[논문]글루타민 결핍에 따른 Tight Junction 및 MMPs 활성 조절을 통한 전립선 암세포의 침윤 억제 현상

신동역; 최영현

doi:10.3746/jkfn.2013.42.8.1167

[국내논문] 글루타민 결핍에 따른 Tight Junction 및 MMPs 활성 조절을 통한 전립선 암세포의 침윤 억제 현상
Glutamine Deprivation Inhibits Invasion of Human Prostate Carcinoma LnCap Cells through Inactivation of Matrix Metalloproteinases and Modulation of Tight Junctions 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.42 no.8, 2013년, pp.1167 - 1174

신동역 (동남권원자력의학원) , 최영현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실, 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터)

초록
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암세포를 포함한 생체 내 빠른 분열을 요구하는 세포 집단에서 세포 내 구성요소 및 에너지원으로서 글루타민의 요구량이 증대되지만, 종양세포의 글루타민 의존적 대사작용에 관한 기전은 여전히 잘 알려진 바 없다. 본 연구에서는 LnCaP 전립선 암세포의 이동성 및 침윤성에 미치는 글루타민 결핍효능을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 LnCaP 세포에서 글루타민 결핍에 의하여 세포의 이동성 및 세포의 침윤성이 현저하게 억제되었으며, 이러한 이동성 및 침윤성 억제는 TIMPs의 발현 증대에 의한 MMPs의 발현 감소 및 그들의 효소적 활성 저하와 연관성이 있었다. 또한 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포에서 TER의 현저한 증가가 관찰되었는데, 이는 TJs의 조절인자인 claudin family 발현의 차단에 의한 것으로 생각되어진다. 본 연구의 결과에 의하면 암세포의 증식에서 글루타민의 결핍은 TJ의 결합력 증대와 MMPs의 활성을 저하시킴으로써 암세포 전이에 가장 기본적인 과정인 암세포의 이동성과 침윤성을 억제시킬 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Cancer cells exhibit increased demand for glutamine-derived carbons to support anabolic processes. Indeed, the spectrum of glutamine-dependent tumors and the mechanisms through which glutamine supports cancer metabolism remain areas of active investigation. In the present study, we investigated the effects of glutamine deprivation on the correlation between tightening of tight junctions (TJs) and anti-invasive activity in human prostate carcinoma LnCap cells. Glutamine deprivation markedly inhibited cell motility and invasiveness in a time-dependent manner. The anti-invasive activity of glutamine deprivation was associated with an increased tightness of the TJ, which was demonstrated by an increase in transepithelial electrical resistance (TER). The activities of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 were inhibited in a time-dependent fashion by glutamine deprivation, which was correlated with a decrease in expression of their mRNA and proteins and up-regulation of tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) expression. Furthermore, glutamine deprivation repressed the levels of the claudin family members, which are major components of TJs that play a key role in the control and selectivity of paracellular transport. Moreover, the levels of E-cadherin, a type I transmembrane glycoprotein, and snail, an epithelial to mesenchymal transition regulator and zinc finger transcription factor, were markedly modulated by glutamine deprivation. Taken together, these findings suggest that TJs and MMPs are critical targets of glutamine deprivation-induced anti-invasion in human prostate carcinoma LnCap cells.

