[논문]장수풍뎅이 유충의 분변에 존재하는 방선균의 다양성 및 항균활성

이혜원; 안재형; 김민욱; 원항연; 송재경; 이성재; 김병용

doi:10.7845/kjm.2013.3041

장수풍뎅이 유충의 분변에 존재하는 방선균의 다양성 및 항균활성
Diversity and Antimicrobial Activity of Actinomycetes from Fecal Sample of Rhinoceros Beetle Larvae 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.49 no.2, 2013년, pp.156 - 164

이혜원 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 안재형 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 김민욱 (경희대학교 생물학과) , 원항연 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 송재경 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 이성재 (경희대학교 생물학과) , 김병용 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과)

초록
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방선균은 의약, 농업 및 식품 생산 등에 유용하게 사용되는 이차대사물질을 생산하는 미생물 자원으로 자연환경 내에서 많은 생물들과 긴밀한 상호작용을 유지하고 있다. 본 연구에서는 장수풍뎅이 유충의 분변에 존재하는 방선균의 다양성과 기능성을 조사하기 위해서 비배양적 접근과 배양적 방법으로 실험을 수행하였다. 먼저 시료로부터 직접 추출한 community DNA에서 방선균-특이 primer를 이용하여 방선균의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭, 클로닝한 후에 각 clone에 삽입된 염기서열을 분석하였다. 총 37개의 염기서열을 얻었으며 계통분류학적 분석을 수행한 결과, 15속 24종으로 분류되었다. 아울러 53개의 방선균 균주를 장수풍뎅이 유충 분변으로부터 분리하였다. 형태학적 특징을 비교하여 최종적으로 27개의 균주를 선발하여 다양성, 항균활성 및 생화학적 특징을 검정하였다. 분리된 균주들은 4속 14종으로 분류되었으며, 24균주(89%)는 Streptomyces 속으로 분류되었다. 대다수의 균주들이 식물병원성 곰팡이와 그람양성 세균에 대해 길항 효과를 보였다. 또한 많은 균주들이 셀룰로오스와 카제인을 분해하는 생화학적 특징을 보였다. 본 연구를 통해, 장수풍뎅이 유충의 분변 시료로부터 다양한 방선균이 분리될 수 있으며, 분리된 균주들은 다양한 항균효과 및 효소활성을 지니고 있다는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 연구는 장수풍뎅이와 같은 곤충의 장과 분변은 다양한 방선균의 서식처이며, 이곳에서 유용한 생리활성 물질을 발견할 수 있다는 것을 제시한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Actinomycetes produce diverse secondary metabolites which have the primary importance in medicine, agriculture and food production, and key to this is their ability to interact with other organisms in natural habitats. In this study, we have investigated the taxonomical and functional diversity of actinomycetes in fecal sample of rhinoceros beetle larvae (Allomyrina dichotoma L.) by using culture-dependent and -independent approaches. For the culture-independent approach, the community DNA was extracted from the sample and 16S rRNA genes of actinomycetes were amplified using actinomycetes-specific PCR primers. Thirty-seven clones were classified into 15 genera and 24 species of actinomycetes. For the culture-dependent approach, 53 strains were isolated from larval feces, of which 27 isolates were selected based on morphological characteristics. The isolates were classified into 4 genera and 14 species, and 24 isolates (89%) were identified as the genus Streptomyces. Many of the representative isolates had antimicrobial activities against plant pathogenic fungi and Gram-positive bacteria. In addition, most of the isolates (78%) showed biochemical properties to hydrolyze cellulose and casein. The results demonstrated that diverse and valuable actinomycetes could be isolated from insect fecal samples, indicating that insect guts can be rich sources for novel bioactive compounds.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

방선균은 의약, 농업 및 식품 생산 등에 유용하게 사용되는 이차대사물질을 생산하는 미생물 자원으로 자연환경 내에서 많은 생물들과 긴밀한 상호작용을 유지하고 있다. 본 연구에서는 장수풍뎅이 유충의 분변에 존재하는 방선균의 다양성과 기능성을 조사하기 위해서 비배양적 접근과 배양적 방법으로 실험을 수행하였다. 먼저 시료로부터 직접 추출한 community DNA에서 방선균-특이 primer를 이용하여 방선균의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭, 클로닝한 후에 각 clone에 삽입된 염기서열을 분석하였다.

