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문제 정의
- 본 연구에서는 DGGE를 이용하여 혼합 폐수의 생물학적 처리공정들의 박테리아의 군집을 분석한 결과, 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- 본 연구에서는 피혁 폐수와 수산 폐수를 혼합하여 처리하는 생물학적 폐수처리 공정의 단위공정들 내에 형성된 박테리아 군집의 구조와 밀도를 DGGE 기법을 이용하여 계절 변화 및 유입수의 성상 변화에 따른 생물학적 처리공정에서의 박테리아 군집들의 변화 특성을 평가하였다.
제안 방법
- 전기영동은 Bio-Rad사의 D-Code system (USA)을 이용하여 60℃에서 20 V로 30분간 pre-running 후, 200 V로 210분간 running하였다. 0.01% SYBR Gold (invitrogen)를 이용하여 20분간 staining하였으며, UV tansilluminator (MyImager 1000TM, SLB, USA)로 관찰하였다 [20]. DGGE band로부터 획득한 DNA를 주형으로 GC-clamp가 없는 341F, 518R primer를 사용하여 PCR을 진행하였다.
- 01% SYBR Gold (invitrogen)를 이용하여 20분간 staining하였으며, UV tansilluminator (MyImager 1000TM, SLB, USA)로 관찰하였다 [20]. DGGE band로부터 획득한 DNA를 주형으로 GC-clamp가 없는 341F, 518R primer를 사용하여 PCR을 진행하였다. T-blunt vector (Solgent co.
- 각각의 생물학적 처리공정에서 채취한 슬러지로부터 추출된 DNA를 주형으로 16S rDNA 부위를 direct PCR한 결과, 실험결과는 나타내지 않았으나 약 1460 bp의 size로 1% agarose gel에서 밴드가 확인되었으며, direct PCR을 통해 증폭된 16S rDNA를 주형으로 DGGE를 위한 nested PCR을 진행한 결과 150~170 bp의 size로 1% agarose gel에서 밴드가 확인되었다. DGGE gel의 농도구배는 30~50%로 설정하여 20 V에서 30분, 200 V 200분 running한 후, 0.01% SYBR gold로 염색하였다. 시기별 각각의 생물학적 반응조별 분석결과(band profile)를 Fig.
- FISH법을 이용하여 Eubacteria 분석을 하였으며, 고정된 시료를 gelatin으로 코팅된 slide glass에 놓고, probe 2 µL (5 µg/µL)와 hybridization buffer (0.9 mM NaCl, 0.01% SDS, 20 mM Tris/HCl, formamide 20%) 16 µL를 첨가하여 46℃에서 90분 동안 반응시켰다.
- PCR을 통해 증폭하여 정제된 DNA 2 µg/ µL을 8% acrylamide gel에 loading하였다. Gel의 농도 구배는 urea와 formamide를 변성제로 사용하여 30~50%로 하였다. 전기영동은 Bio-Rad사의 D-Code system (USA)을 이용하여 60℃에서 20 V로 30분간 pre-running 후, 200 V로 210분간 running하였다.
- Phylogenetic analysis에 사용한 16S rDNA sequence는 NCBI data base에 근거하였다. Phylogenetic tree는 neighbor-joining method를 사용하였고, MEGA (Ver 4.0) 프로그램을 이용해 1,000번의 bootstrap analysis를 진행하여 박테리아의 종 유연성 분석을 하였다 [22].
- DGGE band로부터 획득한 DNA를 주형으로 GC-clamp가 없는 341F, 518R primer를 사용하여 PCR을 진행하였다. T-blunt vector (Solgent co., Ltd., Korea)를 이용해 16S rDNA 단편을 plasmid에 삽입하여 염기서열 분석을 진행하였다. 분석된 16S rDNA 염기서열을 CLUSTAL W (Ver 2.
- Total bacteria 분석은 고정된 시료 2 Gl를 gelatin으로 코팅된 slide glass에 놓고, DAPI (4',6-diamidino 2-phenylindole; 1 Gg/mL;Sigma, USA)로 5분 동안 염색하였다.
- 박테리아 생체량 분석을 위해 시료 (습중량 1 g)를 4% paraformaldehyde solution (시료:고정액 = 1:3)으로 4℃에서 16 시간 동안 고정시켰다. 고정된 시료를 4℃, 12,000rpm의 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)으로 고정액을 세척하여 Eubacteria 및 total bacteria 분석에 사용하였다.
- 박테리아 생체량 분석을 위해 시료 (습중량 1 g)를 4% paraformaldehyde solution (시료:고정액 = 1:3)으로 4℃에서 16 시간 동안 고정시켰다. 고정된 시료를 4℃, 12,000rpm의 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)으로 고정액을 세척하여 Eubacteria 및 total bacteria 분석에 사용하였다.
