선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이 연구는 금은화가 염증 반응에서 발생되는 type Ⅰ IFN 생성의 억제에 미치는 효과를 확인하기 위하여, LPS로 활성화된 대식세포에서 생성되는 IFN-α/β와, IFN의 전사활성인자인 IRF, 항염증 cytokine으로 알려진 IL-10, IFN에 의해 활성화되는 STAT 기전에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 은 금은화의 성분 중 하나인 luteolin이 LPS로 유도한 IFN-α/β를 억제하는 기전과 IFN 전사활성인자인 IRF 와의 연관성을 증명하였으나 IL-10과의 연관성은 밝혀내지 못하였다. 이에 금은 화가 항염증 cytokine인 IL-10의 생성에 영향을 미치는 영향을 알아보기 위하여 IL-10의 mRNA 생산량을 관찰하였다. 금은화 물 추출물을 처리한 지 2시간 이후부터 IL-10의 mRNA 생산량이 유의성 있게 증가하는 것을 관찰할 수 있고, 3시간 경과하였을 때 가장 많은 증가량을 보였다(Fig.
- 이에 저자는 금은화가 IFN-α/β의 생성에 어떻게 관여하는지 알아보고자 금은화의 물 추출물을 제조하여 LPS로 유도한 대식세포에서 IFN-α/β의 생성에 미치는 기전에 대해서 조사하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 동일한 양의 단백질에 sampling buffer(4X)를 같이 넣어 섞은 다음 그 샘플을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한후 membrane에 옮기고 나서 5% skin milk로 2시간 동안 blocking하였다. STAT-1, 3의 phosphorylation과 STAT-1, 3를 ECL detection 용액(Amersham, Carlsbad, CA, USA)으로 확인하였다.
- 금은화 100 g을 물 1 ℓ에 약탕기(대웅, 한국)로 3시간 가열 추출한 다음 여과한 후, 동결 건조하여 건조분말 23.56 g(수득율 : 23.56%)을 얻었으며, 생리식염수에 녹여 stock solution(100 mg/ml)을 제조하였다. 제조된 stock solution은-20℃에 보관하면서 분석방법에 적합하도록 희석하여 사용하였다.
- 금은화 물 추출물이 세포 생존률에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 대식세포에 금은화 물 추출물을 100, 250, 500 μg/ml 농도로 처리한 결과 모든 농도에서 세포의 생존율에 영향을 주지 않았다(Fig. 1).
- 금은화가 IFN-α/β의 생성에 미치는 영향을 알아보고자 금은화 물 추출물을 제조하여 LPS로 유도한 대식세포에 IFN-α/β의 생산에 미치는 기전에 대해서 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 금은화의 면역조절 기전을 알아보기 위하여 IFN-α/β의 생성에 중요한 역할을 한다고 알려진 IRF-3가 핵으로 이동하는 지를 관찰하였다.
- 금은화의 면역조절 기전을 조사하기 위하여 IFN-α/β의 생성에 중요한 역할을 한다고 알려진 IRF-1, 7의 mRNA 생성을 측정하였다.
- 1% TritonX-100용액으로 상온에서 15분간 배양하였다. 세척을 하고 blocking serum으로 1시간 blocking 한 뒤 1:100으로 희석한 1차 항체 IRF-3 antibody(Zymed, 51-3200, Invitrogen, Carlsbad, CA92008, USA)를 넣어 하룻밤 동안 배양하고 다음날 1:50으로 희석한 Alexafluor 568 형광이 붙어있는 2차 항체 goat anti-rabbit IgG(Invitrogen, USA)로 4시간 동안 암실에서 반응시키고 핵 염색을 위하여 1:1000으로 희석시킨 DAPI 로 30분간 염색시켜 형광현미경으로 관찰하였다.
- 세포들을 RPMI 배지에서 2×105 cells/well의 밀도로 현탁하여 100, 250, 500 μg/m의 농도로 금은화 물 추출물을 처리하였다.
- 실험 3~4일 전에 실험 mouse에 염증 물질인 thioglycollate 2~3 ml을 복강 내에 투여하고, RPMI-1640+10% FBS medium 6~7 ml를 복강 내에 투여한 다음 복강액을 뽑아내 원심분리한 후 cell을 counting 해서 Dish나 Plate에 깔고 5% CO2 37℃가 유지되는 incubator에서 3시간 배양하고, suspension 세포를 버린 후에 부착한 세포를 대식세포로 간주하여 실험하였다.
- 이에 금은화가 IFN-α/β생산을 억제하는 기전이 금은화에 의해 생산 유도된 IL-10과 관련이 있을 것이라는 가설을 세우고 이를 검증하기 위하여, IL-10 중화항체를 사용하여 그 기능을 억제시킨 후 IFN-α/β와 IRF-1, 7의 mRNA 생산에 미치는 영향을 조사하였다.
