결과, 52개의 Rhizobium 속 균주를 분리하였고, 이 중 0.5% NaCl 농도 이상에서 자라는 Rhizobium은 16균주이었다. 뿌리혹 형성능은 16개 균주 중 Rhizobium sp.
- 3). 그 결과, R. gallicum과 R. hainanense와 는 유전적 차이가 매우 크게 나며, R. leguminosarum, R. etli, R. tropici와 가장 유사한 결과를 보였다. 지금까지 헤어리베치와 공생 관계로 알려져 있는 R.
- leguminosarum 보다 RH84가 더욱 우수한 균주임을 증명하는 결과이다. 따라서 RH84는 우수한 뿌리혹 형성능과 높은 질소 고정능으로 헤어리베치의 녹비 수율을 증가시키며 간척지 토양 유기물 증가에 큰 영향을 줄 것으로 사료된다. 본 연구에서 분리된 Rhizobium sp.
- 이렇게 토양에 따라 형성되는 뿌리혹의 개수와 크기가 차이 나는 이유는 상토의 유무에 따른 토양 내 유기물 함량에 따른 차이로 판단 되며, 실제 간척지에 적용 시에는 유기물 함량이 비교적 적은 질석 시험구의 경우와 유사한 결과가 나올 것으로 추측된다. 또한, Rhizobium을 접종하지 않은 무접종구에서는 뿌리혹이 형성되지 않은 것으로 보아(자료 미제시) Rhizobium의 추가적 접종은 헤어리베치의 뿌리혹 발달에 영향을 미칠 것이라 사료되며, 이는 헤어리베치의 녹비 수율에도 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 이러한 환경에서 헤어리베치의 뿌리혹에 정착하여 공생하기 위해서는 Rhizobium 의 염 저항성도 중요할 것으로 생각된다. 본 연구에서 Rhizobium 속으로 확인 선발된 균주의 내염성을 시험 비교한 결과 52개의 균주 중에서 30%인 16개 균주가 NaCl 0.5% 이상의 액체와 고체 배지 상에서 생육 가능하였다. Rhizobium sp.
- 경북 예천에는 분리된 colony의 29%가, 나머지 지역에서는 50% 이상의 colony가 Rhizobium 속으로 확인되었다. 분리된 52개의 Rhizobium은 R. etli, R. leguminosarum, R. cellulosilyticium 등으로 확인되었다(자료 미제시).
- 질석 시험구에서는 각 헤어리베치 당 뿌리혹의 수는 15개 내외였으며 RH84, RH82 그리고 RH93의 순으로 뿌리 혹의 개수가 많이 형성되었고 그 크기는 1–2 mm 범위로 유사하였다. 뿌리혹의 색은 접종 균주에 따라 흰색, 분홍색, 엷은 붉은색을 띄었으며 모양은 모두 원형 내지는 타원형이었다(Table 3, Fig. 1). 질석 + 상토 시험구에서는 질석 시험구와 마찬가지로 뿌리혹의 색은 흰색, 분홍색, 붉은색을 띄었고, 모양은 원형 혹은 타원형의 혹이 뭉쳐진 모양이었다.
- 이는 동일한 방법으로 실험한 Table 4와는 다른 결과로 뿌리혹의 개수가 많고 크기가 큰 RH93은 다른 처리 균주에 비해 상대적으로 질소 고정능이 낮은 반면, 뿌리 혹의 개수가 적고 크기가 작은 RH84가 질소 고정능이 가장 높은 것으로 확인되었다. 이 결과로 보아 질소 고정능이 뿌리혹의 개수나 크기와의 상관성보다 뿌리혹 내부의 색깔과 관련 있는 것이라 판단된다. RH84를 처리한 경우 두 가지의 시험구 모두에서 분홍색 내지 연한 붉은색을 띄었고, RH3과 RH81을 처리한 경우도 같은 패턴의 색을 보였다(Tables 3 and 4).
- RH84, RH3, RH81의 순으로 질소고정능이 높았다(Table 5). 이는 동일한 방법으로 실험한 Table 4와는 다른 결과로 뿌리혹의 개수가 많고 크기가 큰 RH93은 다른 처리 균주에 비해 상대적으로 질소 고정능이 낮은 반면, 뿌리 혹의 개수가 적고 크기가 작은 RH84가 질소 고정능이 가장 높은 것으로 확인되었다. 이 결과로 보아 질소 고정능이 뿌리혹의 개수나 크기와의 상관성보다 뿌리혹 내부의 색깔과 관련 있는 것이라 판단된다.
- leguminosarum으로 동정 된 RH129 균주는 헤어리베치 뿌리혹 형성 실험에서 뿌리혹을 형성하지 못하였다(자료 미제시). 이는, 청풍보라 종의 헤어리베치 뿌리혹 형성에는 유전적 유사성을 갖는 R. leguminosarum 보다 RH84가 더욱 우수한 균주임을 증명하는 결과이다. 따라서 RH84는 우수한 뿌리혹 형성능과 높은 질소 고정능으로 헤어리베치의 녹비 수율을 증가시키며 간척지 토양 유기물 증가에 큰 영향을 줄 것으로 사료된다.
- 각 분리 균주들은 NCBI BLAST로 분석하여 분리 균의 동정 및 염기서열의 유사도를 분석하였다. 전남 장흥에서 분리된 6개의 colony 모두, 전남 강진에서 분리된 5개의 colony 중 3개인 60%가 Rhizobium 속이었다. 경북 예천에는 분리된 colony의 29%가, 나머지 지역에서는 50% 이상의 colony가 Rhizobium 속으로 확인되었다.
- 5% NaCl 농도까지 생육하였고, RH10, 35, 129균주는 1% NaCl 농도까지, RH6, 76, 99, 101, 106, 122, 128은 3% NaCl 농도까지 생육하였다(Table 2). 현재까지 완공되었거나 개발 중인 재염되지 않은 간척지의 염 농도가 0.33% 이상이며 그 분포가 불균일하다는 점을 고려하면 0.5% 이상에서 생육이 가능한 16개의 Rhizobium 속 균주는 간척지 환경에서도 생육이 가능할 것으로 사료된다.
후속연구
- , 2012)에 초점이 맞추어져 있었다. 그러나 이러한 결과만으로는 염의 분포가 불균일한 간척지에 헤어리베치를 적용하는 데는 한계가 있을 것으로 판단되었다. 이에 본 연구에서는 전국의 헤어리베치 재배지에서 뿌리혹에 공생하는 Rhizobium을 분리하였고, 그 중 0.
- RH84가 가장 높은 acetylene reduction activity를 보였다. 이러한 결과는 향후 염의 분포가 불균일한 간척지에 적용 시에도 헤어리베치의 생육을 촉진해 녹비 작물로의 활용 가능성을 높여주는 결과로 판단된다.
- 즉 헤어리베치에 대한 감염 및 근류 형성능이 우수할 뿐 아니라 간척지의 불균일한 염 농도에서도 생장이 가능하며, 질소 고정력이 높은 균주를 분리 선발하여 그 활용 가능성을 검토하고자 하였다. 향후 본 결과는 기존의 화학적 토양 개량 방법보다 더욱 친환경적이고 지속 가능한 방법으로서 간척지 토양의 개량 효과를 가져 올 것으로 사료된다.
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