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문제 정의

따라서 본 연구에서는 글루타민 결핍이 인체 전립선 암세포의 이동성과 침윤성에 미치는 영향을 조사하였으며, 침윤성 억제 효과에 대한 생화학적 기전의 해석을 TJs의 기능과 MMPs의 활성 조절 중심으로 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
본 연구에서는 글루타민 결핍에 의한 암세포의 이동성 및 침윤능의 억제 유발 여부를 인체 전립선 LnCaP 세포에서 조사하였다. 특히 전립선 암세포를 사용한 이유는 다른 종류의 암세포에 비하여 글루타민의 양적 차이에 따른 침윤능의 반응이 다양하며, 글루타민 결핍과 연관된 전립선 암세포증식 억제에서도 전립선 암세포의 종류에 따라 apoptosis 유발 반응이 현저하게 차이가 나기 때문이다(21-23).
그럼에도 불구하고 글루타민 결핍에 따른 전립선 암세포의 증식과 침윤능에 관한 기전 연구는 거의 이루어진 바가 없기 때문에 이에 관한 체계적인 자료의 제시가 절실히 요구되어지고 있다. 따라서 본 연구에서는 글루타민이 결핍된 조건에서 LnCaP 세포의 증식억제 여부를 확인하였으며, 이는 apoptosis 유발 빈도를 의미하는 세포주기 sub-G1기 빈도의 증가와 연관성이 있었다. 아울러 글루타민 결핍 조건에서 생존된 LnCaP 세포의 이동성과 침윤능이 억제되었으며, 이는 TJ의 tightening 증가 및 MMPs 활성 억제와 연관성이 있었다.
암세포를 포함한 생체 내 빠른 분열을 요구하는 세포 집단에서 세포 내 구성요소 및 에너지원으로서 글루타민의 요구량이 증대되지만, 종양세포의 글루타민 의존적 대사작용에 관한 기전은 여전히 잘 알려진 바 없다. 본 연구에서는 LnCaP 전립선 암세포의 이동성 및 침윤성에 미치는 글루타민 결핍 효능을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 LnCaP 세포에서 글루타민 결핍에 의하여 세포의 이동성 및 세포의 침윤성이 현저하게 억제되었으며, 이러한 이동성 및 침윤성 억제는 TIMPs의 발현 증대에 의한 MMPs의 발현 감소 및 그들의 효소적 활성 저하와 연관성이 있었다.

