[논문]원지(遠志)의 항염증 작용에 대한 연구

오현석; 김병우

원지(遠志)의 항염증 작용에 대한 연구
Anti-inflammatory activity of the water extract of Polygala tenuifolia Willd 원문보기

대한한방내과학회지 = The journal of internal Korean medicine, v.34 no.2, 2013년, pp.204 - 214

오현석 (상지대학교부속한방병원 내과) , 김병우 (상지대학교부속한방병원 내과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was designed to investigate the cellular and molecular mechanisms of anti-inflammatory activity of the water extract of Polygala tenuifolia Willd. (Pt-WE). Methods : Using lipopolysaccharide (LPS)-stimulated murine RAW264.7 cells, we examined inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2 and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$). Also, the inhibitory effect of Pt-WE on the activity of activator protein 1 (AP-1) and upstream signaling molecules was evaluated. To assess the protective effect of Pt-WE on hydrochloride/ethanol (HCl/EtOH)-induced gastric ulcer in mice, we compared Pt-WE (200 mg/kg) with ranitidine (50 mg/kg) treated mice's gastric mucosa, based on gross observations. Results : Pt-WE inhibited LPS-induced production of NO, $PGE_2$ in a dose-dependent manner, without causing cytotoxicity. Pt-WE suppressed AP-1 activation by reducing generations of both c-Jun and c-Fos. In addition, Pt-WE inhibited the p-MKK 4/7 (mitogen-activated protein kinase kinase 4/7) and p-JNK (c-Jun N-terminal kinase) 1 in LPS-stimulated RAW264.7 cells. HCl/EtOH-induced gastric ulcer lesions were inhibited by pre-treatment of Pt-WE based on gross observations. In addition, Pt-WE decreased the phosphorylation level of JNK. Conclusions : These results demonstrate that Pt-WE has anti-inflammatory and gastroprotective effects. Thus, Pt-WE may be used widely in treatment of not only neurodegenerative diseases but also inflammatory diseases.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

최신 연구로는 원지의 寧心安神 작용과 신경 퇴행성 질환의 치료와 관련된 연구^6-8를 위주로 진행되고 있으며, 원지가 TNF-α와 IL-1 등의 염증 매개 물질인 cytokine을 억제하고 염증반응의 전사인자인 NF-κB pathway에 작용하는 기전⁸이 밝혀졌다. 이에 원지의 항염증 효과와 작용기전을 보다 자세히 밝혀보고자 본 연구를 수행하였다.
이와 같이 원지의 항염증 작용에 대한 분자세포학적 신호전달 기전이 NF-κB pathway를 중심으로 일부 규명되었으나, AP-1 pathway 등 기타 다른 signaling에의 작용에 대해서는 연구가 미흡하여 LPS로 유도한 RAW264.7 세포의 NO 생성 조건에서의 원지의 억제 효과와 분자세포학적 기전을 확인해 보았다.

