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문제 정의
- 이 과정에서 mannitol은 fructose의 세포 내 흡수 과정에 관여하는 다양한 효소 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려졌다[11]. 그러나, 아직 MDH의 효소 특성 및 생체 내 역할에 대한 충분한 연구가 이루어지지 않았으므로, 본 연구에서 S. meliloti의 유전체로부터 MDH로 추정되는 유전자를 클로닝하여 대장균에서 대량으로 발현하고, 기존에 보고된 다양한 MDH 유전자와 1차 구조, 서열 상동성 및 효소특성 등을 상호 비교하여 미생물학 및 효소학적으로 유용한 정보를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 배양액의 흡광도(600 nm)가 0.4-0.6에 도달한 후, 최종농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, 이후 SmMDH 효소의 발현량이 최대가 될 때까지 16시간 동안 추가로 배양하였다.
- S. meliloti 1021의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 SmMDH 유전자를 선택적으로 증폭하였다. 유전자의 증폭을 위해 SmMDH-N (5'-TGGATCCATGGCGACCΑΑΑTTCTCCC3')과 SmMDH-C (5'-TAAGCTTTTCCCCGAGGTTTCCGTC3') primer set를 사용하였다.
- 유전자의 증폭을 위해 SmMDH-N (5'-TGGATCCATGGCGACCΑΑΑTTCTCCC3')과 SmMDH-C (5'-TAAGCTTTTCCCCGAGGTTTCCGTC3') primer set를 사용하였다. PCR 증폭은 Taq DNA polymerase (Roche Applied Science)와 Px2 thermal cycler (Thermo Hybaid, Middlesex, UK)를 사용하여 94℃에서1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초로 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분간 추가로 증폭한 후 종료하였다. 증폭된 SmMDH 유전자는 pMD18-T (Takara Biomedical, Otsu, Japan)에 클로닝한 후, 서울대학교 유전체지원센터의 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
- PCR 증폭은 Taq DNA polymerase (Roche Applied Science)와 Px2 thermal cycler (Thermo Hybaid, Middlesex, UK)를 사용하여 94℃에서1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초로 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분간 추가로 증폭한 후 종료하였다. 증폭된 SmMDH 유전자는 pMD18-T (Takara Biomedical, Otsu, Japan)에 클로닝한 후, 서울대학교 유전체지원센터의 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
- SmMDH 유전자를 BamHI과 HindIII 제한효소로 처리하고, pET-21a (Novagen, Merk, Germany) 발현벡터에 삽입하여 pETSmMDH를 얻었다. pETSmMDH를 E.
- 정제된 SmMDH의 대략적인 분자량은 SDS-PAGE를 이용하여 측정하였다. Mini-protean II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 전기영동 기구를 이용하여 12% gel 상에서 분리하였으며, Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich)으로 염색한 후, 다시 destaining solution (20% methanol, 10% acetic acid)을 처리하여 효소 단백질을 확인하였다.
- 정제된 SmMDH의 대략적인 분자량은 SDS-PAGE를 이용하여 측정하였다. Mini-protean II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 전기영동 기구를 이용하여 12% gel 상에서 분리하였으며, Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich)으로 염색한 후, 다시 destaining solution (20% methanol, 10% acetic acid)을 처리하여 효소 단백질을 확인하였다. 분자량 비교를 위해 molecular weight markers (Sigma-Aldrich;분자량 30,000-200,000)를 표준물질로 사용하였고, 효소 단백질의 농도는 BCATM protein assay kit (Pierce Biotechnology, Inc.
- Mini-protean II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 전기영동 기구를 이용하여 12% gel 상에서 분리하였으며, Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich)으로 염색한 후, 다시 destaining solution (20% methanol, 10% acetic acid)을 처리하여 효소 단백질을 확인하였다. 분자량 비교를 위해 molecular weight markers (Sigma-Aldrich;분자량 30,000-200,000)를 표준물질로 사용하였고, 효소 단백질의 농도는 BCATM protein assay kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.
- SmMDH의 산화활성을 측정하기 위해 200 mM의 Dmannitol 기질과 0.5 mM NAD(P)+를 조효소로 함유한 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)를 사용하였고, 환원활성 측정에는 200 mM의 D-fructose 기질과 0.5 mM NAD(P)H를 첨가한 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)의 조건에서 적당량의 정제된 효소를 첨가하여 최종 300 µl로 반응하였다.
