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문제 정의
- 닥나무 뿌리 추출물의 안정도를 향상시킨 PMS3-BKRE의 생물학적 활성을 확인하고자 B16 murine melanoma 세포주를 이용하여 멜라닌 생성 저해 효과를 확인하였다. 닥나무 뿌리 추출물은 B16 murine melanoma 세포주에 독성을 주지 않는 농도로 처리했을 때 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인 하였다(Figure 7a).
제안 방법
- Tyrosinase 반응은 실험 시료별 효소 10 unit의 해당되는 양을 넣고 반응용액으로 최종 부피가 100 µL가 되도록 맞춘다. L-DOPA 100 µL를 넣고 바로 475 nm에서 흡광도을 측정하고(Time 0), 37 ℃에서 10분간 반응시킨 후, 신속하게 ice에서 반응을중단시킨 후에 흡광도를 측정하였다(Time 10). 10분간 변화된 흡광도의 차이를 대조군과 비교하였다.
- PMMA 단독으로 고분자 매트릭스를 구성하고 있는 PMS1-BKRE의 경우, 기존의 여러 연구결과에서 보고된 바와 같이 평균 10 µm의 입도를 가지는 안정한 구형의 입자가 제조되었음을 광학현미경 이미지(Figure 2a)와 SEM 이미지(Figure 3a)를 통해 확인하였다.
- PEA는 생분해성과 결정성을 가지는 지방족 폴리에스터로써 높은 결정성 고분자 매트릭스 조성을 통한 효과적인 닥나무 뿌리 추출물 안정화 효 과를 기대하였으며, 높은 결정성을 가지는 반면 낮은 융점(약 50 ℃)을 보이는 PEA의 단점을 극복하고 최종적으로 얻어지는 고분자 마이크로입자의 물리적 강도를 보완해주기 위하여 화장품 고분자 소재로써 널리 사용되는 폴리아크릴계 고분자인 PMMA를 사용하였다. Table 1의 조성에 따라 제조된 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 고분자 마이크로입자들의 구의 형태와 물리적 안정성은 광학현미경과 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 확인하였다.
- Table 1의 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 샘플들에 대한 kazinol C 장기안정도를 비교해 보았으며 그결과는 Table 3에 정리하였다. 각 샘플들의 kazinol C 초기함량을 HPLC를 이용하여 분석한 시점으로부터 매달 kazinol C의 함량을 측정하였으며 총 4개월 동안 측정을 진행하였다. Kazinol C 안정도는 초기함량에 대한 각 측정시기별 함량분석 결과의 백분율로 나타내었다.
- Homomixer Mark II, Takushu Kika Kogyo Ltd, Japan)로 약 5분 동안 5,000 rpm의 속도로 교반하여 O/W 에멀젼을 제조하였다. 감압증류기를 이용하여 오일상을 용해하는데 사용된 디클로로메탄이 제거될 때까지 약 3시간 동안 40 ℃에서 감압증류하고 여과 및 건조를 통해 최종 마이크로입자를 제조하였다.
- BSA 정량법으로 총 단백질 양을 측정한다. 결과는 측정한 단백질 양에 대한 총 멜라닌 양으로 환산하였다. 환산된 총 멜라닌 양의 차이를 물질을 처리하지 않은 대조군을 기준으로 비교하였다
- 닥나무 뿌리 추출물은 tyrosinase 활성을 저해함으로써 미백 효능을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다. 고분자 마이크로입자 제조 실험에서 상대적으로 우수한 소재물성를 보인 PMS3-BKRE 고분자 마이크로입자에 안정화된 닥나무 뿌리 추출물의 미백 활성에 미치는 영향을 확인하고자 mushroom tyrosinase 활성 저해 효과를 평가하였다. 그 결과 PMS3-BKRE에 함유된 닥나무 뿌리 추출물 함량 5%로 환산 시 유사한 저해효과를 나타내고 있다.