제안 방법

PCR의 결과물은 1% agarose gel에서 전기영동하고, ethidium bromide(EtBr) staining하여 관찰하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GADPH)를 internal control로 사용하여 iNOS, COX-2의 발현을 상대적으로 평가하여 측정하였다.
모든 실험동물은 위궤양 유발 전에 투약 기간 동안 절식시켰다. HCl/EtOH 용액을 투여하고 1시간 후, 실험동물을 urethane으로 마취 후 희생시키고, 위를 적출하였다. 대만부를 절개하여 펼쳐 위점막 궤양을 확인하였다.
Inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygenase(COX)-2의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 각 시료를 일정 시간 동안 처리하여 배양한 세포로부터 TRIzol® Reagent(Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다.
NO는 signaling molecule이자 free radical gas로서 다양한 생리적, 병리생리적 반응의 key mediator21가 되므로, NO signal pathway는 내재성 면역반응에서 매우 중요한 의미를 갖는다. NO는 iNOS의 활성에 의해 매개되므로, iNOS mRNA의 발현 여부를 조사하여 NO의 생성 억제 효과가 mRNA 전사과정 억제와 연관되어 있는지 확인하였다. LPS에 의해 유도된 iNOS mRNA를 RT-PCR로 정량해본 결과, Pt-WE에 의해 iNOS의 mRNA expression 이 억제되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
이때 사용한 DNA primer 의 염기서열은 Table 1에 정리되어 있으며, 기존문헌을 참고하여 제조하였다^11,12. PCR amplication을 위하여 i-Master mix PCR kit(iNtRON, 한국)을 사용하였으며, 94 ℃에서 45초 간 DNA의 변성(denaturing), 60 ℃에서 30초 간 primer 결합(annealing), 그리고 72 ℃에서 1분간 extension하는 조건으로 총 30 cycle을 시행하였다. PCR의 결과물은 1% agarose gel에서 전기영동하고, ethidium bromide(EtBr) staining하여 관찰하였다.
PCR amplication을 위하여 i-Master mix PCR kit(iNtRON, 한국)을 사용하였으며, 94 ℃에서 45초 간 DNA의 변성(denaturing), 60 ℃에서 30초 간 primer 결합(annealing), 그리고 72 ℃에서 1분간 extension하는 조건으로 총 30 cycle을 시행하였다. PCR의 결과물은 1% agarose gel에서 전기영동하고, ethidium bromide(EtBr) staining하여 관찰하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GADPH)를 internal control로 사용하여 iNOS, COX-2의 발현을 상대적으로 평가하여 측정하였다.
Pt-WE의 항염증 효과가 in vivo에서도 적용되는지 평가하고자, HCl-EtOH로 유발한 ICR mouse 위궤양 모델을 이용하였다. Pt-WE(200 mg/kg)를 3일간 경구 투여한 후, HCl-EtOH 용액을 이용하여 위궤양을 유발한 마우스의 위점막 조직을 관찰 하여 항궤양 효과를 육안적으로 확인하였다. 그 결과, 대표적인 항궤양 치료제인 ranitidine(50 mg/kg) 과 비교했을 때 유사한 항궤양 효과를 나타냈다 (Fig.
수컷 ICR 마우스(6-8 weeks old, 19±2 g)를 정상 대조군, 궤양 대조군, ranitidine 및 Pt-WE 투여군으로 각 군당 5마리씩으로 나눠 실험을 실시하였다. Pt-WE(200 mg/kg)와 ranitidine(50 mg/kg)을 매일 2회씩 위궤양 유발 전 3일 동안 oral injection 하였다. 한편 정상 및 궤양 대조군에서는 멸균 증류수만 같은 용량으로 동일한 기간 동안 투여하였다.
Pt-WE(300 μg/ml)를 전처리한 RAW264.7 세포(1×107 cells/ml)에 LPS(1 μg/ml)로 처리하거나 무처리하여 3분이 경과한 후 세포를 회수하여 cell lysate를 제작하였다.
Pt-WE의 NO와 PGE₂의 분비 억제 효과를 확인하기 위하여, LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포를 Griess assay와 ELISA kit를 이용하여 각각 NO와 PGE₂를 측정하였다. 그 결과, Pt-WE에 대하여 농도 의존적으로 NO와 PGE₂의 생성이 억제되었으며, 400 μg/ml로 처리된 시료에서는 각각 최대 0%와 10%로 NO와 PGE₂의 생성이 억제된 것으로 확인되었다(Fig.
TAK1은 MKK 4의 upstream kinase 중의 하나로³¹, Pt-WE가 p-MKK 4/7의 활성을 억제한 결과를 바탕으로 하여, 보다 상위 단계인 TAK1에까지 그 작용이 미치는지 immunoprecipitation(IP) 실험을 통하여 확인하였다. IP는 단백질 간 상호작용을 분석하는 중요한 실험기법^13,14으로, TAK1을 antigen 으로 immunoprecipitation하여 얻은 immune complex 를 western blotting으로 분석하였다.
TAK1을 antigen으로 immunoprecipitation하여 얻은 lysate를 MKK 4/7과 p-MKK 4/7에 특이한 항체를 이용하여 western blotting으로 분석하였다. 그 결과, Pt-WE 투여군에서 LPS 처리 후 3분경과시 TAK1의 downstream signal인 p-MKK 4/7의 발현이 억제되는 결과를 확인하였다(Fig.
