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문제 정의
- 본 연구에서는 비누풀 (S. officinalis L.)의 전처리 방법을 변형하여, 사포닌 함량이 높은 공정을 확인하였으며, 유화력, 기포력 및 염증억제작용 측정을 통하여 천연 계면활성제로서 화장품 소재 개발 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 NO 생성 억제효과를 살펴보기 위해서 NO 생성을 억제하는 물질로 대표적으로 알려진 L-NMMA 를 처리하여 대조군으로 사용하여 측정한 결과는 Fig. 5와 같다.
- NO 생성 대조군인 L-NMMA 를 10 µg/mL의 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해 효능을 비교하였다.
- 0 mL/min를 사용하였다. Tea saponin 분석조건은 상기와 동일하며 methanol과 acetonitrile 7:3 (V/V) 혼합액을 이동상으로 하여 분석하였다 [4].
- 거품력 (forming force)은 Ross-Miles 시험방법 [5]을 변형하여 평가하였다. 각 시료 5% 수용액 200 mL을 magnetic stirrer를 이용하여 10분간 교반한 뒤, homogenizer를 이용하여 20초 또는 shaking한 후 glass cylinder 를 이용하여 거품의 양을 측정하여 3회의 측정값 평균을 구하여 측정하였다.
- 거품 유지력 (forming stability)은 상기와 동일한 방법으로 거품이 일어나는 시점에서 수용액 윗부분부터 거품 양을 측정하였으며 10분 간격으로 60분간 거품 유지력을 측정하였다 [6].
- 거품 유지력은 10분 간격으로 60분 간 관찰하여 시료의 거품 높이를 측정하여 수치화하였다.
- 거품력 (forming force)은 Ross-Miles 시험방법 [5]을 변형하여 평가하였다. 각 시료 5% 수용액 200 mL을 magnetic stirrer를 이용하여 10분간 교반한 뒤, homogenizer를 이용하여 20초 또는 shaking한 후 glass cylinder 를 이용하여 거품의 양을 측정하여 3회의 측정값 평균을 구하여 측정하였다.
- 비누풀 잎 전처리 과정을 변형하여 2가지 방법으로 추출을 시행하였다. 건조된 비누풀 잎은 분쇄기를 이용하여 200 mesh 정도로 작게 분쇄한 다음 50% 에탄올로 45℃에서 3시간 침지, 1회 추출하였다. 내용물은 200 mesh에 1차 여과를 한 후, 10,000×g 속도로 원심분리를 한 후 filter (Adventec 5A) 하였다.
- 따라서 비누풀 증기 잎 추출물을 이용한 활성 측정 시 세포생존율에 영향을 주지 않은 1000 µg/mL 이하의 농도 범위에서 진행하였다.
- 비누풀 건잎 추출물, 비누풀 증기잎 추출물을 기준으로 천연계면활성제로 알려진 quillaja saponin, tea saponin과 비교하였으며, 화장품에 사용되는 계면활성제인 tween 20을 비교하였다.
- 비누풀 잎 전처리 과정을 변형하여 2가지 방법으로 추출을 시행하였다. 건조된 비누풀 잎은 분쇄기를 이용하여 200 mesh 정도로 작게 분쇄한 다음 50% 에탄올로 45℃에서 3시간 침지, 1회 추출하였다.
- 비누풀 잎 추출물에 대한 HPLC 분석은 대조군으로 사포닌 함량이 다량 함유되어 있는 quillaja saponin, tea saponin과 비교하였다.
- 세포독성은 MTT 시약을 이용하여 세포생존율을 측정하는 Mosmann의 방법 [8]을 변형하여 측정하였다. RAW 264.
- 7 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양을 위한 DMEM 배지에 10% FBS, 1% penicillinstreptomycin을 첨가하여 37℃, 5%, CO2 조건 하에서 배양하였다.
- 용해성은 측정 용액을 1% 농도로 각종 유기용매에 소량씩 첨가하여 강하게 교반한 후 용해 정도를 육안으로 확인하였다.
- MTT 용액 (5 µg/mL)을 첨가하고 4시간 동안 환원반응을 유도한 후 formazan 결정을 용해하기 위하여 배양액을 제거하고 200 µL의 DMSO를 첨가하였다. 이를 micro plate reader 를 이용하여 565 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포만 배양한 대조군을 기준으로 처리군의 세포생존도 (%)를 계산하였다.
- 45 µm)한 다음 rotary evarporator을 이용하여 농축하였다. 전처리 과정을 변형한 비누풀 잎은 증기에 1회 쪄서 말린 것을 상기와 같은 방법으로 추출하여 사포닌 추출 및 정제 과정을 거쳤으며, 비누풀잎 추출물의 성분 분석을 위해 HPLC 를 이용하여 분석하였다. Quillaja saponin 분석조건은 C18 CapcellPAK UG 120 (4.
대상 데이터
- 세포배양에 사용된 Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), penicillin-streptomycin 및 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하 였으며, 배양용기는 Falcon (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 제품을 사용하였다. Lipopolysaccharide (LPS), 3-(4,5-dimethy-2-thiazolyl )-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), DMSO, 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), vitamin C, L-NMMA, Griess reagent는 Sigma-aldrich사 (St. Louis, Mo, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 시료의 분리 및 분석을 위한 column은 Shiseido (Japan)에서 HPLC 분석을 위한 quillaja saponin은 Sigma-Aldrich사, tea saponin은 Biolnad사 (Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 6 mm × 250 mm, 5 µm, Shiseido) column을 이용하였으며 아래과 같은 조건으로 수행하였다. 검출기는 Waters 996 / photodiode array detector (203 nm)를 사용하였다. Quillaja saponin 분석의 methanol solvent 농도는 0~5 min : 20%, 5~30 min :60%, 100%로 증가시켰으며 유량은 1.