- 닥나무 뿌리 추출물을 함유한 고분자 마이크로입자는 O/W 액중건조법을 이용하여 제조하였으며, 마이크로입자의 제조방법은 다음과 같다. 고분자와 닥나무 뿌리 추출물을 디클로로메탄에 용해시켜 완전히 용해시켜 오일상을 제조하였고, 폴리비닐알콜 1 wt%의 증류수에 상기 오일상을 천천히 첨가하면서 호모 믹서기(T.K. Homomixer Mark II, Takushu Kika Kogyo Ltd, Japan)로 약 5분 동안 5,000 rpm의 속도로 교반하여 O/W 에멀젼을 제조하였다. 감압증류기를 이용하여 오일상을 용해하는데 사용된 디클로로메탄이 제거될 때까지 약 3시간 동안 40 ℃에서 감압증류하고 여과 및 건조를 통해 최종 마이크로입자를 제조하였다.
- 닥나무 뿌리 추출물은 우수한 멜라닌 생성저해 효과를 보임에도 불구하고 추출물에 포함된 효능성분들의 불안정성 때문에 쉽게 화장품 제형에 도입하기가 어렵다. 따라서 효능성분의 안정성에 안좋은 영향을 줄 수 있는 외부환경으로부터 효과적으로 보호해줄 수 있는 고분자 매트릭스에 닥나무 뿌리 추출물의 효능성분들을 안정화하기 위하여 고분자 마이크로입자 시스템을 도입하게 되었다. 일반적으로 고분자 마이 크로입자 제조시 최종적으로 얻어지는 마이크로입자의 특성에 영향을 미치는 인자들은 고분자의 종류 및농도, 유화제의 종류 및 농도, 입자 제조 시 교반 속도등 매우 다양하지만, 본 연구에서는 다른 변수들은 고정을 하고 고분자의 종류 및 조성에만 변화를 주어 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 고분자 마이크로입자를 제조하였다.
- 본 연구에서는 결정성과 생분해성을 보이는 지방족 폴리에스터인 폴리에틸렌아디페이트(polyethylene adipate, PEA)와 대표적인 폴리아크릴계 고분자인 폴리 메틸메타크릴레이트(poly methyl methacrylate, PMMA) 를 적절히 혼합하여 유효성분을 효과적으로 안정화시킬 수 있는 고분자 매트릭스(matrix)를 구성하고 그 내부에 닥나무 뿌리 추출물이 균일하게 분산되어 있는 마이크로입자를 제조하였다. 본 연구에서 제조된 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 마이크로입자는 고분자 조성을 달리하여 제조함에 따른 마이크로입자의 구조 분석 및 닥나무 뿌리 추출물의 안정도를 평가하였으며, 가장 우수한 안정도를 보이는 닥나무 뿌리 추출물 함유 마이크로입자에 대한 in-vitro 미백효능을 평가하였다.
- 본 연구에서는 결정성과 생분해성을 보이는 지방족 폴리에스터인 폴리에틸렌아디페이트(polyethylene adipate, PEA)와 대표적인 폴리아크릴계 고분자인 폴리 메틸메타크릴레이트(poly methyl methacrylate, PMMA) 를 적절히 혼합하여 유효성분을 효과적으로 안정화시킬 수 있는 고분자 매트릭스(matrix)를 구성하고 그 내부에 닥나무 뿌리 추출물이 균일하게 분산되어 있는 마이크로입자를 제조하였다. 본 연구에서 제조된 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 마이크로입자는 고분자 조성을 달리하여 제조함에 따른 마이크로입자의 구조 분석 및 닥나무 뿌리 추출물의 안정도를 평가하였으며, 가장 우수한 안정도를 보이는 닥나무 뿌리 추출물 함유 마이크로입자에 대한 in-vitro 미백효능을 평가하였다.