- 0)의 조건에서 적당량의 정제된 효소를 첨가하여 최종 300 µl로 반응하였다. 40℃에서10분 동안 효소반응을 진행하면서 PowerWaveTM microplate spectrophotometer (Biotek Instrument Inc., Highland, USA)를 이용하여 340 nm에서 반응액의 흡광도 변화를 1분 간격으로 측정하였다. SmMDH의 활성 1 unit는 1분당1 µmol의 NAD+를 NADH로 전환(mannitol 산화반응) 또는 NADH를 NAD+로 전환(fructose 환원반응)하는 효소량으로 정의하였다.
- National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 데이터베이스 검색을 통해 다양한 미생물 유전체 내의 MDH 유전자 분포를 확인하였다. 그 중 Sinorhizobium meliloti 1021 균주로부터 MDH로 추정되는 유전자(SmMDH; GenBank accession No.
- PCR을 통해 선택적으로 증폭한 약 1.5 kb의 SmMDH 유전자 단편을 pET-21a 발현벡터에 삽입하여 pETSmMDH로 명명하였다. 이 유전자는 494개의 아미노산 잔기(약 54 kDa)을 암호화하는 1,485 bp의 염기로 구성 되었으며, 서열분석 결과 데이터베이스 상의 염기서열과 일치함을 확인하였다.
- E. coli BL21 (DE3) 균주에 pETSmMDH를 형질전환하여 재조합 대장균을 얻은 후, 배양하면서 효소유전자의 발현을 유도하였다. 효소유전자의 발현도 및 효소 정제도를 SDSPAGE로 확인한 결과, 유전자 서열로부터 예상한 바와 같이 약 54 kDa의 재조합 SmMDH 단백질이 대장균 내에서 대량 발현되고 쉽게 정제됨을 확인하였다(Fig.
- 기질에 대한 특이성을 확인하기 위하여 다양한 당알콜(Dmannitol, D-sorbitol, D-xylitol), 육탄당(D-glucose, D-fructose, D-galactose), 오탄당(D-arabinose, D-xylose) 기질에 대한 반응산물을 분석하였다. 결과적으로 D-mannitol과 D-fructose 사이의 상호 전환반응이 관찰되었으며, D-sorbitol을 Lsorbose로 전환하는 반응의 경우 D-mannitol과 비교하여 약 85% 수준의 상대활성을 보였으나, 그 외의 기질에는 작용하지 않음을 확인하였다.
- Sinorhizobium meliloti 1021 (KCTC 2353) 유전체로부터 mannitol dehydrogenase (SmMDH)로 추정되는 유전자를 클로닝하고, 대장균에서 대량 발현하였다. 이 유전자는 494개의 아미노산(약 54 kDa)을 암호화하는 1,485 bp의 염기로 구성되며, 기존에 보고된 long-chain dehydrogenase/ reductase 계열 MDH 효소들과 약 35-55%의 아미노산 서열상동성을 나타내었다.
대상 데이터
- 연구에 사용한 일반 시약과 효소반응 기질 및 미생물 배지는 각각 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)와 Duchefa Biochemie (Haarlem, The Netherlands)에서 구입하여 사용하였다. 유전자 조작을 위한 제한효소 및 DNA ligase 등은 Roche Applied Science (Mannheim, Germany)에서 구입하였으며, 각종 PCR 및 sequencing primer는 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 합성하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)와 Duchefa Biochemie (Haarlem, The Netherlands)에서 구입하여 사용하였다. 유전자 조작을 위한 제한효소 및 DNA ligase 등은 Roche Applied Science (Mannheim, Germany)에서 구입하였으며, 각종 PCR 및 sequencing primer는 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 합성하여 사용하였다. 또한 agarose 및 GENECLEAN turbo nucleic acid purification kit는 Qbiogene (Carlsbad, CA, USA)에서, 단백질 정제에 사용한 Ni-NTA 컬럼은 Qiagen (Hilden, Germany)에서 구입하였다.
- 또한 agarose 및 GENECLEAN turbo nucleic acid purification kit는 Qbiogene (Carlsbad, CA, USA)에서, 단백질 정제에 사용한 Ni-NTA 컬럼은 Qiagen (Hilden, Germany)에서 구입하였다. SmMDH 유전자의 PCR 클로닝에 주형으로 사용한 S. meliloti 1021 (KCTC 2353) 균주의 염색체 DNA는 한국생명공학연구원 미생물 프론티어사업단으로부터 제공받았다.
- 유전자의 증폭을 위해 SmMDH-N (5'-TGGATCCATGGCGACCΑΑΑTTCTCCC3')과 SmMDH-C (5'-TAAGCTTTTCCCCGAGGTTTCCGTC3') primer set를 사용하였다.
