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문제 정의
- 그래서 당귀가 함유된 복합추출물을 제조하기 위해서는 제조비용이 높은 동결건조나 초임계추출11)을 하여야 한다. 그래서 제조비용이 낮으면서 효능과 성분이 동등한 분무건조 추출분말 제조방법을 연구하기 위하여 중국당귀, 가시오가피, 황금으로 구성된 복합추출물인 HT008을 동결건조법과 분무건조법으로 제조하였을 때 성분과 효능의 동등성이 있는지를 비교 관찰하고자 하였다.
- 한약건조추출물의 제조방법에 따른 성분함량과 효능을 비교하기 위하여 항염 효능이 알려진 HT008의 동결건조추출물, 당귀환류추출 후 분무건조추출물 및 당귀초임계추출 후 분무건조추출물의 지표성분 함량을 정량하고 효능을 비교 실험하였다. 본 연구는 연구팀의 파악에 의하면 한약복합물의 제조방법에 따른 성분함량과 약리효능을 동시에 비교한 최초의 논문이다.
제안 방법
- 2 mL/10 g로 복강 내 주사하고, 주사 10분 후부터 10분간의 신전반응(복벽의 수축과 뒷다리의 신전에 따른 골반의 회전으로 이루어지는 뒤틀림 반응)의 횟수를 계측하였으며 모든 실험동물은 실험이 진행되는 암실에서 3시간 이상 적응시킨 후 실험을 진행하였다. HT008 FD, HT008 SD 및 HT008 SF를 300 mg/kg 농도로 경구투여 하였으며, 대조군은 2차 증류수를, 양성 대조군은 Ibuprofen 100 mg/kg을 각각 경구투여 하였다. 각 시료는 증류수에 녹인 후 실험이 진행되기 30분 전에 1회 경구투여하였다.
- HT008 동결건조추출물은 항염효능이 연구되어 있으므로12,13) 중국당귀 중 유효성분의 휘발을 방지하기 위하여 초임계추출을 하거나 주정 환류추출한 후 이를 각각 분무건조한 후 황금과 가시오가피와 배합한 HT008 당귀환류추출 후 분무건조추출물 및 당귀초임계추출 후 분무건조추출물을 지표성분 함량, 항염 및 진통효능을 동결건조 추출물과 각각 비교하였다.
- HT008의 당귀환류추출후 분무건조추출물(HT008 SD)은 중국당귀 15.8 kg을 따로 15배수의 70% 알코올로 82±5℃에서 4시간 가온 환류 추출하고, 나머지 가시오가피 81.2 kg, 황금 3 kg를 10배수의 70% 알코올로 82±5℃에서 4시간 가온 환류 추출한 추출액을 감압농축하여 얻은 농축액을 분무건조하고 중국당귀 환류 추출액과 혼합하여 분말을 제조하였다.
- 실험동물은 온도 22±2℃, 습도 55±10%, 조명 시간 12시간 명암 주기(07 : 00-19 : 00) 환경에서 자유롭게 공급된 증류수와 고형사료로 1주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다. ICR 생쥐를 각 군으로 나누고 0.7% acetic acid를 0.2 mL/10 g로 복강 내 주사하고, 주사 10분 후부터 10분간의 신전반응(복벽의 수축과 뒷다리의 신전에 따른 골반의 회전으로 이루어지는 뒤틀림 반응)의 횟수를 계측하였으며 모든 실험동물은 실험이 진행되는 암실에서 3시간 이상 적응시킨 후 실험을 진행하였다. HT008 FD, HT008 SD 및 HT008 SF를 300 mg/kg 농도로 경구투여 하였으며, 대조군은 2차 증류수를, 양성 대조군은 Ibuprofen 100 mg/kg을 각각 경구투여 하였다.
- HT008 FD, HT008 SD 및 HT008 SF를 300 mg/kg 농도로 경구투여 하였으며, 대조군은 2차 증류수를, 양성 대조군은 Ibuprofen 100 mg/kg을 각각 경구투여 하였다. 각 시료는 증류수에 녹인 후 실험이 진행되기 30분 전에 1회 경구투여하였다.