가설 설정

본 연구에서는 장수풍뎅이 유충의 분변을 비배양적 방법으로 방선균의 다양성을 분석하였고, 배양적 방법으로 직접 방선균을 분리 배양하였다. 배양된 방선균의 항균활성능 및 생화학적인 특성을 분석하여 생물소재로서의 가치를 평가하였다.

제안 방법

, 2007)의 neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987) 방법에 의해 계통수를 작성하였다. 1,000회 반복 bootstrap 분석(Felsenstein, 1985)을 통해 계통수의 안정성을 평가하였다.
최종 선발된 방선균의 항균활성능을 조사하기 위하여 식물병원성 곰팡이(Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804, Fusarium oxysporum KACC 40037), 효모(Candida albicans Tu 164, Saccharomyces cerevisiae 6A), 세균(Escherichia coli DSM 5698, Staphylococcus aureus DSM 20231, Bacillus subtilis DSM 10)을 검정균주로 사용하였다. C. gloeosporioides와 F. oxysporum에 대한 항균활성 검정은 in vitro 항균활성 확인법에 따라 potato dextrose agar (PDA; Difco Co., USA) 배지에 검정균주를 각각 접종한 후 시험균주를 대치배양하여 균체 주위에 형성된 생육저지대(clear zone)의 크기에 따라 항균활성을 측정하였다. 효모(C.
Color grouping을 통해 선발한 대표 방선균들을 각각 trypic soy broth (TSB) 3 ml에 3일간 배양하여 PureHelix™ Genomic DNA Prep Kit (NanoHelix, Korea)로 genomic DNA를 추출하였다.
, Korea) 10 µl, 10 µM의 forward / reverse primer 각 1 µl, H₂O 7 µl, DNA 시료(20 ng/µl)를 PCR tube에 넣고 잘 혼합하였다. PCR 반응은 95℃에서 2분간 initial denaturation 후에, 30 cycle 반복수행으로 denaturation 95℃에서 30초, annealing 45초, extension 72℃ 1분 동안 수행한 후 72℃에서 5분간 final extension하는 조건으로 실시하였다. 이때 annealing 온도는 첫 번째 primer (S primer) set는 69℃에서, 두 번째 primer (C primer) set는 59℃에서 수행하였다.
PCR 증폭 산물은 전기영동으로 확인한 후에 QIAquick® PCR Purification kit (QIAGEN Inc., Germany)를 이용하여 정제하였다.
장수풍뎅이 유충의 분변 시료로부터 추출한 community DNA를 주형으로 방선균의 16S rRNA 유전자만 특이적으로 검출하는 primer를 사용하여 PCR한 결과, SC-Act-235aS20/SCAct-878aA19 primer (S-primer) set으로부터 clone 16개, Com2xf/Ac1186r primer (C-primer) set으로부터 clone 21개를 얻었다. 각 clone의 16S rRNA 유전자 염기서열은 EzBioCloud 데이터베이스를 이용하여 primer set별로 2개의 계통수를 작성하고 장수풍뎅이 유충 분변 속 방선균의 다양성을 분석하였다(Figs. 1 and 2).
셀룰로오스 배지는 CMC (carboxymethyl cellulose) 2% stock 용액을 R2A agar 배지에 혼합하여 제조하였다. 균주 배양 후 0.1% congo red을 평판 위로 주입하였고, 30분 후에 1 M NaCl solution으로 15분간 탈색하여 투명환의 크기를 측정하였다. 카제인 배지는 skim milk 25 g/250 ml을 115℃에 13분, modified Bennett's agar 250 ml을 121℃에 15분간 각각 가압멸균하고 45℃로 식힌 후 혼합하여 제조하였다.
냉동(-80℃) 상태로 보관된 장수풍뎅이 유충 분변시료에서 FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 community DNA를 추출하여 PCR의 주형으로 사용하였다.
본 연구에서는 장수풍뎅이 유충의 분변에 존재하는 방선균의 다양성과 기능성을 조사하기 위해서 비배양적 접근과 배양적 방법으로 실험을 수행하였다. 먼저 시료로부터 직접 추출한 community DNA에서 방선균-특이 primer를 이용하여 방선균의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭, 클로닝한 후에 각 clone에 삽입된 염기서열을 분석하였다. 총 37개의 염기서열을 얻었으며 계통분류학적 분석을 수행한 결과, 15속 24종으로 분류되었다.
본 연구에서는 장수풍뎅이 유충의 분변을 비배양적 방법으로 방선균의 다양성을 분석하였고, 배양적 방법으로 직접 방선균을 분리 배양하였다. 배양된 방선균의 항균활성능 및 생화학적인 특성을 분석하여 생물소재로서의 가치를 평가하였다.
분리 균주의 생화학적인 특성을 분석하기 위해서 셀룰로오스, 카제인, 키틴을 첨가한 배지를 각각 만들어 균주를 접종한 후 28℃에서 7일간 배양한 후 투명환의 크기에 따라 활성 수준을 결정하였다. 셀룰로오스 배지는 CMC (carboxymethyl cellulose) 2% stock 용액을 R2A agar 배지에 혼합하여 제조하였다.
