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문제 정의
- 1 주일 이상 영양배지 내에서 활성화된 벤토나이트 현탁액으로부터 일부 용액을 추출하여 미생물의 존재 여부 및 종류를 파악하고자 하였다. 일차 추출된 용액을 다시 순수하게 배양한 후 미생물의 유전자 분석을 실시하였고, 미생물의 DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 16S rRNA 분석을 실시하였다.
- 국내 방사성폐기물처분장의 완충재로 사용되는 벤토나이트에 대한 기존의 물성, 광물학적 및 화학적 특성 외에 별도로 생물학적 특성을 조사하였다. 본 연구에서는 국내 산출 경주벤토나이트를 대상으로 자생미생물이 생존하고 있는지의 여부 및 종류를 파악하는 기초실험을 수행하였다. 이를 위해 자연산 벤토나이트 분말을 현탁액으로 만들어 환원조건에서 오랫동안 숙성시킨 결과 벤토나이트 및 수용액에서의 색상 변화를 관찰할 수 있었다.
- 본 연구에서는 국내 처분장 완충재로 고려되고 있는 국내산 벤토나이트에 대해서 생물학적 활성 및 변질 특성 등을 조사하고, 그에 따른 환경적 의미를 고찰하였다. 이를 통해 얻은 국내 벤토나이트 완충재에 대한 생물학적 연구 자료는 향후 방사성폐기물 지하처분 설계 및 안전성평가 등에 있어서 중요한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
제안 방법
- DGGE를 분석하기 위하여 DGGE-PCR 산물 10 μl를 20V로 10분간 pre-running 후 250V로 8 시간 전기영동을 실시하였다.
- 경주벤토나이트의 자생박테리아 동정을 위해 배양된 미생물의 DNA를 추출하여 16S rRNA 분석을 실시하였다. DNA 추출을 위해 각 영양배지 배양액으로부터 10ml의 용액 시료를 채취 및 원심분리 후, MoBio사의 Soil genomic DNA extraction kit를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 0.
- PCR은 95°C에서 5 분간 초기 변성화시킨 후 95°C에서 30 초간 denaturing, 55°C 에서 30 초간 annealing시킨 후 72°C에서 30 초간 extension 과정을 35회 반복하였고, 72°C에서 5 분간 최종 extension을 실시하였다.
- 경주벤토나이트의 자생박테리아 동정을 위해 배양된 미생물의 DNA를 추출하여 16S rRNA 분석을 실시하였다. DNA 추출을 위해 각 영양배지 배양액으로부터 10ml의 용액 시료를 채취 및 원심분리 후, MoBio사의 Soil genomic DNA extraction kit를 이용하여 DNA를 추출하였다.
- 국내 방사성폐기물처분장의 완충재로 사용되는 벤토나이트에 대한 기존의 물성, 광물학적 및 화학적 특성 외에 별도로 생물학적 특성을 조사하였다. 본 연구에서는 국내 산출 경주벤토나이트를 대상으로 자생미생물이 생존하고 있는지의 여부 및 종류를 파악하는 기초실험을 수행하였다.
- 2). 그리고, 다른 미생물에 의한 오염을 막기 위해 무균실험대(clean bench)에서 모든 작업을 수행하였다.
- 일정 시간(대략 일주일)이 경과한 후, 벤토나이트로부터 1차 배양된 현탁액을 주사기를 이용하여 일정량 추출하고 다시 새롭게 농화(enrichment) 배양하는 과정을 계속적으로 5번 이상 반복하였다. 모든 실험은 무균실험대에서 수행하였고 실험에 사용된 세럼병은 사전에 압엽멸균기(JISICO)로 121℃, 15분 멸균처리하였으며, 각종 시약 주입시 0.2 ㎛ 필터를 사용함으로써 외부미생물에 의한 오염 가능성을 차단하였다.
- 미생물군집을 분석하기 위해 가스크래마토그래피(GC) clamp가 붙은 518F와 786R primer set을 사용하여 미생물의 16S rRNA gene을 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)으로 증폭하여 변성 구배 젤 전기 영동(DGGE; denaturing gradient gel electrophoresis)을 실시하였다. PCR은 95°C에서 5 분간 초기 변성화시킨 후 95°C에서 30 초간 denaturing, 55°C 에서 30 초간 annealing시킨 후 72°C에서 30 초간 extension 과정을 35회 반복하였고, 72°C에서 5 분간 최종 extension을 실시하였다.
- 미생물의 DNA 추출 및 분석과정은 충북대학교 미생물학과 환경미생물학 연구실의 장비를 이용하고 일반 분석절차를 따라 수행하였다.
- 잘라낸 밴드로부터 sequence를 분석하기 위하여 DGGE-PCR 반응에 사용한 518F, 786R primer set을 사용하였다. 밴드에서 녹여낸 DNA의 16S rRNA를 PCR로 증폭하였다. PCR 증폭은 앞서 수행한 방법과 동일하게 수행하였다.