- 또한, 호기조 (Tank 1)에는 폭기 시설이 설치되어져 있어 충분한 용존산소의 공급이 이루어진다. 시료 채취는 2009년 4월 및 2009년 9월에 유입되는 혼합 폐수와 각 반응조에서 처리된 처리수를 채수하여 수질분석을 하였으며, 각 반응조(Tank 1~3) 내의 슬러지를 채집하여 박테리아 군집을 조사하였다.
- Total bacteria 분석은 고정된 시료 2 Gl를 gelatin으로 코팅된 slide glass에 놓고, DAPI (4',6-diamidino 2-phenylindole; 1 Gg/mL;Sigma, USA)로 5분 동안 염색하였다. 염색된 시료는 멸균 증류수로 세척한 후 형광현미경(Axioskop2 plus, Carl Zeiss, Germany)로 계수하였다.
- 채취한 슬러지 600 µL를 fast DNASPIN for soil kit (MP Biomedicals, France)를 이용하여 chromosomal DNA를 추출 하였다.
- 채취한 슬러지 600 µL를 fast DNASPIN for soil kit (MP Biomedicals, France)를 이용하여 chromosomal DNA를 추출 하였다. 추출된 chromosomal DNA를 주형으로 27F와 1492R primer를 이용하여 16S rDNA 부분을 direct PCR한 후에, GCclamp가 달린 341F-GC와 518R primer를 이용하여 nested PCR을 진행하였다. 증폭된 PCR 산물은 PCR 정제 kit로 DNA를 정제하였다 [20].
- 미리 가열된 washing buffer로 48℃에서 15분 동안 세정하고 공기 중에서 건조시켰다. 형광현미경 (Axioskop 2 plus, Carl Zeiss, Germany)과 scanning confocal laser microscopy (LSM 510, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 800배 및 400배의 배율에서 field내에 나타난 박테리아 등을 10회 이상 계수하여 그 평균값을 계산하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 M 공단에 위치한 혼합 폐수처리장의 전체 처리공정을 Fig. 1에 개략적으로 나타내었다. 처리공정은 유량 조정조, 호기조 (Tank 1), 1차 침전조, 산소조 (Tank 2), 2차 침전조, 무산소조 (Tank 3), 3차 침전조, 섬유여과 공정으로 구성되어져 있다.
데이터처리
- , Korea)를 이용해 16S rDNA 단편을 plasmid에 삽입하여 염기서열 분석을 진행하였다. 분석된 16S rDNA 염기서열을 CLUSTAL W (Ver 2.0)를 이용해 정렬하였다 [21]. Phylogenetic analysis에 사용한 16S rDNA sequence는 NCBI data base에 근거하였다.
성능/효과
- 각각의 생물학적 처리공정에서의 BOD, COD 및 총질소 (TN)에 대한 제거율을 Table 4에 나타내었다. BOD 제거율은 Tank 1 (호기조)에서 약 75~90% 정도가 되었으며, Tank 2 (산소조), Tank 3 (무산소조)에서 약 8~9% 정도 제거되어, 전체적으로 최대 98% 이상의 제거율을 나타내었으나 피혁 폐수의 비율이 높았던 2009년 4월은 BOD 제거율이 83% 정도로 낮게 나타났다. COD 제거율은 Tank 1에서 65~77% 제거되었으며, Tank 2와 Tank 3에서는 8~9% 정도 제거되어 최종적으로 73~85% 정도의 제거율을 보였으며, 피혁 폐수의 비율이 높았던 2009년 4월에는 10% 이상 제거율이 저하되었다.
- 생물학적 처리조 별로 보면 Tank 1 (T1)과 Tank 2 (T2)에서 보다 Tank 3 (T3)에서 Eubacteriat/total bacteria 비율이 감소하는 것으로 보아 Tank 3 (T3)에서 탈질 관련 Eubacteria 이외의 여러 균들이 다수 존재한 것으로 판단된다. BOD/T-N의 비율은 4월에 1.01, 9월에 1.5로 나타났으며, 가장 높은 생체량을 보인 9월에 처리효율 또한 높게 나타났다.