- 각 추출물의 HPLC 패턴 분석 및 구성약재의 지표성분 eleutheroside E (Chromadex, USA), baicalin (Waco, Japan), z-ligustilide (Waco, Japan)를 정량하기 위하여 HPLC 이동상으로 1% Phosphoric acid (A)와 Acetonitrile (B)을 사용하여 분석시간 0-60분간 5-50%의 B로 농도구배로 진행 후, 80분까지 이동상B를 70%로 증가시키고 이어 5분간 5%로 유지하였다. 용매 유속은 1 mL/min, 시료 주입량 10 ㎕, Column oven 온도는 40℃로 유지하였다.
- 5시간에서 2회 반복 측정한 발의 평균 부피이다. 급성 관절염 유발 약물을 주입하기 전에 모든 실험동물은 예비실험과정을 거쳐 측정기구에 적응하도록 하였다. 모든 실험동물은 실험이 진행되는 암실에서 1시간 이상 적응시킨 후 실험을 진행하였다.
- 당귀초임계추출 후 분무건조추출물(HT008 SF)은 HT008 구성약재 중 중국당귀 15.8 kg을 액체펌프, 가열장치를 이용하여 가압, 가열시킨 초임계 이산화탄소를 이용하여 중국당귀를 초임계 추출하였다. 초임계 추출시간은 2시간, 사용된 이산화탄소의 유량은 40 L/h, 초임계 추출온도는 45℃, 압력은 25 MPa 조건이다.
- 급성 관절염 유발 약물을 주입하기 전에 모든 실험동물은 예비실험과정을 거쳐 측정기구에 적응하도록 하였다. 모든 실험동물은 실험이 진행되는 암실에서 1시간 이상 적응시킨 후 실험을 진행하였다. 시료는 증류수에 녹인 후 실험이 진행되기 30분 전에 1회 경구투여하였다.
- 부종 측정은 Plethysmometer (7140, UGO, Italy)를 사용하였으며, 1% λ-carrageenan 투여 전과 투여 후 0.5, 1.5, 3.5 및 5.5시간에 각각 흰쥐 오른발의 부피를 1마리 당 2회 반복 측정하여 평균값으로 정하였다(Fig. 2).
- 부종율(Edema rate %)은 1% λ-carrageenan 주사 후, 각 시간대의 흰쥐 발 부피 변화를 측정하여 다음 식으로 부종 증가율(%)을 산출하였다.
- HT008 FD, HT008 SD 및 HT008 SF를 300 mg/kg 농도로 경구투여 하였으며, 대조군은 2차 증류수를, 양성 대조군은 Ibuprofen 100 mg/kg을 각각 경구투여 하였다. 각 시료는 증류수에 녹인 후 실험이 진행되기 30분 전에 1회 경구투여하였다.
- 실험동물에 급성 관절염을 유발하기 위하여 흰쥐의 오른쪽 발바닥에 생리 식염수로 용해시킨 1% λ-carrageenan (Sigma Chemical, USA) 50㎕ 를 0.5 cc 인슐린 주사기를 사용하여 주입하였다.
- 실험동물은 2차 증류수를 투여한 대조군, Ibuprofen 100 mg/kg를 투여한 양성 대조군 및 HT008을 투여한 실험군으로 나누어, 1% λ-carrageenan 을 주입 30분 전에 존대를 이용하여 경구투여 하였다.
- 초임계 추출한 당귀 잔사와 가시오가피 81.2 kg, 황금 3 kg 을 10배수의 70% 알코올로 82±5℃에서 4시간 씩 2회 가온 환류 추출, 감압농축하여 얻은 농축액을 분무건조하고 당귀 초임계 추출액과 혼합하여 분말을 제조하였다.
- 한약건조추출물의 제조방법에 따른 성분함량과 효능을 비교하기 위하여 항염 효능이 알려진 HT008의 동결건조추출물 (HT008 FD), 당귀환류추출 후 분무건조추출물 (HT008 SD), 당귀초임계추출 후 분무건조추출물 (HT008 SF)을 제조하여 지표성분 함량을 정량하고 효능을 비교 실험한 결과 다음과 같았다.