- 벤토나이트 시료가 생물학적 활성을 가지고 있는지 알아보기 위해 미생물 영양배지(nutrient media)를 만들어 준비된 벤토나이트 현탁액과 반응시켰다. 영양배지는 두 가지 종류(SRB 및 IRB)로 만들었는데, 구체적인 조성은 오종민 외(2010)의 논문에 기술되어 있다 [14].
- 영양배지는 두 가지 종류(SRB 및 IRB)로 만들었는데, 구체적인 조성은 오종민 외(2010)의 논문에 기술되어 있다 [14]. 본 연구에서는 벤토나이트의 생물학적 활성도를 높이기 위해 기본 영양배지 성분 외에 SRB의 경우 5% Fe(Ⅱ) ammonium sulfate 6 ml를 추가로 넣어주었다. IRB의 경우에는 기본 영양배지에 Fe(Ⅲ)-citrate 15 mM과 sodium lactate 25 mM을 추가하였다.
- 분말 상태의 경주벤토나이트를 물과 혼합하여 현탁액을 만든 후 영양배지에서 시간이 경과함에 따라 변화되는 벤토나이트의 특징을 관찰하였다. 초기 옅은 노란색을 띠던 용액이 점차 무색으로 변하였고, SRB 영양배지의 경우 약 7일 이후에는 완전히 검은색으로 변하였다(Fig.
- 벤토나이트 자생미생물(indigenous bacteria) 활성화 실험을 위해 IRB 혹은 SRB 영양배지가 담긴 100 ml 세럼병에 준비된 벤토나이트 현탁액을 10 ml씩 넣고 항온기에서 30℃ 조건으로 숙성시켰다. 일정 시간(대략 일주일)이 경과한 후, 벤토나이트로부터 1차 배양된 현탁액을 주사기를 이용하여 일정량 추출하고 다시 새롭게 농화(enrichment) 배양하는 과정을 계속적으로 5번 이상 반복하였다. 모든 실험은 무균실험대에서 수행하였고 실험에 사용된 세럼병은 사전에 압엽멸균기(JISICO)로 121℃, 15분 멸균처리하였으며, 각종 시약 주입시 0.
- 1 주일 이상 영양배지 내에서 활성화된 벤토나이트 현탁액으로부터 일부 용액을 추출하여 미생물의 존재 여부 및 종류를 파악하고자 하였다. 일차 추출된 용액을 다시 순수하게 배양한 후 미생물의 유전자 분석을 실시하였고, 미생물의 DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 16S rRNA 분석을 실시하였다. PCR-DGGE로부터 염기서열을 이용하여 SRB 영양염류 조건의 미생물 계통수를 분석한 결과 1, 2, 3, 4번이 우세한 것으로 나타났다(Fig.
- DGGE를 분석하기 위하여 DGGE-PCR 산물 10 μl를 20V로 10분간 pre-running 후 250V로 8 시간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, SYBR green으로 염색하여 관찰하였다. 확인된 총 4개의 밴드를 잘라서 0.
대상 데이터
- 시료 준비는 벤토나이트 분말과 멸균된 3차 증류수를 고액비(solid/solution ratio)를 달리하여 섞어 하루정도 교반시키고 125 ml 세럼병(serum bottle)에 옮겨 담은 후, 준비된 벤토나이트 현탁액(bentonite slurry)의 용존산소를 제거할 목적으로 순수 질소가스(N2 gas, >99.9%)로 40분 이상 purging하였다(Fig. 2).
- 실험에 사용된 벤토나이트는 경주시 양남면 벤토나이트 광산에서 채취한 것으로써, 과거 본 연구원에서 다양한 압축벤토나이트 제조, 물성 측정 및 핵종 확산 실험 등을 수행했던 것과 동일한 벤토나이트이다 [3,6,13]. 본 논문에서 우리는 이 벤토나이트를 이후 “경주벤토나이트”라 칭한다.
- 1X Tris-EDTA 버퍼에 담근 후 4℃에서 12 시간 이상 DNA를 녹여냈다. 잘라낸 밴드로부터 sequence를 분석하기 위하여 DGGE-PCR 반응에 사용한 518F, 786R primer set을 사용하였다. 밴드에서 녹여낸 DNA의 16S rRNA를 PCR로 증폭하였다.
성능/효과
- 미생물의 존재 여부를 확인하기 위해 유전자 분석을 실시하였고, 벤토나이트 내에 4 종류 이상의 SRB가 생존하고 있음을 알 수 있었다. IRB 영양배지 조건에서도 미생물에 의한 벤토나이트의 시간적 변화를 관찰하였지만, 확인된 박테리아는 IRB 박테리아가 아닌 다른 종류의 일반 혐기성미생물로 분류되었다. 향후 과제로는 벤토나이트 자생미생물이 처분장의 극한환경 하에서 생존할 수 있는지의 여부 및 추후 발생 가능한 생지화학적 작용 등을 확인 및 검증하는 후속연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 일차 추출된 용액을 다시 순수하게 배양한 후 미생물의 유전자 분석을 실시하였고, 미생물의 DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 16S rRNA 분석을 실시하였다. PCR-DGGE로부터 염기서열을 이용하여 SRB 영양염류 조건의 미생물 계통수를 분석한 결과 1, 2, 3, 4번이 우세한 것으로 나타났다(Fig. 5). 밴드 분석 결과 identity값이 거의 90% 이상의 근연관계를 보이는 4 종류의 미생물 균주들이 확인되었으며, 최종적으로 황산염환원미생물(SRB)로 밝혀졌다(Table 1).