동일한 양의 단백질로 sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 실행하고, wet transfer system을 통한 electroblotting으로 gel에 위치한 단백질을 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane으로 옮긴 후, 5% non-fat dried milk(Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 사용해 membrane blocking하였다. 각 단백질에 특이한 1차 항체로 처리하고, washing하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거한 후, 2차 항체 용액을 1시간 추가 처리하였다. 그리고 암실에서 membrane에 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 골고루 분주하여 X-ray film으로 감광하여 반응 정도를 확인하였다.
각 표본의 단백질 정량은 bovine serum albumin(BSA) standard를 이용하여 측정했다. Internal control로는 lamin A/C와 β-actin을 사용하였다.
그 다음 배양액을 원심분리하여 상층액 100 μl를 분리하고, PGE2의 생성을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다.
1). 그러나 Pt-WE 자체의 비특이적인 세포 독성 작용으로 인하여 NO 생성 억제 효과가 나타났을 가능성이 있으므로 Pt-WE 의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. Pt-WE를 24시간 동안 최대 400 μg/ml 까지 농도별로 처리한 결과 RAW264.
각 단백질에 특이한 1차 항체로 처리하고, washing하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거한 후, 2차 항체 용액을 1시간 추가 처리하였다. 그리고 암실에서 membrane에 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 골고루 분주하여 X-ray film으로 감광하여 반응 정도를 확인하였다.
HCl/EtOH 용액을 투여하고 1시간 후, 실험동물을 urethane으로 마취 후 희생시키고, 위를 적출하였다. 대만부를 절개하여 펼쳐 위점막 궤양을 확인하였다. 염증반응의 신호전달 단백질 발현량 측정을 위해 Krishnendu와 Snehasikta¹⁷의 방법에 따라 샘플을 채취하여 western blotting 하였다.
의 생성을 억제하고, AP-1 signaling pathway에도 관여함을 알 수 있었다. 또한, Pt-WE의 항염증 효과에 대한 in vivo 실험을 통해 JNK signaling의 억제에 의한 항궤양 효과 역시 확인하였다. 따라서, 원지는 기존의 연구와 마찬가지로 신경퇴행성 뇌질환의 치료제뿐만 아니라 염증성 질환의 치료제로서 활용 가능할 것으로 보인다.
01M HCl)을 추가적으로 첨가하여 MTT-formazan을 용해시켰다. 세포 생존율은 MTT가 formazan으로 환원된 양을 microplate reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 Optical Density(OD) 값을 통해 산출하였다.
수컷 ICR 마우스(6-8 weeks old, 19±2 g)를 정상 대조군, 궤양 대조군, ranitidine 및 Pt-WE 투여군으로 각 군당 5마리씩으로 나눠 실험을 실시하였다.
7 세포(7×10⁶ cells/ml)에 LPS(1 μg/ml)로 처리하거나 무처리하여 지정된 시간이 경과한 후 세포를 회수하였다. 시간 설정은 upstream 경로에 따라 단계적으로 단축 적용하였으며, c-Jun과 c-Fos는 15/30/60분, MAPK는 5/15/30/60분 후에 발현량을 확인하였다. IRAK4, IRAK1, TAK1, MKK 4/7은 2/3/5분 후에 확인하였다.
원지의 항염증 작용을 확인하기 위하여 LPS로 유도된 RAW264.7 세포를 이용하여 분자세포학적 수준에서 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H₃PO₄)을 혼합하였다. 이 혼합액을 상온에 10분 동안 방치한 결과 발색된 정도를 540 nm에서 microplate reader를 이용하여 측정하였다. 표준물질로 sodium nitrite를 사용하여 흡광도를 측정한 후 표준 정량곡선을 완성하였다.
추출한 total RNA(1.0 μg)로 First strand cDNA synthesis kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 이것을 polymerase chain reaction(PCR)로 증폭시켰다.
그 후, lysis buffer 로 3회 세척하여 침강되지 않은 immune complex 는 제거하였다. 침강된 beads-immune complex는 SDS-PAGE를 통하여 protein A와 분리한 후, MKK 4/7과 p-MKK 4/7에 특이한 항체를 이용하여 western blotting으로 분석하였다^13-15.
이 혼합액을 상온에 10분 동안 방치한 결과 발색된 정도를 540 nm에서 microplate reader를 이용하여 측정하였다. 표준물질로 sodium nitrite를 사용하여 흡광도를 측정한 후 표준 정량곡선을 완성하였다.
Pt-WE(200 mg/kg)와 ranitidine(50 mg/kg)을 매일 2회씩 위궤양 유발 전 3일 동안 oral injection 하였다. 한편 정상 및 궤양 대조군에서는 멸균 증류수만 같은 용량으로 동일한 기간 동안 투여하였다. 최종 약물투여로부터 30분 후, Oyagi 등¹⁶의 방법에 따라 60% ethanol에 150 mM HCl이 혼합된 HCl/EtOH 용액 400 μl를 경구 투여하여 위궤양을 유발하였다.