- 한약건조추출물의 제조방법에 따른 성분함량과 효능을 비교하기 위하여 항염 효능이 알려진 HT008의 동결건조추출물, 당귀환류추출 후 분무건조추출물 및 당귀초임계추출 후 분무건조추출물의 지표성분 함량을 정량하고 효능을 비교 실험하였다. 본 연구는 연구팀의 파악에 의하면 한약복합물의 제조방법에 따른 성분함량과 약리효능을 동시에 비교한 최초의 논문이다.
대상 데이터
- HPLC system은 Water 1525 binary Pump, Column oven, 2707 autosampler, 2998 PDA detector를 사용하였고 각 성분분리를 위한 컬럼은 Sunfire™ C18, particle size 5 ㎛, 4.6× 250 ㎜ I.D (Waters, Ireland) 을 사용하였다.
- HT008의 동결건조 추출물(HT008 FD)은 가시오가피 81.2 kg, 중국당귀 15.8 kg, 황금 3.0 kg 를 10배수의 70% 알코올(주정)로 82±5℃에서 4시간 씩 2회 가온 환류 추출한 후 감압농축하여 농축액을 동결건조하여 분말을 제조하였다.
- 0 kg 를 10배수의 70% 알코올(주정)로 82±5℃에서 4시간 씩 2회 가온 환류 추출한 후 감압농축하여 농축액을 동결건조하여 분말을 제조하였다. 가시오가피Eleutherococcus senticosus, 중국당귀Angelica sinensis, 황금Scutellaria baicalensis은 각각 경동시장 약수당 약업사에서 구입한 한국 철원산, 중국 감숙성, 중국 감숙성 산으로 경희대학교 한의과대학 본초학교실에서 검증받아(Voucher No. FE060041, FE012070, FE114022) 사용하였다.
- 생후 3주령(체중 100-120 g) 수컷 Sprague Dawley계 흰쥐를 생쥐와 동일한 환경으로 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물에 급성 관절염을 유발하기 위하여 흰쥐의 오른쪽 발바닥에 생리 식염수로 용해시킨 1% λ-carrageenan (Sigma Chemical, USA) 50㎕ 를 0.
- 생후 5주령(체중 25-33 g) 수컷 ICR계 생쥐를 (주)샘타코(Osan, Korea)에서 공급받아 실험동물로 사용하였다. 실험동물은 온도 22±2℃, 습도 55±10%, 조명 시간 12시간 명암 주기(07 : 00-19 : 00) 환경에서 자유롭게 공급된 증류수와 고형사료로 1주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 온도 22±2℃, 습도 55±10%, 조명 시간 12시간 명암 주기(07 : 00-19 : 00) 환경에서 자유롭게 공급된 증류수와 고형사료로 1주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 결과 통계처리는 평균±표준편차로 나타내었으며, 평균치 간이 유의성은 Student’s t-test 를 이용한 후 p값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
성능/효과
- 1% λ-carrageenan을 흰쥐 오른쪽 발바닥에 주입하고 0.5, 1.5, 3.5, 5.5시간 후 paw edema를 측정한 결과 대조군의 경우 각각 16.5±6.3, 23.4±6.4, 16.0±3.2, 12.4±3.3%의 부종 증가율이 나타났다.
- 1. 지표성분 eleutheroside E, baicalin, z-ligustilide을 정량한 결과, 분무건조시 휘발되는 z-ligustilide 함량이 HT008 SD와 HT008 SF에서 동결건조 대비 감소 하지 않았으며 HT008 SD와 SF 간에 유의한 차이가 없었다. 이는 중국당귀의 별도 추출을 통해 휘발성 성분손실을 방지할 수 있으며 중국당귀의 환류추출과 초임계추출 간의 성분함량에 유의한 차이가 없음을 의미한다.