- 폴리올에 용해되어있는 닥나무 뿌리 추출물 및 고분자 마이크로입자에 함유된 닥나무 뿌리 추출물의 지표물질인 kazinol C의 함량은 C18 칼럼과 UV 280 nm를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피(2060 plus, Jasco, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석시작 시점 및 4개월 동안 한달 주기로 각각의 kazinol C 함량을 측정하여 샘플 간의 kazinol C 장기안정도를 평가하고 닥나무 뿌리 추출물의 고분자 마이크로입자에 대한 봉입효율을 확인하였다.
- 상기의 방법으로 제조된 고분자 마이크로입자의 형태 및 입자크기를 평가하기 위하여 각각 광학/편광현미경(BX50, Olympus, Japan), 주사전자현미경(S-4300, Hitachi, Japan)을 사용하였다.
- 이후 세포 배지에서 멜라닌을 함유한 상층액 200 µL를 얻어서 405 nm에서 흡광도를 측정하여 melanin 양을 측정하였다.
- 따라서 효능성분의 안정성에 안좋은 영향을 줄 수 있는 외부환경으로부터 효과적으로 보호해줄 수 있는 고분자 매트릭스에 닥나무 뿌리 추출물의 효능성분들을 안정화하기 위하여 고분자 마이크로입자 시스템을 도입하게 되었다. 일반적으로 고분자 마이 크로입자 제조시 최종적으로 얻어지는 마이크로입자의 특성에 영향을 미치는 인자들은 고분자의 종류 및농도, 유화제의 종류 및 농도, 입자 제조 시 교반 속도등 매우 다양하지만, 본 연구에서는 다른 변수들은 고정을 하고 고분자의 종류 및 조성에만 변화를 주어 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 고분자 마이크로입자를 제조하였다. 본 연구에서 제조된 샘플들의 조성은 Table 1에 정리하였다.
- 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 DMSO 150 µL를 가하여 용해시킨 다음, 용해된 formazan dye를 540 nm에서 측정한다. 측정된 흡광도를 물질을 처리하지 않은 대조군을 기준으로 비교하였다.
- 폴리올에 용해되어있는 닥나무 뿌리 추출물 및 고분자 마이크로입자에 함유된 닥나무 뿌리 추출물의 지표물질인 kazinol C의 함량은 C18 칼럼과 UV 280 nm를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피(2060 plus, Jasco, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석시작 시점 및 4개월 동안 한달 주기로 각각의 kazinol C 함량을 측정하여 샘플 간의 kazinol C 장기안정도를 평가하고 닥나무 뿌리 추출물의 고분자 마이크로입자에 대한 봉입효율을 확인하였다.
- 결과는 측정한 단백질 양에 대한 총 멜라닌 양으로 환산하였다. 환산된 총 멜라닌 양의 차이를 물질을 처리하지 않은 대조군을 기준으로 비교하였다
대상 데이터
- 본 연구에서 고분자 마이크로입자의 매트릭스 고분자로써 폴리에틸렌아디페이트(Aldrich, USA)와 폴리메틸메타크릴레이트(LG화학, Korea)를 사용하였고, 미백 유효성분으로써 닥나무 뿌리 추출물(LCS바이오텍, Korea)을 공급받아 사용하였다. 그 밖에 마이크로 입자를 제조하기 위하여 디클로로메탄(Aldrich, USA), 폴리비닐알콜(Kuraray, Japan)을 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에서 고분자 마이크로입자의 매트릭스 고분자로써 폴리에틸렌아디페이트(Aldrich, USA)와 폴리메틸메타크릴레이트(LG화학, Korea)를 사용하였고, 미백 유효성분으로써 닥나무 뿌리 추출물(LCS바이오텍, Korea)을 공급받아 사용하였다. 그 밖에 마이크로 입자를 제조하기 위하여 디클로로메탄(Aldrich, USA), 폴리비닐알콜(Kuraray, Japan)을 구입하여 사용하였다.
- Table 1의 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 샘플들에 대한 kazinol C 함량 및 봉입효율을 확인하였으며그 결과는 Table 2에 정리하였다. 본 연구에서 사용한 닥나무 뿌리 추출물은 물에 용해되지 않는 친유성 성질을 가진다. 따라서 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 고분자 마이크로입자를 제조할 경우, 닥나무 뿌리 추출물은 친유성을 보이는 고분자 매트릭스에 존재하게 된다.