대상 데이터

6-8주차의 체중 19±2 g 정도의 수컷 ICR mouse(대한바이오링크, 충북, 한국) 20마리를 사용하였으며, 물과 pellet diet는 자율 급식하였다.
세포배양용 배지에 사용한 Fetal Bovine Serum(FBS)와 항생제(penicillin, streptomycin)는 HyClone(South Logan, UT, USA) 제품을 사용하였다. MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliu m bromide)를 포함한 화학 시약은 Sigma 제품(St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. PGE₂ EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA) kit는 Amersham Life Science Inc.
RAW264.7 세포의 세포배양을 위한 배지는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 media를 이용하였고, penicillin(100 IU/ml), streptomycin(100 μg/ml)과 10% FBS를 첨가하여 사용하였다.
998%)을 얻었다. 동결 건조된 원지 물추출물(이하 Pt-WE) 을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 농도별로 조정한 후 세포실험에 사용하였고, 동물실험용 시료는 CMC(carboxymethyl cellulose)에 녹여 사용하였다.
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포를 사용하여 5% CO₂, 37℃ incubator에서 배양하였다. RAW264.
(Arlington Heights, IL, USA) 제품이다. 본 실험에서 사용한 모든 항체는 Cell Signaling Technologies(Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다.
세포배양용 배지에 사용한 Fetal Bovine Serum(FBS)와 항생제(penicillin, streptomycin)는 HyClone(South Logan, UT, USA) 제품을 사용하였다. MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliu m bromide)를 포함한 화학 시약은 Sigma 제품(St.

데이터처리

모든 통계 실험은 SPSS 10.0 버전을 이용하여 시행하였으며, 그룹 간 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 ANOVA/Scheffe’s post hoc test와 KruskalWallis/Mann-Whitney test를 이용하여 분석하였다.

이론/모형

, Pt-WE가 p-MKK 4/7의 활성을 억제한 결과를 바탕으로 하여, 보다 상위 단계인 TAK1에까지 그 작용이 미치는지 immunoprecipitation(IP) 실험을 통하여 확인하였다. IP는 단백질 간 상호작용을 분석하는 중요한 실험기법^13,14으로, TAK1을 antigen 으로 immunoprecipitation하여 얻은 immune complex 를 western blotting으로 분석하였다. 그 결과, TAK1의 downstream signal인 p-MKK 4/7이 Pt-WE를 처리했을 때 발현이 억제되는 결과를 확인하였다 (Fig.
Pt-WE의 항염증 효과가 in vivo에서도 적용되는지 평가하고자, HCl-EtOH로 유발한 ICR mouse 위궤양 모델을 이용하였다. Pt-WE(200 mg/kg)를 3일간 경구 투여한 후, HCl-EtOH 용액을 이용하여 위궤양을 유발한 마우스의 위점막 조직을 관찰 하여 항궤양 효과를 육안적으로 확인하였다.
대만부를 절개하여 펼쳐 위점막 궤양을 확인하였다. 염증반응의 신호전달 단백질 발현량 측정을 위해 Krishnendu와 Snehasikta¹⁷의 방법에 따라 샘플을 채취하여 western blotting 하였다.
또한, 대표적인 PRRs인 TLR4와 adaptor 인 MyD-88 역시 억제하는 것으로 나타났다^3,8. 이러한 결과를 토대로 NO signal의 또 다른 축이 되는 AP-1 pathway에 대한 작용을 확인해 보고자, AP-1활성 조절 상부신호전달 단백질(c-Jun, c-Fos, MAPK, MKK 4/7, TAK1, IRAK1, IRAK4)의 total protein 과 phosphoprotein을 western blotting을 이용하여 측정하였다.
최종 약물투여로부터 30분 후, Oyagi 등16의 방법에 따라 60% ethanol에 150 mM HCl이 혼합된 HCl/EtOH 용액 400 μl를 경구 투여하여 위궤양을 유발하였다.