배지상의 콜로니들은 ampicillin이 포함된 LB broth 3 ml에 접종한 후 배양하여 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 Plasmid를 분리하였다. 분리된 Plasmid는 Genotech 사(Korea)에 의뢰하여 insert의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 EzBioCloud (http://www.
사육은 온도 25℃, 장일조건(16 h Light: 8 h Dark), 상대습도 70% 내외로 하여, 참나무의 발효톱밥으로 채워진 플라스틱 통(18×12×14 cm)에서 한 마리씩 사육하였다.
선발 균주들의 생화학적 특성을 규명하기 위해 카제인, 셀룰로오스, 키틴에 대한 가수 분해능을 분석하였다(Table 1). 카제인 분해능에 양성반응을 나타낸 것은 27균주 중 21균주로 대부분의 균주가 단백질 분해능력을 보였다.
선발된 27균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 EzBioCloud 데이터베이스에서 검색된 유사 균주들과 계통수를 작성하여 계통학적 다양성을 분석하였다(Fig. 3). 결정된 염기서열과 유사 표준균주간의 상동성은 98.
수집한 장수풍뎅이 유충 3마리의 혼합 분변 시료 1 g을 starch casein agar (SCA) 배지에 희석 평판하였다. 28℃에서 14일간 배양하면서 SCA 배지 상에 형성된 방선균 콜로니를 선택하여 oatmeal agar (ISP3) 배지에 계대하여 14일간 배양하여 순수 분리하였다.
사육은 온도 25℃, 장일조건(16 h Light: 8 h Dark), 상대습도 70% 내외로 하여, 참나무의 발효톱밥으로 채워진 플라스틱 통(18×12×14 cm)에서 한 마리씩 사육하였다. 시료채취시에는 유충을 사육통 외부로 꺼내어 배출하는 신선한 분변을 각 개체로부터 수집한 후에 혼합하여 분석에 사용하였다.
이 genomic DNA를 주형으로 Kim 등(2012)의 조건으로 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′) primer를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.
장수풍뎅이 유충의 분변 시료에서 총 53균주의 방선균을 순수 분리하였다. 일차적으로 분리된 방선균을 대상으로 color grouping을 통해 형태적으로 유사한 그룹을 분류하였다. 그 결과 53개의 균주는 10개의 multi-membered group과 6개의 single-membered group 등 모두 16개의 그룹으로 분류되었다(자료 미제시).
정제한 시료는 TOPO® TA cloning kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 ligation 후 One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli (Invitrogen)에 열충격 방법으로 클로닝하였다.
순수 분리된 방선균들은 Antony-Babu 등(2010)의 방법에 따라 color grouping을 수행하여 대표균주들을 형태적으로 선발하였다. 즉, 개별 균주들을 aerial spore mass color, reverse color, diffusible pigment color에 기반하여 형태적으로 분류하였다.
이 genomic DNA를 주형으로 Kim 등(2012)의 조건으로 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′) primer를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제 후 Genotech 사(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였고, EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net; Kim et al., 2012)에서 표준균주들과 염기서열의 상동성을 비교하였다.
그 중에서 aerial spore mass color가 light brown이며 reverse color가 yellow, soluble pigment를 형성하지 않는 group이 14개 균주로 가장 많았다. 형태적 분류기준에 따라 53균주 중 중복된 균주를 배제하고 27균주를 최종 선발하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하고 항균활성 및 생화학적 특성을 조사하였다.
아울러 53개의 방선균 균주를 장수풍뎅이 유충 분변으로부터 분리하였다. 형태학적 특징을 비교하여 최종적으로 27개의 균주를 선발하여 다양성, 항균활성 및 생화학적 특징을 검정하였다. 분리된 균주들은 4속 14종으로 분류되었으며, 24균주(89%)는 Streptomyces 속으로 분류되었다.
, USA) 배지에 검정균주를 각각 접종한 후 시험균주를 대치배양하여 균체 주위에 형성된 생육저지대(clear zone)의 크기에 따라 항균활성을 측정하였다. 효모(C. albicans, S. cerevisiae)와 세균(E. coli, S. aureus, B. subtilis)에 대한 항균활성 시험을 위해 각각 YM broth (Difco Co.), LB broth (Difco Co.)에 검정균주 1 ml을 각각 접종하여 분주한 후에 시험 균주와 대치 배양하여 균체 주위의 생육저지대의 크기에 따라 항균활성 수준을 결정했다. 아울러 이들 균주의 이차 대사물질 생합성 유전자를 검출하기 위해서 Kim 등(2011)의 방법에 따라 NRPS (Non-ribosomal peptide synthetase)와 PKS-I (Type I polyketide synthase) 유전자에 특이적인 primer를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.