제안 방법

적정 시간 글루타민이 결핍된 배지에서 배양된 LnCaP 세포들을 원심 분리하여 모은 후, CycletestTM Plus DNA Reagent kit(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하고 4°C, 암실에서 30분 동안 반응을 시킨 다음 DNA flow cytometry(BD Bioscience)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT(BD Bioscience) 프로그램으로 분석하였다.
글루타민 결핍이 LnCaP 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 6-well plate에 LnCaP 세포를 1×105 cells/mL로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 글루타민이 결핍된 RPMI-1640 배지로 교체하였다.
글루타민 결핍이 LnCaP 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 6-well plate에 LnCaP 세포를 1×105 cells/mL로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 글루타민이 결핍된 RPMI-1640 배지로 교체하였다. 적정 시간 경과 후 상층액을 제거하고 0.05% trypsin-EDTA(SigmaAldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 phosphate-buffered saline(PBS)과 0.5% trypan blue solution(Gibco BRL)을 각 well 당 1 mL 씩을 동량으로 첨가하여 2분 간 처리하였다. 처리된 sample 을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 살아있는 세포를 계수하여 상대적 수치로 비교하였다.
5% trypan blue solution(Gibco BRL)을 각 well 당 1 mL 씩을 동량으로 첨가하여 2분 간 처리하였다. 처리된 sample 을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 살아있는 세포를 계수하여 상대적 수치로 비교하였다.
글루타민 결핍이 LnCaP 세포의 이동성을 억제하는지의 여부를 조사하기 위하여 24시간 동안 세포를 안정화시킨 후 razor blade를 이용하여 5 mm 정도의 폭으로 세포를 제거하고 PBS 용액으로 수세한 다음 글루타민이 결핍된 배지로 교체하여 적정 시간 배양하였다. 준비된 세포들을 도립 현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
글루타민 결핍이 LnCaP 세포의 이동성을 억제하는지의 여부를 조사하기 위하여 24시간 동안 세포를 안정화시킨 후 razor blade를 이용하여 5 mm 정도의 폭으로 세포를 제거하고 PBS 용액으로 수세한 다음 글루타민이 결핍된 배지로 교체하여 적정 시간 배양하였다. 준비된 세포들을 도립 현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
글루타민 결핍 조건에서 배양된 LnCaP 세포들의 TER은 EVOM Epithelial Tissue Voltohmmeter(World Precision Instrument, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 invasion assay kit(BD Biosciences, Bedford, MA, USA)에서 측정하였으며, upper chamber에는 current-passing electroes를 넣고, lower chamber에는 current-passing electroes를 넣은 후 EVOM 2000 Ω에서 측정하였다(19).
글루타민 결핍에 의한 LnCaP 세포의 침윤성 변화를 확인하기 위하여 3.5 mm 직경의 8 μm pores를 가진 polycarbonate filter를 내장한 trans-well culture chamber(BD Bioscience, Heidelberg, Germany)를 사용하였다.
각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1× TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각 primer(Table 1)에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading한 후 100 V에서 전기영동을 하였다.
적정 시간 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포를 대상으로 TRIzol® reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다.
침윤성 측정을 위하여 필터 위에 50 μL의 matrigel을 도포시킨 다음 37°C에서 2시간 반응시켜 코팅 되도록 하였다.
적정 시간 후 upper chamber의 matrigel을 통과하지 못한 세포를 면봉으로 닦아내고 통과된 세포를 100% 메탄올에 2분 동안 고정한 다음 hematoxylin(Sigma-Aldrich)을 이용하여 4분 동안 염색하였다. 염색이 끝난 후 filter를 떼어내어 슬라이드 글라스에 놓고 말린 다음 crystal mount solution(SigmaAldrich)을 처리하고 도립현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후 해당 유전자들의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR Premix kit(iNtRon, Seongnam, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1× TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각 primer(Table 1)에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading한 후 100 V에서 전기영동을 하였다.
각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1× TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각 primer(Table 1)에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading한 후 100 V에서 전기영동을 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide(EtBr, SigmaAldrich)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다.
분리된 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 각각의 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 처리하여 4°C에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 상온에서 1시간 정도 반응시켰다.
분절되었으나 결합되지 않은 기질은 제거하고, 분절되지 않은 biotin이 결합된 gelatinase에 streptavidin–enzyme complex를 첨가하여 발색 반응을 시킨 후 540 nm 조건에서 활성의 정도를 비교하였다(20).
, Arlington Heights, IL, USA)을 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 enhanced chemiluminescence(ECL) solution(Amersham Life Science Corp.)을 적용시켜 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 발현 양을 분석하였다.
글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 세포들의 MMP 활성을 MMP Gelatinase Activity Assay kit(Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA)를 사용하여 조사하였다. 이를 위하여 적정량의 세포 배양액을 biotinylated gelatinase 기질과 혼합하여 세포 배양액에 존재하는 활성형 MMP-2 및 MMP-9에 의한 기질의 분해를 유도하였다.
, Temecula, CA, USA)를 사용하여 조사하였다. 이를 위하여 적정량의 세포 배양액을 biotinylated gelatinase 기질과 혼합하여 세포 배양액에 존재하는 활성형 MMP-2 및 MMP-9에 의한 기질의 분해를 유도하였다. 분절된 기질들을 biotin-binding 96-well plate로 옮겨 biotin이 결합된 기질이 plate에 결합하도록 37°C에서 30분간 반응시켰다.
LnCaP 인체 전립선암세포의 증식에 미치는 글루타민의 존재 여부를 조사하기 위하여 정상배지에서 24시간 배양된 LnCap 세포의 배지를 글루타민이 결핍된 배지로 교체하여 적정 시간 동안 처리한 후 hemocytometer를 사용하여 살아있는 세포의 수를 비교하였다. Fig.
글루타민 결핍 조건에서 생존된 세포들의 이동성 변화 여부를 조사하기 위하여 wound healing assay를 실시하였다. Fig.
암세포의 전이와 관련한 다양한 생체 반응에 있어서 세포의 adhesion과 junction 관련 단백질의 변화에서 특히 TJ 관련 claudins 유전자의 변화가 중요하게 작용할 것으로 추정되어 글루타민 결핍 조건에서 이들 유전자들의 발현 변화 여부를 조사하였다. Fig.
다음은 암세포의 전이에 관여하는 주요 유전자들의 전사 조절인자로서 잘 알려져 있는 snail 및 세포 골격 구성요소와 함께 세포들 사이의 유착 접합부 형성에 중요한 역할을 하는 E-cadherin의 발현에 글루타민 결핍이 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. Fig.
아울러 글루타민 결핍 조건에서 생존된 LnCaP 세포의 이동성과 침윤능이 억제되었으며, 이는 TJ의 tightening 증가 및 MMPs 활성 억제와 연관성이 있었다. 이를 위하여 글루타민이 결핍된 조건에서 LnCaP 세포의 증식억제 여부를 확인하였으며, 이는 apoptosis 유발 빈도를 의미하는 세포주기 sub-G1기 빈도의 증가와 연관성이 있었다. 아울러 글루타민 결핍 조건에서 생존된 LnCaP 세포의 이동성과 침윤능이 억제되었으며, 이는 TJ의 tightening 증가 및 MMPs 활성 억제와 연관성이 있었다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 LnCaP 인체 전립선암세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 분주 받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS)에 1%의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

데이터처리

모든 실험결과는 평균±표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student's t-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.
Significance was determined using a Student's t-test (*P<0.05).