대상 데이터
- 실험동물인 C57BL/6 mice는 Orient Bio Co.(경기도 성남, 대한민국)에서 구입하였다.
- 세포배양에 사용한 RPMI-1640, Fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin 는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. Thioglycollate(TG)는 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, Tri-zol reagent와 polymerase chain reaction(PCR) reaction kit, IL-10중화항체는 Invitrogen cooporation(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용한 항체인 Phospho STAT-1, 3 항체는 Cell signaling(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 Thermo scientific 은 Tewksbury(MA, USA), Bio-rad는 Hercules (CA, USA), Applied Biosystems은 Invitrogen cooporation Carlsbad(CA, USA)에서 구입하였다.
- 세포배양에 사용한 RPMI-1640, Fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin 는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. Thioglycollate(TG)는 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, Tri-zol reagent와 polymerase chain reaction(PCR) reaction kit, IL-10중화항체는 Invitrogen cooporation(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용한 항체인 Phospho STAT-1, 3 항체는 Cell signaling(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다.
- Thioglycollate(TG)는 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, Tri-zol reagent와 polymerase chain reaction(PCR) reaction kit, IL-10중화항체는 Invitrogen cooporation(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용한 항체인 Phospho STAT-1, 3 항체는 Cell signaling(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 Thermo scientific 은 Tewksbury(MA, USA), Bio-rad는 Hercules (CA, USA), Applied Biosystems은 Invitrogen cooporation Carlsbad(CA, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 금은화(Lonicera japonica, LJ)는 옴니허브(경북 영천, 대한민국)에서 구입하여 정선해서 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계 처리는 SPSS version 10.0을 이용하여 Student's t-test 에 준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 대식세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정했다. 세포들을 RPMI 배지에서 2×105 cells/well의 밀도로 현탁하여 100, 250, 500 μg/m의 농도로 금은화 물 추출물을 처리하였다.
- 추출한 RNA는 reverse transcriptase PCR의 protocol을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 간단히 기술하자면 역전사 반응을 위하여 1 mg의 total RNA에 0.
성능/효과
- 1. 금은화 물 추출물은 IFN-α/β의 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 2. 금은화 물 추출물은 IRF-1, 7의 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제하고, IRF-3가 핵으로 이동하여 IFN-α/β를 생성하는 과정 또한 억제하였다.
- 3. 금은화 물 추출물은 IL-10의 분비를 증가시키며, 금은화 물 추출물 처리시간에 따른 IL-10의 생성효과와 IRF-1, 7, IFN-α/β 생성억제 효과가 일치하였다.
- 4. IL-10의 중화항체 처리를 했을 때 IRF-1, 7, IFN-α/β 생성억제 효과가 유의성 있게 감소됨으로써 IRF-1, 7, IFN-α/β 생성억제에 IL-10이 관여함을 확인할 수 있었다.
- 5. IFN-α/β가 관여하는 STAT-1, 3의 인산화를 조사하여, 금은화 물 추출물이 LPS로 유도된 IFN-α/β의 생성 억제에 관여하고 그 이후의 기전인 STAT-1, 3의 활성화를 감소시키는 것을 확인하였다.
- 금은화의 면역조절 기전을 조사하기 위하여 IFN-α/β의 생성에 중요한 역할을 한다고 알려진 IRF-1, 7의 mRNA 생성을 측정하였다. real time RT-PCR을 이용하여 IRF-1, 7에 금은화 물 추출물이 미치는 영향을 조사한 결과 금은화물 추출물은 IRF-1, 7의 mRNA 생성을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 3).
- 이에 금은 화가 항염증 cytokine인 IL-10의 생성에 영향을 미치는 영향을 알아보기 위하여 IL-10의 mRNA 생산량을 관찰하였다. 금은화 물 추출물을 처리한 지 2시간 이후부터 IL-10의 mRNA 생산량이 유의성 있게 증가하는 것을 관찰할 수 있고, 3시간 경과하였을 때 가장 많은 증가량을 보였다(Fig. 5A). 또한 IL-10의 생산량이 증가하는 2~3시간 사이에 IFN-α/β 와 IRF-1, 7의 생산량이 유의성 있게 억제되는 것을 볼 수 있다(Fig.
- 금은화 물 추출물이 IFN-α/β 생성을 억제하는 기전을 알아보기 위하여 금은화 물 추출물이 IRF-1, 7의 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사한 결과, 금은화물 추출물은 IRF-1, 7의 mRNA 발현을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 3).