성능/효과

1. 원지는 LPS로 유도된 NO와 PGE₂의 생성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 세포 생존율을 검정한 결과 NO와 PGE₂ 생성 억제 효과는 원지의 세포독성에 기인한 것이 아니었다.
2. 시간에 따른 세포 내 AP-1 signaling molecule의 활성을 확인한 결과, LPS로 유도된 p-MKK 4/7, p-JNK 1, c-Jun, c-Fos의 활성이 억제되었으며, 이를 통해 AP-1의 활성 억제 효과가 있을 것으로 판단하였다.
3. 원지의 항염증 효과가 in vivo에서도 적용되는지 HCl-EtOH induced gastric ulcer model을 이용 하여 실험한 결과, 육안적으로 위점막 병소의 감소가 확인되었다. 또한, p-JNK의 활성 억제 효과가 나타나 JNK signaling에 관여함으로써 항궤양 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
AP-1 pathway에 대한 Pt-WE의 작용을 확인한 결과, AP-1 pathway의 상위 신호전달 단계 중 c-Fos 와 c-Jun, p-JNK 1, p-MKK4/7에 대하여 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. Pt-WE 투여군에서 c-Jun, c-Fos는 LPS를 처리 60분 후에 억제 효과가 확인되었고(Fig.
Fig. 4의 결과와 같이, Pt-WE 300 μg/ml 처리군을 LPS 로 자극하고 60분 경과 후 c-Jun, c-Fos가 감소한 것으로 나타나, AP-1의 활성 역시 억제될 것으로 해석하였다.
HCl/EtOH로 위궤양을 유발한 ICR mouse의 위점막 병소를 육안으로 관찰한 결과, Pt-WE와 ranitidine 투여군 모두 육안 병소의 면적이 감소되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 8A). 또한 HCl/EtOH로 유발한 위궤양의 염증 반응 signal에 대한 western blot을 시행한 결과, Pt-WE 투여군에서 JNK의 인산화 과정이 억제된 것으로 나타나 동물실험에서도 세포 실험과 같은 결과가 나왔다(Fig.
LPS(1 μg/ml) 처리한 RAW264.7 세포에 각각의 농도별로 Pt-WE를 처리하였을 때, Pt-WE 200 μg/ml 부터 iNOS와 COX-2 mRNA 발현이 감소되는 것이 확인되었다(Fig. 3A).
LPS(1 μg/ml)에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 NO와 PGE2의 분비를 측정한 결과, Pt-WE 투여군에서 농도 의존적으로 NO와 PGE2의 생성이 억제된 것으로 나타났다(Fig. 1).
NO는 iNOS의 활성에 의해 매개되므로, iNOS mRNA의 발현 여부를 조사하여 NO의 생성 억제 효과가 mRNA 전사과정 억제와 연관되어 있는지 확인하였다. LPS에 의해 유도된 iNOS mRNA를 RT-PCR로 정량해본 결과, Pt-WE에 의해 iNOS의 mRNA expression 이 억제되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). LPS (1 μg/ml)만 처리한 군의 iNOS mRNA expression intensity를 1로 보았을 때, Pt-WE(300 μg/ml) 처리군은 0.
MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과, Pt-WE는 24시간 동안 최대 400 μg/ml 농도까지 RAW264.7 세포에 대하여 세포 독성 효과를 나타내지 않았다(Fig. 2).
AP-1 pathway에 대한 Pt-WE의 작용을 확인한 결과, AP-1 pathway의 상위 신호전달 단계 중 c-Fos 와 c-Jun, p-JNK 1, p-MKK4/7에 대하여 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. Pt-WE 투여군에서 c-Jun, c-Fos는 LPS를 처리 60분 후에 억제 효과가 확인되었고(Fig. 4), p-JNK 1과 p-MKK 4/7은 각각 LPS 처리 5분, 3분 경과 후에 억제 효과가 나타났다(Fig. 5, 6) Fig. 4. Effect of Pt-WE on the activation of c-Jun and c-Fos in LPS-treated RAW264.
Pt-WE를 24시간 동안 최대 400 μg/ml 까지 농도별로 처리한 결과 RAW264.7 세포의 cell viability는 정상군의 7~80% 수준으로 나타나(Fig. 2), Pt-WE의 NO 생성 억제 는 세포 독성 작용에 의한 것이 아닌 것으로 판단하였다.