- SRB 영양 배지 조건에서 검은색의 침전물 및 부유물이 생성되었으며 용존황산염이 황화물로 바뀌었다. 미생물의 존재 여부를 확인하기 위해 유전자 분석을 실시하였고, 벤토나이트 내에 4 종류 이상의 SRB가 생존하고 있음을 알 수 있었다. IRB 영양배지 조건에서도 미생물에 의한 벤토나이트의 시간적 변화를 관찰하였지만, 확인된 박테리아는 IRB 박테리아가 아닌 다른 종류의 일반 혐기성미생물로 분류되었다.
- 5). 밴드 분석 결과 identity값이 거의 90% 이상의 근연관계를 보이는 4 종류의 미생물 균주들이 확인되었으며, 최종적으로 황산염환원미생물(SRB)로 밝혀졌다(Table 1). 하지만, IRB 영양염류 조건에서 추출한 미생물들은 철환원미생물(IRB)이 아닌 것으로 확인되었으며, 이는 전혀 다른 종류의 혐기성미생물들이 SRB와 같이 벤토나이트 내에서 공존하고 있는 것으로 생각된다.
- 본 결과로부터 알 수 있는 사실은 국내 경주벤토나이트에는 많은 종류의 미생물들이 고착 및 서식하고 있으며, 특히 황산염환원박테리아가 4 종류 이상 존재한다는 사실을 알 수 있었다. 지금까지 국내 벤토나이트에 SRB 박테리아의 존재 여부를 구체적으로 연구하거나 밝힌 논문은 없었다.
- 초기 반응한 벤토나이트 색은 옅은 회색 빛깔을 나타내었으나 벤토나이트가 생물학적으로 숙성되면서 점점 짙은 회색 혹은 검은색으로 변질되었다. 영양배지의 종류(SRB 혹은 IRB 영양배지)에 따라 벤토나이트 색상 변화가 달랐는데, SRB 영양배지의 경우 벤토나이트 뿐만 아니라 포화용액도 검게 변하였다(Fig. 3). IRB 영양배지의 경우 벤토나이트 일부가 검은색 내지는 짙은 회색빛으로 변하였으나 용액의 색은 옅은 노란색에서 투명한 색으로 바뀌었다(Fig.
- 본 연구에서는 국내 산출 경주벤토나이트를 대상으로 자생미생물이 생존하고 있는지의 여부 및 종류를 파악하는 기초실험을 수행하였다. 이를 위해 자연산 벤토나이트 분말을 현탁액으로 만들어 환원조건에서 오랫동안 숙성시킨 결과 벤토나이트 및 수용액에서의 색상 변화를 관찰할 수 있었다. SRB 영양 배지 조건에서 검은색의 침전물 및 부유물이 생성되었으며 용존황산염이 황화물로 바뀌었다.
- 추출된 DNA는 0.8%(w/v) Agarose gel에서 전기영동을 실시하였고, 추출된 DNA양이 각 샘플 당 10 ng 미만이고 총 DNA양이 1 μg 미만인 것을 확인하였다.
후속연구
- 6 g/cm3) 및 방사선(1Gy/hr)이 있는 극한환경(severe environments)으로 미생물이 생존하기에 쉽지 않은 조건이다. 따라서, 추후 실험을 통해 경주벤토나이트 미생물이 지하처분장과 유사한 환경 조건에서도 생존 가능한지의 여부 및 기타 새로운 반응 특성 등을 구체적으로 밝히는 실험을 계획 중이다.
- 본 연구에서는 국내 처분장 완충재로 고려되고 있는 국내산 벤토나이트에 대해서 생물학적 활성 및 변질 특성 등을 조사하고, 그에 따른 환경적 의미를 고찰하였다. 이를 통해 얻은 국내 벤토나이트 완충재에 대한 생물학적 연구 자료는 향후 방사성폐기물 지하처분 설계 및 안전성평가 등에 있어서 중요한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
- IRB 영양배지 조건에서도 미생물에 의한 벤토나이트의 시간적 변화를 관찰하였지만, 확인된 박테리아는 IRB 박테리아가 아닌 다른 종류의 일반 혐기성미생물로 분류되었다. 향후 과제로는 벤토나이트 자생미생물이 처분장의 극한환경 하에서 생존할 수 있는지의 여부 및 추후 발생 가능한 생지화학적 작용 등을 확인 및 검증하는 후속연구가 필요할 것으로 사료된다.
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