- 금은화 물 추출물이 IL-10을 통한 면역조절 기전에 미치는 영향을 더욱 정확하게 검증하기 위해 IL-10 중화항체인 IL-10 neutralizing antibody를 이용하여 실험한 결과, 금은화 물 추출물만을 처리했을 때 IFN-α/β, IRF-1, 7의 생성이 억제되는 것에 반해(Fig. 6A, 6B), IL-10중화항체를 처리했을 때는 IFN-α/β, IRF-1, 7의 억제 효과가 나타나지 않았다 (Fig. 6A, 6B).
- 금은화의 IFN-α/β의 생성억제 기전을 알아보기 위하여, IL-10의 mRNA 발현을 조사한 결과 IL-10은 금은화 물 추출물을 전처리하였을 때 생성이 증가하였다(Fig. 5A).
- 대식세포에 금은화 물 추출물을 3시간 전처리한 다음, LPS로 1시간 자극하고 real time RT-PCR 의 방법을 이용하여 확인한 결과, 금은화 물 추출물은 IFN-α/β 의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 억제 하였다(Fig. 2).
- 대식세포에 금은화 물 추출물을 처리하여 24시간 후에 세포의 생존율을 측정한 결과 금은화 물 추출물은 대식세포에 독성을 나타내지 않았다(Fig. 1).
- 이는 이전 정 등63)의 연구에서 luteolin의 IFN-α/β 억제 효과가 IL-10 경로를 통한 것이 아니라는 결과와는 상이하였다. 또한 금은화물 추출물은 STAT-1, 3의 인산화를 억제하여 염증 반응 중에 cytokine의 지속적인 분비에도 관여하는 것을 알 수 있 었다.
- 금은화의 면역조절 기전을 알아보기 위하여 IFN-α/β의 생성에 중요한 역할을 한다고 알려진 IRF-3가 핵으로 이동하는 지를 관찰하였다. 면역염색법을 이용하여 금은화 물 추출물이 IRF-3에 미치는 영향을 조사한 결과 금은화 물 추출물은 IRF-3가 핵으로 이동하여 IFN 을 생성하는 과정을 억제하였다(Fig. 4).
- 실험결과 IL-10의 기능을 억제하지 않은 상태에서는 IFN-α/β와 IRF-1, 7의 생성이 억제되는 것에 비해(Fig. 6A, 6B), IL-10 중화항체를 사용하여 IL-10의 기능을 억제시켰을 때에는 IFN-α/β와 IRF-1, 7의 생성이 억제되지 않는 것을 관찰하였다(Fig. 6A, 6B).
- 7). 이 결과는 금은화 물 추출물이 type Ⅰ IFN의 생성 억제에 관여하고, 그 이후의 기전인 STAT signaling의 활성화 또한 감소시킨다는 것을 보여준다.
- 이 연구에서 금은화 물 추출물이 IFN-α/β의 mRNA 수준의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 이에 금은화 물 추출물이 IFN-α/β에 의해서 활성화되는 STAT 경로의 활성 여부를 알아보기 위해 실험한 결과, LPS 로 자극한 대식세포에서 금은화 물 추출물을 전처리한 군에서는 STAT-1, 3 모두 인산화하지 않았다(Fig. 7).
- 한의학에서 사용되는 대표적인 항염증 약물인 금은화 물 추출물로 대식세포의 type I IFN 억제와 그 기전에 미치는 영향을 검증한 결과 금은화 물 추출물은 IRF-1, 3, 7의 억제를 통해 type Ⅰ IFN 생산을 감소시키는 효과를 보여주었으며, 이러한 억제 기전에 IL-10이 관여하고 있음을 알 수 있었다. 이는 이전 정 등63)의 연구에서 luteolin의 IFN-α/β 억제 효과가 IL-10 경로를 통한 것이 아니라는 결과와는 상이하였다.
후속연구
- 따라서 금은화는 type I IFN 생성억제 기전을 이용한 항염증 약물로써의 개발 가능성이 있다고 판단되며, 향후 금은화의 type I IFN 생성억제 기전에 미치는 영향에 대한 세밀하고 다양한 방면으로의 추가 연구가 필요하다고 사료된다.
- 이 결과는 기존에 luteolin을 통한 연구에서 luteolin 전처리는 IL-10의 생성을 증가시키지만, IL-10의 기능이 억제된 상태하에서는 IFN-α/β의 생성에 미치는 영향이 없었다는 결과63)와는 상이한 것으로, 금은화의 다른 성분 혹은 아직 밝혀지지 않은 성분이 IL-10을 통한 typeⅠ IFN의 억제효과에 기여할 것으로 판단되며 향후 이에 대한 추가 연구가 필요하다고 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.