- 본 연구에서 제조된 고분자 마이크로입자의 고분자 매트릭스를 구성하는 고분자로써 수평균 분자량 6만정도의 PMMA와 수평균 분자량 1만 정도의 PEA를사용하였다. PEA는 생분해성과 결정성을 가지는 지방족 폴리에스터로써 높은 결정성 고분자 매트릭스 조성을 통한 효과적인 닥나무 뿌리 추출물 안정화 효 과를 기대하였으며, 높은 결정성을 가지는 반면 낮은 융점(약 50 ℃)을 보이는 PEA의 단점을 극복하고 최종적으로 얻어지는 고분자 마이크로입자의 물리적 강도를 보완해주기 위하여 화장품 고분자 소재로써 널리 사용되는 폴리아크릴계 고분자인 PMMA를 사용하였다.
- 한국세포주은행으로부터 구입한 B16 mouse melanoma 세포를 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)으로 75T flask에 12 mL 배지로 37 ℃, 10% CO2 배양기에서 배양한다.
이론/모형
- 배지를 제거하고 남은 세포는 lysis buffer를 이용하여 세포 단백질을 얻는다. BSA 정량법으로 총 단백질 양을 측정한다. 결과는 측정한 단백질 양에 대한 총 멜라닌 양으로 환산하였다.
- 닥나무 뿌리 추출물을 함유한 고분자 마이크로입자는 O/W 액중건조법을 이용하여 제조하였으며, 마이크로입자의 제조방법은 다음과 같다. 고분자와 닥나무 뿌리 추출물을 디클로로메탄에 용해시켜 완전히 용해시켜 오일상을 제조하였고, 폴리비닐알콜 1 wt%의 증류수에 상기 오일상을 천천히 첨가하면서 호모 믹서기(T.
성능/효과
- 앞서 설명한 바와 같이 PEA와 PMMA를 함께 사용하여 제조한 고분자 마이크로입자는 결정성 고분자 매트릭스를 가짐과 동시에 입자의 물리적인 안정도 역시 양호하여 장기안정도가 좋지 않은 닥나무 뿌리 추출물에 상기 고분자 마이크로입자 안정화 시스템을 도입함으로써 활성성분 장기적인 안정성을 향상시켜 소재의 상용성을 증가시킬 수 있는 효과적인 소재임을 확인할 수 있었다. PEA의 단점인 낮은 융점을 보완하기 위하여 PMMA를 도입함에 따라 안정한 구형의 형태를 유지하면서도 PEA의 결정성 고분자 매트릭스를 가짐으로써 닥나무 뿌리 추출물의 kazinol C를 비롯한 다양한 활성성분들을 효과적으로 안정화시킬수 있는 마이크로입자를 제조할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 닥나무 뿌리 추출물과 같이 불안정한 활성성분에 상기 고분자 마이크로입자 시스템을 적용함 으로써 활성성분들의 안정성 및 상용성 향상에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 예상한다.
- 고분자 마이크로입자를 사용하지 않고 부틸렌글리콜에 닥나무 뿌리 추출물을 용해시킨 BG-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 보면 알 수 있듯이, 상온에서는 비교적 양호한 반면 40 ℃에서 kazinol C의 안정도가 시간이 지남에 따라 급격히 감소함을 알 수 있다. PMS1-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 통해 PMMA 단독으로 사용된 마이크로입자에 함유된 kazinol C의 장기안정도를 살펴보면 고분자 마이크로입자 시스템이 도입되지 않은 BG-BKRE의 kazinol C 안정도에 비해 물리적인 보호효과를 통해 상대적으로 양호해 보이지만 만족할만한 수준의 안정도는 아니다. 한편, PMS2-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 보면 알 수 있듯이 PEA를 사용하여 높은 결정성 고분자 매트릭스를 가지는 마이크로입자에 함유된 kazinol C 의 장기안정도는 BG-BKRE나 PMS1-BKRE의 kazinol C 안정도에 비해 매우 우수한 것으로 나타났다.