- 본 실험에 사용한 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양을 위한 DMEM 배지에 10% FBS, 1% penicillinstreptomycin을 첨가하여 37℃, 5%, CO2 조건 하에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 비누풀 (S. officinalis L.)은 수원 하광교 65-1, 한마음 농장과 전남 장성군 남면 분향리 1083-6 학사농장에서 재배하여 사용하였다. 건조과정을 거친 비누풀 잎을 분쇄하여 50% 에탄올로 추출 및 감압농축하여 사용하였다.
- 세포배양에 사용된 Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), penicillin-streptomycin 및 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하 였으며, 배양용기는 Falcon (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 제품을 사용하였다.
- Louis, Mo, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 시료의 분리 및 분석을 위한 column은 Shiseido (Japan)에서 HPLC 분석을 위한 quillaja saponin은 Sigma-Aldrich사, tea saponin은 Biolnad사 (Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성은 Student's t-test로 하였으며 P 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
성능/효과
- 10-1000 µg/mL의 농도에서 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않았으며, NO 생성량을 농도 의존적으로 억제하는 것을 보여주었다.
- HPLC spot에서 대조군인 quillaja saponin은 10분에서 12분 사이 큰 peak를 확인할 수 있으며 tea saponin은 2분에서 3분 사이에 큰 peak를 확인할 수 있었다 (Fig. 1, 2).
- 각 시료의 거품 유지력은 시간이 흐를수록 거품이 줄어드는 경향을 나타내고 있으나, quillaja saponin, tea saponin, Tween 20 과 유사한 차이의 거품 유지력을 나타내었다.
- 거품 조밀도는 비누풀 증기 잎 추출물 > tea saponin > quillaja saponin 순으로 비누풀 증기 잎 추출물이 quillaja saponin, tea saponin보다 우수한 조밀도를 확인하였다.
- 거품의 높이를 수치화하여 비누풀 건잎 추출물은 28 mm, 비누풀 증기 잎 추출물은 76 mm이며 quillaja saponin, tea saponin 및 tween 20의 거품 높이는 70 mm, 68 mm, 80 mm로 나타났다.
- 13 µM의 NO 생성 저해능을 나타내었다. 따라서 비누풀 증기 잎 추출물은 LPS 에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 NO의 생성을 농도 의존적이고 유의적으로 감소시키는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구결과 비누풀 잎 추출물은 화장품용으로 거품력이 우수하나 유화력은 약하게 나타났으며, 추출물에 의한 세포 독성이 없는 농도에서 농도 의존적으로 NO 생성 억제를 확인하였다.
- 본 연구에서 비누풀 잎 추출물 전처리 과정을 변형하여 사포닌 함량을 높이고 계면활성제 성분을 효과적으로 추출할 수 있었다.
- 비누풀 건잎 추출물과 비누풀 증기 잎 추출물의 사포닌 함량 (quillaja saponin, tea saponin)을 비교한 결과 비누풀 증기잎 추출물의 사포닌 함량이 비누풀 건잎 추출물보다 약 3배 높았다 (Table 1).
- 비누풀 건잎, 증기 잎 추출물의 용해도를 비교한 결과, 물에서 용해가 잘 되었고, 메탄올, 에탄올에서는 용해는 되었으나 성상이 탁하였으며, 클로로포름, 디클로로메탄, 부탄올, 헥산에서는 용해가 되지 않았다. 에틸아세테이트에서는 분산되어 있는 상태였다.
- 비누풀 증기 잎 추출물은 화장품에 유상으로 사용되는 olive oil, 현미유에 대해서 약한 유화 활성을 나타내었다.
- 비누풀 증기 잎 추출물을 농도별로 10, 100, 500, 및 1000 µg/mL로 24시간 처리한 결과 세포 생존율이 90% 이상으로 대조군과 비교했을 시 독성이 거의 나타나지 않았다.
- 비누풀 증기 잎 추출물의 유화활성은 Table 3 나타났으며, 유화활성은 olive oil, 현미유, Tween 20의 유화 활성을 비교한 결과 유화 활성은 100%를 기준으로 했을 시, Tween 20은 80%, 비누풀 증기 잎 추출물은 77%를 나타내었다.
- 위의 실험결과로부터 비누풀 건잎, 증기 잎 추출물의 용해도는 극성이 높은 용매에서 친수성이 강한 상태임을 확인하였다 (Table 2).
- 천연계면활성제로 알려져 있는 quillaja saponin, tea saponin과 비교하여 사포닌 함량을 측정한 결과 비누풀 증기 잎 추출물이 비누풀 건잎 추출물에 비해 약 3배 높은 함량을 나타내었고, tea saponin의 경우 대조군으로 사용한 tea saponin peak 외에 두 가지 성분을 포함하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 전처리를 변형한 비누풀 잎 증기 추출물은 화장품 소재로서 거품력이 좋은 세제류 및 워시 타입용으로써 사용가능성이 보여지며, 추후 임상과 관련 더 많은 연구가 이루어져야 할 것이다.
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