대상 데이터

농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과에서 사육중인 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma L.)의 3령 유충 3마리를 본 실험에 사용하였다. 사육은 온도 25℃, 장일조건(16 h Light: 8 h Dark), 상대습도 70% 내외로 하여, 참나무의 발효톱밥으로 채워진 플라스틱 통(18×12×14 cm)에서 한 마리씩 사육하였다.
분리 균주의 생화학적인 특성을 분석하기 위해서 셀룰로오스, 카제인, 키틴을 첨가한 배지를 각각 만들어 균주를 접종한 후 28℃에서 7일간 배양한 후 투명환의 크기에 따라 활성 수준을 결정하였다. 셀룰로오스 배지는 CMC (carboxymethyl cellulose) 2% stock 용액을 R2A agar 배지에 혼합하여 제조하였다. 균주 배양 후 0.
최종 선발된 방선균의 항균활성능을 조사하기 위하여 식물병원성 곰팡이(Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804, Fusarium oxysporum KACC 40037), 효모(Candida albicans Tu 164, Saccharomyces cerevisiae 6A), 세균(Escherichia coli DSM 5698, Staphylococcus aureus DSM 20231, Bacillus subtilis DSM 10)을 검정균주로 사용하였다. C.

데이터처리

분리된 Plasmid는 Genotech 사(Korea)에 의뢰하여 insert의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 EzBioCloud (http://www.ezbiocloud. net; Kim et al., 2012)에서 표준균주들과 염기서열의 상동성을 비교하였다.

이론/모형

gov)에 등록하였다(KF194292~KF194355). EzBioCloud에서 상동성이 높았던 표준균주들과 결정된 염기서열의 alignment에는 CLASTAL X(Thompson et al., 1997)를 사용하였고 MEGA program version 4.0 (Tamura et al., 2007)의 neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987) 방법에 의해 계통수를 작성하였다. 1,000회 반복 bootstrap 분석(Felsenstein, 1985)을 통해 계통수의 안정성을 평가하였다.
28℃에서 14일간 배양하면서 SCA 배지 상에 형성된 방선균 콜로니를 선택하여 oatmeal agar (ISP3) 배지에 계대하여 14일간 배양하여 순수 분리하였다. 순수 분리된 방선균들은 Antony-Babu 등(2010)의 방법에 따라 color grouping을 수행하여 대표균주들을 형태적으로 선발하였다. 즉, 개별 균주들을 aerial spore mass color, reverse color, diffusible pigment color에 기반하여 형태적으로 분류하였다.
)에 검정균주 1 ml을 각각 접종하여 분주한 후에 시험 균주와 대치 배양하여 균체 주위의 생육저지대의 크기에 따라 항균활성 수준을 결정했다. 아울러 이들 균주의 이차 대사물질 생합성 유전자를 검출하기 위해서 Kim 등(2011)의 방법에 따라 NRPS (Non-ribosomal peptide synthetase)와 PKS-I (Type I polyketide synthase) 유전자에 특이적인 primer를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.