결론적으로, Pt-WE는 염증 매개물질인 NO, PGE₂의 생성을 억제하고, AP-1 signaling pathway에도 관여함을 알 수 있었다. 또한, Pt-WE의 항염증 효과에 대한 in vivo 실험을 통해 JNK signaling의 억제에 의한 항궤양 효과 역시 확인하였다.
TAK1을 antigen으로 immunoprecipitation하여 얻은 lysate를 MKK 4/7과 p-MKK 4/7에 특이한 항체를 이용하여 western blotting으로 분석하였다. 그 결과, Pt-WE 투여군에서 LPS 처리 후 3분경과시 TAK1의 downstream signal인 p-MKK 4/7의 발현이 억제되는 결과를 확인하였다(Fig. 7).
그 결과, Pt-WE에 대하여 농도 의존적으로 NO와 PGE2의 생성이 억제되었으며, 400 μg/ml로 처리된 시료에서는 각각 최대 0%와 10%로 NO와 PGE2의 생성이 억제된 것으로 확인되었다(Fig. 1).
IP는 단백질 간 상호작용을 분석하는 중요한 실험기법^13,14으로, TAK1을 antigen 으로 immunoprecipitation하여 얻은 immune complex 를 western blotting으로 분석하였다. 그 결과, TAK1의 downstream signal인 p-MKK 4/7이 Pt-WE를 처리했을 때 발현이 억제되는 결과를 확인하였다 (Fig. 7). 이로써 Pt-WE가 TAK1-MKK 4/7 pathway 까지 작용하는 것을 알 수 있었다.
Pt-WE(200 mg/kg)를 3일간 경구 투여한 후, HCl-EtOH 용액을 이용하여 위궤양을 유발한 마우스의 위점막 조직을 관찰 하여 항궤양 효과를 육안적으로 확인하였다. 그 결과, 대표적인 항궤양 치료제인 ranitidine(50 mg/kg) 과 비교했을 때 유사한 항궤양 효과를 나타냈다 (Fig. 8A).
8A). 또한 HCl/EtOH로 유발한 위궤양의 염증 반응 signal에 대한 western blot을 시행한 결과, Pt-WE 투여군에서 JNK의 인산화 과정이 억제된 것으로 나타나 동물실험에서도 세포 실험과 같은 결과가 나왔다(Fig. 8B).
원지의 항염증 효과가 in vivo에서도 적용되는지 HCl-EtOH induced gastric ulcer model을 이용 하여 실험한 결과, 육안적으로 위점막 병소의 감소가 확인되었다. 또한, p-JNK의 활성 억제 효과가 나타나 JNK signaling에 관여함으로써 항궤양 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
또한, 대조군의 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 강도를 1로 보았을 때, Pt-WE(300μg/ml) 투여군의 시료에서는 발현 강도가 0.5 수준으로 억제되었다(Fig. 3B).
만성 위궤양 상태에서는 p-ERK 1/2와 p-JNK 가 증가17하는데, HCl-EtOH로 유발한 ICR mouse의 위궤양 상태에서 Pt-WE의 p-JNK를 억제시키는 효과를 확인하였다. 이로써 Pt-WE가 JNK signaling 에 관여함으로써 항궤양 효과를 나타냄을 알 수 있었다³²(Fig.
이러한 억제 효과가 발현되는 시간이 p-MKK 4/7는 3분, p-JNK 1은 5분, c-Jun과 c-Fos는 60분 경과 후로 나타나 시간상의 배열과 signal 순서가 일치함을 알 수 있었다. 본 연구에서는 luciferase assay 를 통하여 AP-1의 활성화 여부를 직접적으로 확인해 보지는 못하였으나, AP-1의 immediate early gene 인 c-Jun, c-Fos의 억제 효과가 확인되었으므로 AP-1 activation에 대해서도 억제 효과가 있을 것으로 판단된다.
7). 이로써 Pt-WE가 TAK1-MKK 4/7 pathway 까지 작용하는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로, 원지가 NO와 PGE₂의 생성을 억제하고 AP-1과 그 상위 신호전달 단백질의 활성을 저해함으로써 항염증 효과를 나타내는 것으로 판단된다. in vivo 실험을 통해 항궤양 효과 역시 확인되었으므로, 기존의 연구가 신경 퇴행성 뇌질환의 치료법으로만 국한되었던 것과는 다르게 염증성 질환 치료제로 보다 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 전망한다.
이상의 결과를 종합하면, TAK1을 시작으로 p-MKK 4/7, p-JNK 1, c-Jun으로 내려가는 pathway의 억제 기전이 확인되었으며, c-Jun과 결합하여 AP-1을 형성하는 c-Fos의 억제 효과도 확인되었다. 이러한 억제 효과가 발현되는 시간이 p-MKK 4/7는 3분, p-JNK 1은 5분, c-Jun과 c-Fos는 60분 경과 후로 나타나 시간상의 배열과 signal 순서가 일치함을 알 수 있었다.