성능/효과
- gov) 데이터베이스 검색을 통해 다양한 미생물 유전체 내의 MDH 유전자 분포를 확인하였다. 그 중 Sinorhizobium meliloti 1021 균주로부터 MDH로 추정되는 유전자(SmMDH; GenBank accession No. NP386546)를 발견하였으며, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 검색 결과, 이 유전자가 다른 미생물 유래 MDH 유전자들과 상동성을 가짐을 알 수 있었다.
- 5 kb의 SmMDH 유전자 단편을 pET-21a 발현벡터에 삽입하여 pETSmMDH로 명명하였다. 이 유전자는 494개의 아미노산 잔기(약 54 kDa)을 암호화하는 1,485 bp의 염기로 구성 되었으며, 서열분석 결과 데이터베이스 상의 염기서열과 일치함을 확인하였다.
- coli BL21 (DE3) 균주에 pETSmMDH를 형질전환하여 재조합 대장균을 얻은 후, 배양하면서 효소유전자의 발현을 유도하였다. 효소유전자의 발현도 및 효소 정제도를 SDSPAGE로 확인한 결과, 유전자 서열로부터 예상한 바와 같이 약 54 kDa의 재조합 SmMDH 단백질이 대장균 내에서 대량 발현되고 쉽게 정제됨을 확인하였다(Fig. 1).
- SmMDH 유전자로부터 추정한 아미노산 서열을 다른 미생물 유래 MDH들과 비교하여 분석한 결과, dehydrogenase/ reductase (DR) family 계열의 효소들과 진화적으로 유사한 것으로 나타났다(Fig. 2). 또한 SmMDH는 494개의 아미노산으로 구성되며, LDR 계열에 속하는 Rhodobacter sphaeroides 유래 MDH (RsMDH) [18]와 55.
- 2). 또한 SmMDH는 494개의 아미노산으로 구성되며, LDR 계열에 속하는 Rhodobacter sphaeroides 유래 MDH (RsMDH) [18]와 55.2%로 가장 높은 아미노산 서열상동성을 나타내었다. 이 외에도 LDR 계열의 Pseudomonas fluorescens MDH (PfMDH) [20], Saccharomyces cerevisiae MDH (ScMDH) [16], Aspergillus fumigatus MDH (AfMDH)[10] 및 Salmonella typhimurium MDH (StMDH) [6]와 35.
- 또한 SmMDH의 N-말단 domain 부위에서 발견된 Rossmann fold 형태의 조효소 결합부위(Phe39, Asp71, Ile131, Glu133)와 C-말단 domain 부위에 존재하는 α-helix 형태의 기질 결합 부위(Asp230, Arg231, His303, Arg373), 그리고 효소의 활성부위(Asn191, Lys295, Asn300) 서열은 Kavanagh 등[9]의 연구결과와 유사하게 보존되어 있음을 확인하였으며(Fig. 3), 이상의 결과를 종합할 때, SmMDH는 LDR 계열의 MDH 일 것으로 예상하였다.
- 7%의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 반면에 SDR 또는 MDR 계열의 효소들과는 10% 이하의 매우 낮은 서열 상동성을 보였다.
- 또는 NAD(P)H의 상호전환이 발생하며, 이로 인해 흡광도의 변화를 유발하게 된다. 본 연구에서 SmMDH는 D-mannitol 기질과 NAD+를 조효소로 사용한 반응에서 D-fructose로 전환시키는 효소활성을 나타내었고, D-fructose와 NADH를 사용한 반응에서도 Dmannitol로의 전환 활성을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 그러나, NADP+ 또는 NADPH를 조효소로 사용한 경우에는 활성을 보이지 않았으므로, SmMDH는 D-mannitol 산화반응 및 D-fructose 환원반응에 대하여 각각 9.
- 4). 그러나, NADP+ 또는 NADPH를 조효소로 사용한 경우에는 활성을 보이지 않았으므로, SmMDH는 D-mannitol 산화반응 및 D-fructose 환원반응에 대하여 각각 9.68 및 13.19 unit/ mg의 비활성값(specific activity)을 가지는 NAD+/NADH-의존적인 MDH의 일종임을 확인하였다(Fig. 5). SmMDH의 효소활성은 기존에 보고된 S.
- 5). SmMDH의 효소활성은 기존에 보고된 S. typhimurium 유래 MDH [6]의 비활성값 (각각 0.80 및 1.61 unit/mg)에 비해 높았으나, P. fluorescens MDH [20] (31 및 55 unit/mg)의 활성에 비하면 낮은 수준이었다.