성능/효과

C-primer set을 사용하여 얻은 21개의 clone 염기서열은 표준 균주 염기서열과 89.0%에서 99.6%의 상동성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 각 염기서열과 가장 높은 상동성을 나타내는 10개 방선균 속에 해당하는 14개의 표준균주가 검색되었다(Fig. 2). Streptomyces 속에 속하는 clone이 7개로 가장 많았고, Xylanimicrobium 속과 Leifsonia 속에 속하는 clone이 각각 3개이었다.
S-primer set을 통해 얻어진 16개의 clone들은 10개의 속, 12개의 종들과 높은 상동성을 보였고, C-primer set을 통해 얻어진 21개의 clone들은 10개의 속, 14개의 종들과 높은 상동성을 보였다. 두 쌍의 primer set으로 얻어진 clone들이 공통적으로 5개의 방선균 속(Actinomadura, Leifsonia, Microbispora, Mycobacterium, Streptomyces)에 속하는 것으로 나타났으며 특히, 2개의 표준균주(Leifsonia kribbensis MSL-13^T, Microbispora hainanensis 211020^T)가 공통적으로 높은 상동성을 보였다.
S-primer set을 통해 얻은 16개의 염기서열은 표준균주 염기서열과 93.3%에서 99.9%의 상동성을 보였으며, 각 염기서열과 가장 높은 상동성을 나타내는 12개의 표준균주가 검색되었고 각 균주는 방선균 10개 속으로 분류되었다(Fig. 1). 즉 Streptomyces속과 Leifsonia 속에 속하는 염기서열이 3개로 가장 많았고, 그 외에 Actinomadura, Celluomonas, Ilumatobacter, Microbispora, Mycobacterium, Saccharopolyspora, Thermobispora, Thermopolyspora의 속에 해당하는 염기서열이 1–2개씩 있었다.
분리 균주 중 89%에 해당하는 24균주가 Streptomyces속으로 대부분을 차지하였고, Amycolatopsis, Microbacterium, Nocardia 속이 각각 1균주이었다. Streptomyces 속 균주들은 총 11개의 종과 유연관계가 높았으며, 특히 S. deserti C63^T, S. costaricanus NBRC 100773^T와 높은 상동성을 보이는 균주들이 각각 6개, 5개로 가장 많았다.
2). Streptomyces 속에 속하는 clone이 7개로 가장 많았고, Xylanimicrobium 속과 Leifsonia 속에 속하는 clone이 각각 3개이었다. 그 외에 Nocardioides 속 2개, Actinomadura, Caloribacterium, Mycobacterium, Microbispora, Phytohabitans, Xylanimonas 속에 각각 1개씩의 clone이 포함되었다.
앞서 community DNA 유래의 clone library와 비교할 때, 배양적 접근 방법은 한계가 있었다. 가령, 모든 다양성 분석 결과에서 Streptomyces 속이 다른 속에 비해 우점하였으나, 비배양적 접근보다 배양적 접근에서 Streptomyces 속에 해당하는 균주들의 우점도가 확연히 컸다. 이러한 결과가 나타난 것은 방선균을 분리하기 위해 사용한 starch- casein agar (SCA)가 다른 방선균 분류군에 비해 Streptomyces의 생육조건에 더 적합하여 생육속도가 빠르기 때문에 나타난 결과로 추정된다(Mackay, 1977).
두 쌍의 primer set으로 얻어진 clone들이 공통적으로 5개의 방선균 속(Actinomadura, Leifsonia, Microbispora, Mycobacterium, Streptomyces)에 속하는 것으로 나타났으며 특히, 2개의 표준균주(Leifsonia kribbensis MSL-13^T, Microbispora hainanensis 211020^T)가 공통적으로 높은 상동성을 보였다. 결과적으로, 비배양적으로 시료내의 미생물 다양성을 평가하는 것에 있어서 두 primer set의 탐지능력은 유사한 것으로 판단된다. 다만, C-primer set을 통해 얻어진 clone의 염기서열들이 270 bp 정도로 작아 상대적인 유전 정보량이 적었고, 기존 비교 균주와의 상동성에 있어서도 다소 낮게 나타난 한계점을 보였다.
본 연구를 통해, 장수풍뎅이 유충의 분변 시료로부터 다양한 방선균이 분리될 수 있으며, 분리된 균주들은 다양한 항균효과 및 효소활성을 지니고 있다는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 연구는 장수풍뎅이와 같은 곤충의 장과 분변은 다양한 방선균의 서식처이며, 이곳에서 유용한 생리활성 물질을 발견할 수 있다는 것을 제시한다.
결론적으로 장수풍뎅이 유충 분변에는 다양한 방선균이 서식하고 있으며, 이들 방선균은 높은 항균 활성능과 대사능을 보유하고 있어 향후 유용한 생물소재로 활용될 수 있음이 본 연구를 통해서 확인되었다.