이론/모형

암세포의 전이에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 MMPs와 그들의 발현을 억제하는 것으로 알려진 TIMPs 유전자의 발현에 미치는 글루타민 결핍의 영향을 RT-PCR 및 Western blotting 방법으로 조사하였다. Fig.

성능/효과

LnCaP 인체 전립선암세포의 증식에 미치는 글루타민의 존재 여부를 조사하기 위하여 정상배지에서 24시간 배양된 LnCap 세포의 배지를 글루타민이 결핍된 배지로 교체하여 적정 시간 동안 처리한 후 hemocytometer를 사용하여 살아있는 세포의 수를 비교하였다. Fig. 1에 나타낸 바와 같이 글루타민이 결핍된 배지에서 배양된 시간의 경과에 따라 생존된 상대적인 세포의 수가 유의적으로 감소되어 72시간 후에는 약 60% 이상의 증식 억제 효과를 보였다. 이러한 증식의 억제 효과가 세포주기 변화에 미치는 영향을 조사해본 결과, 글루타민 결핍에 따른 sub-G1기에 해당되는 세포의 빈도, 즉 apoptosis가 유발된 세포의 빈도가 현저하게 증가되었으며, G1기 및 G2/M기에 속하는 세포의 빈도는 상대적으로 감소되었다(Fig.
1에 나타낸 바와 같이 글루타민이 결핍된 배지에서 배양된 시간의 경과에 따라 생존된 상대적인 세포의 수가 유의적으로 감소되어 72시간 후에는 약 60% 이상의 증식 억제 효과를 보였다. 이러한 증식의 억제 효과가 세포주기 변화에 미치는 영향을 조사해본 결과, 글루타민 결핍에 따른 sub-G1기에 해당되는 세포의 빈도, 즉 apoptosis가 유발된 세포의 빈도가 현저하게 증가되었으며, G1기 및 G2/M기에 속하는 세포의 빈도는 상대적으로 감소되었다(Fig. 2A).
글루타민 결핍 조건에서 생존된 세포들의 이동성 변화 여부를 조사하기 위하여 wound healing assay를 실시하였다. Fig. 2B의 결과에서 알 수 있듯이 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포들은 대조군에 비하여 시간이 경과할수록 세포의 이동성이 현저하게 억제되었다.
이상에서 관찰된 LnCaP 세포의 이동성 억제와 TER 값의 변화와의 상관성을 조사하기 위하여 TER 값을 측정 결과, Fig. 3A의 결과에서 알 수 있듯이 글루타민이 결핍된 조건에 배양된 시간이 증가함에 따라서 TER의 값은 유의적으로 증가되었다. 또한 글루타민 결핍에 의한 LnCaP 세포의 침윤성 억제 여부를 확인한 결과, 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 시간이 증가할수록 침윤성이 유의적으로 억제되었다(Fig.
3A의 결과에서 알 수 있듯이 글루타민이 결핍된 조건에 배양된 시간이 증가함에 따라서 TER의 값은 유의적으로 증가되었다. 또한 글루타민 결핍에 의한 LnCaP 세포의 침윤성 억제 여부를 확인한 결과, 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 시간이 증가할수록 침윤성이 유의적으로 억제되었다(Fig. 3B). 이상의 결과에서 글루타민 결핍에 의한 LnCaP 세포의 이동성 억제는 침윤성 억제와 연관성이 있었으며, 이는 TER 값의 증가, 즉 LnCaP 세포들의 TJ의 tightening 의 증가와 연관성이 있음을 알 수 있었다.
3B). 이상의 결과에서 글루타민 결핍에 의한 LnCaP 세포의 이동성 억제는 침윤성 억제와 연관성이 있었으며, 이는 TER 값의 증가, 즉 LnCaP 세포들의 TJ의 tightening 의 증가와 연관성이 있음을 알 수 있었다.
암세포의 전이에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 MMPs와 그들의 발현을 억제하는 것으로 알려진 TIMPs 유전자의 발현에 미치는 글루타민 결핍의 영향을 RT-PCR 및 Western blotting 방법으로 조사하였다. Fig. 4에 나타난 바와 같이 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현은 전사 및 번역 수준에서 글루타민 결핍 시간의 경과에 따라 매우 억제되었으나, TIMP-1 및 TIMP-2의 발현은 반대로 매우 증가되었다. 이러한 글루타민 결핍에 따른 MMPs 및 TIMPs의 발현 변화가 MMPs 효소 활성에 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여 MMP gelatinase 활성을 조사한 결과, 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 시간이 증가할수록 두 단백질의 효소활성이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(Fig.