- 고분자 마이크로입자를 사용하지 않고 부틸렌글리콜에 닥나무 뿌리 추출물을 용해시킨 BG-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 보면 알 수 있듯이, 상온에서는 비교적 양호한 반면 40 ℃에서 kazinol C의 안정도가 시간이 지남에 따라 급격히 감소함을 알 수 있다. PMS1-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 통해 PMMA 단독으로 사용된 마이크로입자에 함유된 kazinol C의 장기안정도를 살펴보면 고분자 마이크로입자 시스템이 도입되지 않은 BG-BKRE의 kazinol C 안정도에 비해 물리적인 보호효과를 통해 상대적으로 양호해 보이지만 만족할만한 수준의 안정도는 아니다.
- 고분자 마이크로입자 제조 실험에서 상대적으로 우수한 소재물성를 보인 PMS3-BKRE 고분자 마이크로입자에 안정화된 닥나무 뿌리 추출물의 미백 활성에 미치는 영향을 확인하고자 mushroom tyrosinase 활성 저해 효과를 평가하였다. 그 결과 PMS3-BKRE에 함유된 닥나무 뿌리 추출물 함량 5%로 환산 시 유사한 저해효과를 나타내고 있다. 고분자 마이크로입자를 통한 안정화는 닥나무 뿌리 추출물의 활성에 영향을 미치지않음을 알 수 있다(Figure 4).
- 고분자 마이크로입자를 통한 안정화는 닥나무 뿌리 추출물의 활성에 영향을 미치지않음을 알 수 있다(Figure 4). 닥나무 뿌리 추출물 분말과 PMS3-BKRE를 상온과 40 ℃에서 8주간 보관한 후에 tyrosinase 활성 저해 효과를 비교한 결과 고분자 마이크로입자로 안정화했을 때 고온 조건에서의 활성이 보호되고 있는 것을 확인할 수 있었다(Figure 5). 이는 kazinol C를 비롯한 닥나무 뿌리 추출물의 효능성분들의 장기안정도 향상(Table 3) 효과에서 기인하는 것으로 예상된다.
- 닥나무 뿌리 추출물의 안정도를 향상시킨 PMS3-BKRE의 생물학적 활성을 확인하고자 B16 murine melanoma 세포주를 이용하여 멜라닌 생성 저해 효과를 확인하였다. 닥나무 뿌리 추출물은 B16 murine melanoma 세포주에 독성을 주지 않는 농도로 처리했을 때 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인 하였다(Figure 7a). PMS3-BKRE도 닥나무 뿌리 추출물과 같은 멜라닌 생성 저해 효과를 보인다(Figure 7b).
- 닥나무 뿌리 추출물의 지표성분은 닥나무 뿌리 추출물의 에틸알콜 분획물의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 후 확인이 용이한 피크 중 가스크로마토그래피 / 질량분석기(GC / MS) 분석을 통하여 단일 물질로 나타나는 피크를 분취하여 핵자기공명 분광법(NMR) 측정결과, kazinol C임을 확인하였다(Figure 1). Kazinod C는 강력한 tyrosinase 활성 저해성분으로 알려진 Kazinol F (5-(3-(2,4-dihydroxyphenyl)propyl)-3,4-bis (3-methyl-2-butenyl)-1,2-benzenediol)와 같은 1,3-Diphenylpropane 화합물로 닥나무 뿌리 껍질 추출물 중에 8 ~ 15% 수준으로 존재하는 성분이며 단일물질로 분리 및 분석이 용이하다[1].