결정된 염기서열과 유사 표준균주간의 상동성은 98.7–100.0%의 범위에 있었으며, HW23균주만 예외적으로 근연종인 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T와 95.8%의 낮은 상동성을 보여 새로운 종일 것으로 판단되었다.
일차적으로 분리된 방선균을 대상으로 color grouping을 통해 형태적으로 유사한 그룹을 분류하였다. 그 결과 53개의 균주는 10개의 multi-membered group과 6개의 single-membered group 등 모두 16개의 그룹으로 분류되었다(자료 미제시). 그 중에서 aerial spore mass color가 light brown이며 reverse color가 yellow, soluble pigment를 형성하지 않는 group이 14개 균주로 가장 많았다.
그 외에 Nocardioides 속 2개, Actinomadura, Caloribacterium, Mycobacterium, Microbispora, Phytohabitans, Xylanimonas 속에 각각 1개씩의 clone이 포함되었다. 대부분의 clone들이 계통학적으로 가장 가까운 표준 균주와 97.0% 이상의 상동성을 나타냈으나 Caloribacterium 속에 속한 clone C18은 91.3%, Nocardioides속에 속한 clone C11은 93.8%, Phytohabitans 속에 속한 clone C10은 89.0%로 상동성이 낮았다(Fig. 2). 검색된 비교 균주 중에는 자일란을 분해하는 활성을 보유하고 있는 균주들이 다수 있었다.
대부분의 검정균주에 대하여 항균활성을 보인 균주는 HW02, HW03, HW17, HW32, HW37, HW56인데, 이들 그룹은 Streptomyces costaricanus NBRC 100773^T와 Streptomyces graminearus NBRC 15420^T와 가장 높은 상동성을 나타낸 균주들로 계통도상에서도 유사한 그룹으로 분류되었다. 이것은 높은 항균활성을 나타낸 균주들이 계통학적으로도 분명한 유연관계가 있음을 시사한다.
즉 Streptomyces속과 Leifsonia 속에 속하는 염기서열이 3개로 가장 많았고, 그 외에 Actinomadura, Celluomonas, Ilumatobacter, Microbispora, Mycobacterium, Saccharopolyspora, Thermobispora, Thermopolyspora의 속에 해당하는 염기서열이 1–2개씩 있었다. 대부분의 염기서열이 표준균주와 97.0% 이상의 상동성을 보였으나 Ilumatobacter속에 속한 clone S05는 93.3%, Mycobacterium 속에 속한 clone S10은 95.5%로 상동성이 비교적 낮았다. 16개의 염기서열 중 clone S02는 Cellulomonas chitinilytica의 표준균주와 99.
S-primer set을 통해 얻어진 16개의 clone들은 10개의 속, 12개의 종들과 높은 상동성을 보였고, C-primer set을 통해 얻어진 21개의 clone들은 10개의 속, 14개의 종들과 높은 상동성을 보였다. 두 쌍의 primer set으로 얻어진 clone들이 공통적으로 5개의 방선균 속(Actinomadura, Leifsonia, Microbispora, Mycobacterium, Streptomyces)에 속하는 것으로 나타났으며 특히, 2개의 표준균주(Leifsonia kribbensis MSL-13^T, Microbispora hainanensis 211020^T)가 공통적으로 높은 상동성을 보였다. 결과적으로, 비배양적으로 시료내의 미생물 다양성을 평가하는 것에 있어서 두 primer set의 탐지능력은 유사한 것으로 판단된다.
, 2000). 따라서 본 연구를 통해 분리한 선발 균주들도 유사한 항선충 및 항균 활성을 나타낼 것으로 예상된다.
또한 많은 균주들이 셀룰로오스와 카제인을 분해하는 생화학적 특징을 보였다. 본 연구를 통해, 장수풍뎅이 유충의 분변 시료로부터 다양한 방선균이 분리될 수 있으며, 분리된 균주들은 다양한 항균효과 및 효소활성을 지니고 있다는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 연구는 장수풍뎅이와 같은 곤충의 장과 분변은 다양한 방선균의 서식처이며, 이곳에서 유용한 생리활성 물질을 발견할 수 있다는 것을 제시한다.
8%의 낮은 상동성을 보여 새로운 종일 것으로 판단되었다. 분리 균주 중 89%에 해당하는 24균주가 Streptomyces속으로 대부분을 차지하였고, Amycolatopsis, Microbacterium, Nocardia 속이 각각 1균주이었다. Streptomyces 속 균주들은 총 11개의 종과 유연관계가 높았으며, 특히 S.