- SmMDH의 최적 반응온도는 기존에 보고된 다른 미생물 유래 LDR 계열의 MDH 효소들에 비해 다소 높은 편이었으며, 이 효소들은 Table 1에 나타낸 바와 같이 산화·환원반응에서 동일한 최적 온도를 보였다.
- 최적 반응온도를 결정하기 위하여 20-50℃의 다양한 온도 조건에서 MDH 활성을 측정한 결과, 40℃에서 가장 높은 활성을 보였고, 30℃에서 48%, 50℃에서는 35%로 활성이 감소하였다(Fig. 6). SmMDH의 최적 반응온도는 기존에 보고된 다른 미생물 유래 LDR 계열의 MDH 효소들에 비해 다소 높은 편이었으며, 이 효소들은 Table 1에 나타낸 바와 같이 산화·환원반응에서 동일한 최적 온도를 보였다.
- SmMDH의 최적 반응온도는 기존에 보고된 다른 미생물 유래 LDR 계열의 MDH 효소들에 비해 다소 높은 편이었으며, 이 효소들은 Table 1에 나타낸 바와 같이 산화·환원반응에서 동일한 최적 온도를 보였다. 한편, pH에 대한 의존도를 측정한 결과, D-mannitol 산화반응의 경우 pH 9.0에서 가장 높은 활성을 보인 반면, D-fructose 환원반응의 경우에는 pH 7.0에서 최적의 활성을 나타내었다(Fig. 7). 이와 같이 산화·환원반응의 최적 pH가 상이한 현상은 S.
- 기질에 대한 특이성을 확인하기 위하여 다양한 당알콜(Dmannitol, D-sorbitol, D-xylitol), 육탄당(D-glucose, D-fructose, D-galactose), 오탄당(D-arabinose, D-xylose) 기질에 대한 반응산물을 분석하였다. 결과적으로 D-mannitol과 D-fructose 사이의 상호 전환반응이 관찰되었으며, D-sorbitol을 Lsorbose로 전환하는 반응의 경우 D-mannitol과 비교하여 약 85% 수준의 상대활성을 보였으나, 그 외의 기질에는 작용하지 않음을 확인하였다. 반면에 SmMDH와 42.
- fluorescens MDH의 경우에 D-sorbitol 산화반응이 D-mannitol에 비해 더 높은 것으로 보고되었다[20]. 따라서, SmMDH 효소는 D-mannitol, D-fructose, D-sorbitol을 기질로 이용하는 NAD+/NADH-의존형 MDH (EC 1.1.1.67) 효소로 판단하였다.
- 이상의 결과를 종합하여 토양 미생물 Sinorhizobium meliloti 1021에서 유래한 SmMDH는 전형적인 LDR 계열의 NAD+/NADH-의존형 MDH임을 확인하였다. 이러한 SmMDH 에 대한 연구 결과는 향후 식물 내 공생균의 탄수화물 대사경로 규명에 활용될 수 있으며, 산업적으로 활용 가치가 높은 mannitol의 효율적이고 경제적인 효소적 생산방법 개발에 학문적 기초를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.
- 이 유전자는 494개의 아미노산(약 54 kDa)을 암호화하는 1,485 bp의 염기로 구성되며, 기존에 보고된 long-chain dehydrogenase/ reductase 계열 MDH 효소들과 약 35-55%의 아미노산 서열상동성을 나타내었다. 재조합 SmMDH의 최적 반응온도는 40℃이며, pH 7.0의 조건에서 최대의 D-fructose 환원활성, 그리고 pH 9.0에서 최대의 D-mannitol 산화활성을 보였다. 특히, 이 효소는 NAD+/NADH 조효소의 존재 하에서 산화·환원 활성을 나타내며, NADP+/NADPH는 조효소로 이용하지 못하였다.
- 특히, 이 효소는 NAD+/NADH 조효소의 존재 하에서 산화·환원 활성을 나타내며, NADP+/NADPH는 조효소로 이용하지 못하였다. 결론적으로 SmMDH는 전형적인 NAD+/NADH-의존형 mannitol dehydrogenase (EC 1.1.1.67)임을 확인하였다.
후속연구
- /NADH-의존형 MDH임을 확인하였다. 이러한 SmMDH 에 대한 연구 결과는 향후 식물 내 공생균의 탄수화물 대사경로 규명에 활용될 수 있으며, 산업적으로 활용 가치가 높은 mannitol의 효율적이고 경제적인 효소적 생산방법 개발에 학문적 기초를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.
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