- 2. HT008 FD, SD, SF을 투여한 후 acetic acid가 유발한 신전반응을 측정한 결과, 3군 모두에서 대조군 대비 유의한 신전반응 억제 효능이 나타났다. 이는 HT008 FD, SD, SF 모두 급성염증에서 진통효능을 갖는다는 것을 의미한다.
- 3. HT008 FD, SD, SF을 투여한 후 λ-carrageenan이 유발한 신전반응을 측정한 결과, 3군 모두에서 1.5시간 째에 대조군 대비 유의한 부종감소 효능이 나타났다.
- 3가지 제조방법의 HT008을 300 mg/kg 용량으로 경구투여하고 30분 후에 acetic acid를 복강주사하여 신전반응 횟수를 측정한 결과, 2차 증류수를 투여한 대조군은 38.9±3.5회였으며, Ibuprofen 100 mg/kg을 투여한 양성대조군은 18.9±2.5회로 나타나, 대조군에 비해 유의한 통증억제 효과가 나타났다.
- HT008 FD 300 mg/kg 투여군은 각각 14.1±6.5, 16.0±2.4, 14.4±6.1, 12.1±6.2%의 부종 증가율을 보였고 1.5시간째 대조군 대비 유의하게(p<0.05) 부종을 억제하였다.
- HT008 FD, SD, SF 300 mg/kg 투여군의 경우 각각 26.5±2.5, 27.0±1.4, 25.0±2.9회로 나타나 3가지 제조방법 모두에서 대조군 대비 유의한 통증억제 효능이 나타났으며 군간에는 유의한 차이가 없었다(Fig. 2).
- HT008 FD, SD, SF을 300 mg/kg 용량으로 경구투여한 후 acetic acid를 주사하고 신전반응을 측정한 결과 대조군은 38.9±3.5회인데 반해 HT008 FD, SD, SF군은 각각 26.5±2.5, 27.0±1.4, 25.0±2.9회로 나타나 3가지 제조방법 모두에서 대조군 대비 유의한 신전반응의 억제 효능이 나타났다.
- HT008 FD, SD, SF의 지표성분 eleutheroside E, baicalin, z-ligustilide을 정량한 결과 선행연구에서 HT008을 분무건조하였을 때 중국당귀의 휘발성성분인 z-ligustilide 함량이약 46% 감소하는데 반해 본 연구에서는 HT008 SD와 HT008 SF의 z-ligustilide 성분함량이 HT008 FD보다 감소하지 않았으며 HT008 SD와 SF 간에는 유의한 차이가 없었다. 이는 중국당귀의 별도 추출을 통해 휘발성 성분손실을 방지할 수 있으며 중국당귀의 환류추출과 초임계추출 간의 성분함량에 유의한 차이가 없음을 의미한다.
- HT008 SD 투여군은 각각 7.9±3.0, 11.8±3.3, 9.8±4.1, 7.1±2.1%의 부종 증가율을 보여 매 측정시마다 대조군 대비 유의한 부종억제 효과(p<0.05)가 나타났고 1.5시간째에 대조군 대비 통계적인 유의성이 가장 높았다 (p<0.01).
- HT008 SF 300 mg/kg 투여군은 각각 8.0±3.7, 14.2±5.9, 13.3±1.6, 8.4±4.1%의 부종 증가율을 보였고 0.5, 1.5, 3.5시간째 대조군 대비 유의하게(p<0.05) 부종을 억제하였다 (Fig. 3, Table 2).
- HT008 각 시료별 HPLC 패턴분석 결과는 Fig. 1과 같으며 구성약재의 지표성분의 최적 검출파장에서 머무름 시간은 각각 eleutheroside E가 22분대, baicalin가 35분대, z-ligustilide가 65분대이었다.
- 21%로 적합하였다. HT008의 3가지 추출물 모두 구성약재의 각 원물 중 지표성분함량이 보고된 기준범위 내에서 일정한 규격으로 나타났으며 배합비율에 따른 지표성분의 함량 또한 일정한 규격으로 확인되었다.