형태학적 특징을 비교하여 최종적으로 27개의 균주를 선발하여 다양성, 항균활성 및 생화학적 특징을 검정하였다. 분리된 균주들은 4속 14종으로 분류되었으며, 24균주(89%)는 Streptomyces 속으로 분류되었다. 대다수의 균주들이 식물병원성 곰팡이와 그람양성 세균에 대해 길항 효과를 보였다.
전체적으로 진균과 그람양성 세균에 대한 항균활성이 높았고, 그람음성 세균의 경우에는 낮았다. 사상균인 Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804와 Fusarium oxysporum KACC 40037는 각각 11개의 균주에 의해 저해되었고, 효모인 Candida albicans Tu164는 8개, Saccharomyces cerevisiae 6A는 7개 균주에 의해 저해되었다. 그람양성 세균인 Bacillus subtilis DSM 10, Staphylococcus aureus DSM 20231에 대해서는, 각각 8개와 13개 균주에서 항균활성을 관찰할 수 있었다.
8%)을 보인 신종 후보 균주이다. 셀룰로오스 가수분해능 실험에서 양성반응을 나타낸 것은 27균주 중 21균주(78%)로, 전반적으로 매우 강한 양성반응을 나타냈다. 이를 통해 분리된 균주들 대부분이 cellulase를 생산하는 것으로 나타났다.
Kim 등(2013)은 쇠똥구리(Copris tripartitus)의 유충에서 분리한 방선균(Streptomyces)에서 HeLa 암세포의 histone demethylase를 억제하는 tripartin이란 신규물질을 분리하여 보고하였다. 이러한 연구 결과들은 곤충에서 유래한 방선균들이 매우 유용한 대사물질들을 생산한다는 사실을 증명하고 있다.
이차 대사산물 생산에 관여하는 유전자인 NRPS (Non-ribosomal peptide synthetase)와 PKS-I (Type-I Polyketide synthase) 유전자를 검출하기 위하여 PCR 실험을 수행한 결과, 모든 분리 균주에서 NRPS 유전자에 대한 검출 반응이 확인되었다. PKS-I 유전자의 경우, 27균주 중 15균주(56%)가 검출반응을 나타내었다.
장수풍뎅이 유충의 분변 시료로부터 추출한 community DNA를 주형으로 방선균의 16S rRNA 유전자만 특이적으로 검출하는 primer를 사용하여 PCR한 결과, SC-Act-235aS20/SCAct-878aA19 primer (S-primer) set으로부터 clone 16개, Com2xf/Ac1186r primer (C-primer) set으로부터 clone 21개를 얻었다. 각 clone의 16S rRNA 유전자 염기서열은 EzBioCloud 데이터베이스를 이용하여 primer set별로 2개의 계통수를 작성하고 장수풍뎅이 유충 분변 속 방선균의 다양성을 분석하였다(Figs.
최종 선발된 27균주를 대상으로 항균활성능과 생화학적 특성에 대한 실험 결과를 Table 1에 나타내었다. 전체적으로 진균과 그람양성 세균에 대한 항균활성이 높았고, 그람음성 세균의 경우에는 낮았다. 사상균인 Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804와 Fusarium oxysporum KACC 40037는 각각 11개의 균주에 의해 저해되었고, 효모인 Candida albicans Tu164는 8개, Saccharomyces cerevisiae 6A는 7개 균주에 의해 저해되었다.
즉 Streptomyces속과 Leifsonia 속에 속하는 염기서열이 3개로 가장 많았고, 그 외에 Actinomadura, Celluomonas, Ilumatobacter, Microbispora, Mycobacterium, Saccharopolyspora, Thermobispora, Thermopolyspora의 속에 해당하는 염기서열이 1–2개씩 있었다.
Schäfer 등(2010)은 본 연구에서 사용한 두 primer set의 탐지능력을 비교한 바 있다. 즉, 전체 방선균 219속 중 S-primer set은 191속, C-primer set은 198속을 탐지하였으며, 공통적으로 나타난 방선균 속은 180속이었다. 두 primer set을 같이 사용할 경우 탐지되는 방선균 속은 209속이며, 이는 전체 중 95%에 해당하는 수치이다.
먼저 시료로부터 직접 추출한 community DNA에서 방선균-특이 primer를 이용하여 방선균의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭, 클로닝한 후에 각 clone에 삽입된 염기서열을 분석하였다. 총 37개의 염기서열을 얻었으며 계통분류학적 분석을 수행한 결과, 15속 24종으로 분류되었다. 아울러 53개의 방선균 균주를 장수풍뎅이 유충 분변으로부터 분리하였다.
PKS-I 유전자의 경우, 27균주 중 15균주(56%)가 검출반응을 나타내었다. 항균활성이 우수한 것으로 판별된 균주들은 대부분 PKS-I 유전자 검출 실험에서 양성반응을 나타냈으나 HW03 균주와 HW37 균주에서는 유전자가 검출되지 않았다. 따라서 대부분의 균주가 이차 대사산물 생산에 관여하는 생합성 유전자를 보유하고 있다는 것을 입증한다.