후속연구

의 생성을 억제하고 AP-1과 그 상위 신호전달 단백질의 활성을 저해함으로써 항염증 효과를 나타내는 것으로 판단된다. in vivo 실험을 통해 항궤양 효과 역시 확인되었으므로, 기존의 연구가 신경 퇴행성 뇌질환의 치료법으로만 국한되었던 것과는 다르게 염증성 질환 치료제로 보다 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 전망한다.
또한, Pt-WE의 항염증 효과에 대한 in vivo 실험을 통해 JNK signaling의 억제에 의한 항궤양 효과 역시 확인하였다. 따라서, 원지는 기존의 연구와 마찬가지로 신경퇴행성 뇌질환의 치료제뿐만 아니라 염증성 질환의 치료제로서 활용 가능할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	원지란?	원지(遠志)는 원지과에 속한 다년생 초본인 원지 Polygala tenuifolia Willd.의 뿌리를 건조4한 것으로, 味는 苦辛하고 性은 微溫하여 寧心安神, 祛痰開竅, 消散腫痛의 작용을 하여 神昏, 驚悸, 不眠, 健忘을 치료하고 초기의 癰腫에도 적용할 수 있다5 .최신 연구로는 원지의 寧心安神 작용과 신경 퇴행성 질환의 치료와 관련된 연구6-8를 위주로 진행되고 있으며, 원지가 TNF-α와 IL-1 등의 염증 매개 물질인 cytokine을 억제하고 염증반응의 전사인자인 NF-κB pathway에 작용하는 기전8이 밝혀졌다.
	대식세포란?	대식세포(macrophage)는 탐식 기능을 통한 선천 면역과 항원 제시 기능을 통한 후천 면역을 동시에 담당하는 대표적인 면역세포로, 병원체, 세포 손상, 체내 다른 면역세포에서 분비한 cytokine 등의 자극 물질에 의해 활성화되어 TNF-α, IL-1 등의 cytokine이나 NO, ROS, prostaglandins와 같은 염증매개물질을 분비하여 염증반응을 촉발시킨다1,2. 이러한 일련의 과정은 모두 신호전달 단백질의 활성에 의한 cell signaling에 의한 것으로, 대식세포의 세포막에 존재하는 pattern recognition receptors (PRRs)가 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)에 반응하여 NF-kB, AP-1과 같은 transcription factor가 활성화되고 그 결과 iNOS, COX-2가 발현 되어 염증반응물질인 NO나 PGE2 등이 분비된다3.
	원지의 항염증 작용을 확인하기 위하여 LPS로 유도된 RAW264.7 세포를 이용하여 분자세포학적 수준에서 조사한 결과 얻은 결론은?	1. 원지는 LPS로 유도된 NO와 PGE2의 생성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 세포 생존율을 검정한 결과 NO와 PGE2 생성 억제 효과는 원지의 세포독성에 기인한 것이 아니었다. 2. 시간에 따른 세포 내 AP-1 signaling molecule의 활성을 확인한 결과, LPS로 유도된 p-MKK 4/7, p-JNK 1, c-Jun, c-Fos의 활성이 억제되었으며, 이를 통해 AP-1의 활성 억제 효과가 있을 것으로 판단하였다. 3. 원지의 항염증 효과가 in vivo에서도 적용되는지 HCl-EtOH induced gastric ulcer model을 이용 하여 실험한 결과, 육안적으로 위점막 병소의 감소가 확인되었다. 또한, p-JNK의 활성 억제 효과가 나타나 JNK signaling에 관여함으로써 항궤양 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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