- 따라서 닥나무 뿌리 추출물을 함유하는 고분자 마이크로입자를 제조할 경우, 닥나무 뿌리 추출물은 친유성을 보이는 고분자 매트릭스에 존재하게 된다. 본 연구에서 제조한 모든 샘플에서 닥나무 뿌리 추출물의 석출현상은 없었으며 이는 광학현미경과 SEM으로 확인하였다. 닥나무 뿌리 추출물의 봉입효율은 샘플 제조 시 투입한 닥나무 뿌리추출물의 kazinol C 함량에 대한 고분자 마이크로입자에 함유된 kazinol C 함량분석 결과의 백분율로 나타내었다.
- 앞서 설명한 바와 같이 PEA와 PMMA를 함께 사용하여 제조한 고분자 마이크로입자는 결정성 고분자 매트릭스를 가짐과 동시에 입자의 물리적인 안정도 역시 양호하여 장기안정도가 좋지 않은 닥나무 뿌리 추출물에 상기 고분자 마이크로입자 안정화 시스템을 도입함으로써 활성성분 장기적인 안정성을 향상시켜 소재의 상용성을 증가시킬 수 있는 효과적인 소재임을 확인할 수 있었다. PEA의 단점인 낮은 융점을 보완하기 위하여 PMMA를 도입함에 따라 안정한 구형의 형태를 유지하면서도 PEA의 결정성 고분자 매트릭스를 가짐으로써 닥나무 뿌리 추출물의 kazinol C를 비롯한 다양한 활성성분들을 효과적으로 안정화시킬수 있는 마이크로입자를 제조할 수 있었다.
- 한편, PMS2-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 보면 알 수 있듯이 PEA를 사용하여 높은 결정성 고분자 매트릭스를 가지는 마이크로입자에 함유된 kazinol C 의 장기안정도는 BG-BKRE나 PMS1-BKRE의 kazinol C 안정도에 비해 매우 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 PEA의 결정성 고분자 매트릭스를 가지는 마이크로입자가 PMMA의 무정형 고분자 매트릭스를 가지는 마이크로입자에 비해 kazinol C에 대해 상대적 으로 높은 안정화 효과를 보인다고 해석할 수 있다. PMMA와 PEA를 함께 사용하여 제조한 마이크로입자 시스템인 PMS3-BKRE의 kazinol C 장기안정도 역시 매우 양호한 결과를 보였다.
- PMS1-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 통해 PMMA 단독으로 사용된 마이크로입자에 함유된 kazinol C의 장기안정도를 살펴보면 고분자 마이크로입자 시스템이 도입되지 않은 BG-BKRE의 kazinol C 안정도에 비해 물리적인 보호효과를 통해 상대적으로 양호해 보이지만 만족할만한 수준의 안정도는 아니다. 한편, PMS2-BKRE의 kazinol C 장기안정도 결과를 보면 알 수 있듯이 PEA를 사용하여 높은 결정성 고분자 매트릭스를 가지는 마이크로입자에 함유된 kazinol C 의 장기안정도는 BG-BKRE나 PMS1-BKRE의 kazinol C 안정도에 비해 매우 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 PEA의 결정성 고분자 매트릭스를 가지는 마이크로입자가 PMMA의 무정형 고분자 매트릭스를 가지는 마이크로입자에 비해 kazinol C에 대해 상대적 으로 높은 안정화 효과를 보인다고 해석할 수 있다.
후속연구
- PEA의 단점인 낮은 융점을 보완하기 위하여 PMMA를 도입함에 따라 안정한 구형의 형태를 유지하면서도 PEA의 결정성 고분자 매트릭스를 가짐으로써 닥나무 뿌리 추출물의 kazinol C를 비롯한 다양한 활성성분들을 효과적으로 안정화시킬수 있는 마이크로입자를 제조할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 닥나무 뿌리 추출물과 같이 불안정한 활성성분에 상기 고분자 마이크로입자 시스템을 적용함 으로써 활성성분들의 안정성 및 상용성 향상에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 예상한다.
- 이런 결과를 볼 때 본 연구의 고분자 마이크로스피어를 활용한 안정화 방법은 닥나무 뿌리 추출물의 활성성분을 안정화하고 좋은 미백 효능을 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.
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