후속연구

결과적으로, 비배양적으로 시료내의 미생물 다양성을 평가하는 것에 있어서 두 primer set의 탐지능력은 유사한 것으로 판단된다. 다만, C-primer set을 통해 얻어진 clone의 염기서열들이 270 bp 정도로 작아 상대적인 유전 정보량이 적었고, 기존 비교 균주와의 상동성에 있어서도 다소 낮게 나타난 한계점을 보였다. Schäfer 등(2010)은 본 연구에서 사용한 두 primer set의 탐지능력을 비교한 바 있다.
장수풍뎅이 유충은 야생에서는 부엽토를 먹이로 하고, 사육환경에서는 참나무 톱밥류 등을 발효시켜 만든 발효 톱밥을 먹이로 한다(Kim and Kang, 2005). 비배양적 접근을 통해 확인된 방선균의 풍부한 다양성을 고려하면, 목질 및 섬유질이 풍부한 먹이를 소화하는데 이들 방선균들이 특별한 기능을 수행할 것이라고 예측된다. 또한 먹이로 사용되는 톱밥이 고온에서 발효가 진행되기 때문에, 생육온도가 비교적 높은 방선균들이 다수 존재하였던 것으로도 추정된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	장수풍뎅이는 어떤 나라에 분포하는가?	장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma L.)는 딱정벌레목(Coleoptera) 풍뎅이과(Scarabaeidae) 장수풍뎅이아과(Dynastinae)에 속하는 곤충으로 한국, 일본, 중국, 대만 등지에 분포한다(Kim, 1998). 알에서 번데기까지 8–9개월을 지내고, 성충은 3–4개월 생존한다.
	장수풍뎅이 성충이 생존하는 기간은?	)는 딱정벌레목(Coleoptera) 풍뎅이과(Scarabaeidae) 장수풍뎅이아과(Dynastinae)에 속하는 곤충으로 한국, 일본, 중국, 대만 등지에 분포한다(Kim, 1998). 알에서 번데기까지 8–9개월을 지내고, 성충은 3–4개월 생존한다. 부식토나 부후목에 서식하며 교육 및 애완용으로도 널리 사육하고 있으며 다른 곤충들에 비해서 생태 및 생활사가 비교적 잘 알려져 있는 곤충이다(Kim and Kang, 2005).
	장수풍뎅이의 어떤 분류군에 속하는가?	장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma L.)는 딱정벌레목(Coleoptera) 풍뎅이과(Scarabaeidae) 장수풍뎅이아과(Dynastinae)에 속하는 곤충으로 한국, 일본, 중국, 대만 등지에 분포한다(Kim, 1998). 알에서 번데기까지 8–9개월을 지내고, 성충은 3–4개월 생존한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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