- 결론적으로 HT008 FD, SD, SF 모두 대조군 대비 유의하게 통증과 관절부종을 억제하였으며 지표성분 함량 기준에 적합하였다. 이를 통해 중국당귀는 환류추출과 초임계추출 간에 성분함량과 약리효능에 유의한 차이가 없다는 것을 알 수 있으며, 휘발성성분을 함유하는 한약재는 별도로 추출하여 배합하는 방법으로 분무건조 시 발생하는 성분손실을 방지할 수 있을 것으로 생각된다.
- 반면 Ibuprofen 100 mg/kg를 경구투여한 양성대조군은 0.5, 1.5, 3.5, 5.5시간 후 각각 8.1±3.7, 9.5±5.8, 5.9±4.5, 2.5±2.8%의 부종 증가율을 보여 매 측정시마다 대조군 대비 유의한 부종억제 효과가 나타났다.
- 본 실험에서 HT008 FD, SD, SF 을 투여한 후 λ-carrageenan이 유발한 paw edema를 측정한 결과, 3군 모두에서 부종부피를 줄이는 효능이 나타났으며 특히 3군 모두에서 1.5시간째에 대조군 대비 유의한 부종감소 효능이 나타났다.
- 하는 등 3가지 지표성분 모두 관절염의 주요 타겟기전인 항염증, 항산화, 진통 효능을 갖는 유효성분으로 알려져 있다. 본 실험에서 지표성분 함량이 모두 기준범위에 적합하다는 것은 휘발성인 z-ligustilide를 비롯한 효능성분의 손실이 나타나지 않았다는 것이므로 항염증 약리효능을 일정하게 유지시킬 것을 의미한다.
- Acetic acid 동물모델은 복강 내 급성염증을 유발하는 모델로 초산이 유발한 염증이 통증유발인자의 유리를 일으켜서 복부의 수축반응 신전반응을 나타나게 하며, 이 신전반응 횟수를 억제하는 시료는 급성염증에서 prostaglandin 생합성을 억제하여 중추성 혹은 말초성 진통 효능을 갖는 것으로 알려져 있다21,22). 본 연구에서 3가지 HT008 추출물이 모두 acetic acid 모델에서 신전반응을 억제하였던 것은 HT008 FD, SD, SF가 모두 급성염증에서 prostaglandin 생합성을 억제하여 진통효능을 갖는다는 것을 의미한다. 또한 이는 HT008이 염증촉진인자 TNF-α, IL-6, PGE2를 억제하고 항염증인자 prostaglandin D2를 증가시킨다는 이전의 연구와 일관된 결과이다12).
- 분석방법에 따라 각 시료를 분석한 결과 eleutheroside E, baicalin, z-ligustilide 각각의 함량은 HT008 FD은 1.70±0.06 mg/g, 31.63±1.17 mg/g, 2.47±0.02 mg/g 이며, HT008 SD은 1.28±0.04 mg/g, 26.94±0.17 mg/g, 4.18±0.02 mg/g이고, HT008 SD 는 1.23±0.03 mg/g, 26.93±0.43 mg/g, 4.24±0.03 mg/g이었으며 환류추출과 초임계추출에 따른 z-ligustilide 성분함량의 유의한 차이는 없었다(Table 1).
- 결론적으로 HT008 FD, SD, SF 모두 대조군 대비 유의하게 통증과 관절부종을 억제하였으며 지표성분 함량 기준에 적합하였다. 이를 통해 중국당귀는 환류추출과 초임계추출 간에 성분함량과 약리효능에 유의한 차이가 없다는 것을 알 수 있으며, 휘발성성분을 함유하는 한약재는 별도로 추출하여 배합하는 방법으로 분무건조 시 발생하는 성분손실을 방지할 수 있을 것으로 생각된다.
- 정량한 지표성분 3종의 성분함량을 기준으로 수율과 배합비를 역산하여 대한약전14)에 기재된 지표성분 함량과 비교하였을 때 황금은 원재료 대비하여 baicalin 9.2%가 함유되어 대한약전 기준에 적합하였다. 가시오가피의 경우 eleutheroside E를 0.
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