- BOD 제거율은 Tank 1 (호기조)에서 약 75~90% 정도가 되었으며, Tank 2 (산소조), Tank 3 (무산소조)에서 약 8~9% 정도 제거되어, 전체적으로 최대 98% 이상의 제거율을 나타내었으나 피혁 폐수의 비율이 높았던 2009년 4월은 BOD 제거율이 83% 정도로 낮게 나타났다. COD 제거율은 Tank 1에서 65~77% 제거되었으며, Tank 2와 Tank 3에서는 8~9% 정도 제거되어 최종적으로 73~85% 정도의 제거율을 보였으며, 피혁 폐수의 비율이 높았던 2009년 4월에는 10% 이상 제거율이 저하되었다. T-N 제거율은 Tank 1~Tank 3을 거치면서 61~79% 정도였으며, Tank 3에서 총 제거된 T-N의 60% 이상이 제거되었다.
- 4에 나타내었다. Fig. 4에 나타낸 피혁 폐수와 수산 폐수의 비율이 6.5:3.5 (2009년 4월), 4.0:6.0 (2009년 9월)였을 때의 박테리아 생체량 결과를 비교해 보면 Eubacteria와 total bacteria의 생체량은 4월에 비해 9월의 경우가 약 3배 이상 높게 나타나 유입수 중의 피혁 폐수 비율이 생물학적 처리조내 박테리아들의 생체량에 많은 영향을 미치는 것으로 나타났다. 생물학적 처리조 별로 보면 Tank 1 (T1)과 Tank 2 (T2)에서 보다 Tank 3 (T3)에서 Eubacteriat/total bacteria 비율이 감소하는 것으로 보아 Tank 3 (T3)에서 탈질 관련 Eubacteria 이외의 여러 균들이 다수 존재한 것으로 판단된다.
- ① M 하수처리장으로 유입되는 유입수는 계절별로 피혁 폐수와 수산 폐수의 유입비율의 차이로 인하여 오염물질의 성상에 많은 차이를 나타내었다.
- ② 수산 폐수의 유입비율이 높았던 시기에는 피혁 폐수의 혼합비율이 높은 시기보다 생물학적 처리조들 내의 박테리아들의 생체량이 월등히 높았으며, BOD, COD 및 T-N의 제거율도 8~18% 정도 높게 나타난 반면 피혁 폐수의 유입비율이 높은 시기에는 피혁 폐수 중에 함유된 크롬 농도의 증가 영향으로 인해 각각의 생물학적 처리조 내의 박테리아들의 생체량이 감소함에 따라 오염물질들에 대한 처리효율이 저하되었다.
- 각각의 생물학적 처리공정에서 채취한 슬러지로부터 추출된 DNA를 주형으로 16S rDNA 부위를 direct PCR한 결과, 실험결과는 나타내지 않았으나 약 1460 bp의 size로 1% agarose gel에서 밴드가 확인되었으며, direct PCR을 통해 증폭된 16S rDNA를 주형으로 DGGE를 위한 nested PCR을 진행한 결과 150~170 bp의 size로 1% agarose gel에서 밴드가 확인되었다. DGGE gel의 농도구배는 30~50%로 설정하여 20 V에서 30분, 200 V 200분 running한 후, 0.
- T-N과 T-P의 경우는 각각 353~371 mg/L 및 25~31 mg/L의 범위로 나타났다. 또한, 피혁 폐수의 유입비율에 따라 피혁 폐수 중에 함유된 총 크롬 농도도 4월과 9월에 각각 32 mg/L와 13 mg/L로 많은 농도 차이를 보였다.
- 0 (2009년 9월)였을 때의 박테리아 생체량 결과를 비교해 보면 Eubacteria와 total bacteria의 생체량은 4월에 비해 9월의 경우가 약 3배 이상 높게 나타나 유입수 중의 피혁 폐수 비율이 생물학적 처리조내 박테리아들의 생체량에 많은 영향을 미치는 것으로 나타났다. 생물학적 처리조 별로 보면 Tank 1 (T1)과 Tank 2 (T2)에서 보다 Tank 3 (T3)에서 Eubacteriat/total bacteria 비율이 감소하는 것으로 보아 Tank 3 (T3)에서 탈질 관련 Eubacteria 이외의 여러 균들이 다수 존재한 것으로 판단된다. BOD/T-N의 비율은 4월에 1.
- 생물학적 폐수처리 공정으로 유입되는 유량은 평균 5,000톤/일 정도였고, Table 1에 실험기간 중의 혼합 폐수의 성상을 나타내었다. 실험 기간 동안 유입되는 혼합 폐수의 pH는 7.9~8.2의 범위로 나타났고, BOD와 COD의 농도는 각각 376~524 mg/L 및 500~555 mg/L로서 COD 구성물질 중에서 BOD가 차지하는 비율은 68~91%의 범위로 나타났다. T-N과 T-P의 경우는 각각 353~371 mg/L 및 25~31 mg/L의 범위로 나타났다.
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