4에 나타난 바와 같이 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현은 전사 및 번역 수준에서 글루타민 결핍 시간의 경과에 따라 매우 억제되었으나, TIMP-1 및 TIMP-2의 발현은 반대로 매우 증가되었다. 이러한 글루타민 결핍에 따른 MMPs 및 TIMPs의 발현 변화가 MMPs 효소 활성에 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여 MMP gelatinase 활성을 조사한 결과, 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 시간이 증가할수록 두 단백질의 효소활성이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 5). 이상의 결과를 살펴볼 때 TIMPs의 발현 증가에 따른 MMPs 발현 및 효소활성의 억제가 글루타민이 결핍에 의한 LnCaP 세포의 침윤성 억제에 중요한 역할을 한 것으로 생각되어진다.
5). 이상의 결과를 살펴볼 때 TIMPs의 발현 증가에 따른 MMPs 발현 및 효소활성의 억제가 글루타민이 결핍에 의한 LnCaP 세포의 침윤성 억제에 중요한 역할을 한 것으로 생각되어진다.
따라서 본 연구에서는 글루타민이 결핍된 조건에서 LnCaP 세포의 증식억제 여부를 확인하였으며, 이는 apoptosis 유발 빈도를 의미하는 세포주기 sub-G1기 빈도의 증가와 연관성이 있었다. 아울러 글루타민 결핍 조건에서 생존된 LnCaP 세포의 이동성과 침윤능이 억제되었으며, 이는 TJ의 tightening 증가 및 MMPs 활성 억제와 연관성이 있었다. 이를 위하여 글루타민이 결핍된 조건에서 LnCaP 세포의 증식억제 여부를 확인하였으며, 이는 apoptosis 유발 빈도를 의미하는 세포주기 sub-G1기 빈도의 증가와 연관성이 있었다.
일반적으로 MMPs는 대부분의 악성 종양에서 높이 발현되며 종양의 침윤과정에서 중요한 역할을 한다고 밝혀져 있으며, 특히 Type IV collagenase인 MMP-2 및 MMP-9는 금속이온을 cofactor로 요구하는 효소로서 암세포의 전이와 침윤이 유발될 경우 기저막을 분해하여 암세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성을 활성화시킴으로써 암세포 성장에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(12,25,26). 따라서 글루타민 결핍 조건에서 암세포의 전이와 침윤에 중요하게 작용을 하는 MMPs와 TIMPs가 어떠한 변화가 유발되는 지를 확인한 결과, LnCaP 세포에서 글루타민 결핍의 조건이 길어질수록 전사 및 번역수준에서 TIMP-1 및 TIMP-2의 발현 증가와 함께 MMP-2 및 MMP-9의 발현 감소가 증가하였으며, MMP-2 및 MMP-9의 효소활성 또한 감소되었다(Fig. 4, 5). 이는 글루타민의 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포는 이들 발현의 변화를 유도하여 세포의 이동과 침윤을 억제하였을 것이라 추측된다.
Claudin family에 속하는 단백질들은 TJs의 integral membrane protein의 일종으로 paracellular permeability barrier 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다(5,27). 암세포의 전이와 관련한 다양한 생체 반응 중 세포의 adhesion과 junction 관련 단백질의 변화에서 특히 TJs와 관련된 claudins 단백질의 변화가 중요하게 작용할 것으로 추정되어 글루타민의 결핍이 이들 유전자들의 발현에 미치는 영향을 조사한 결과, 글루타민 결핍 조건 하에서 배양된 LnCaP 세포의 claudins의 발현 양이 시간 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 6). 이는 글루타민 결핍이 종양세포의 TJs와 밀접한 연관성이 있는 claudins의 발현을 억제함으로써 TJs의 치밀성을 높인 것으로 생각되어진다.
E-cadherin은 세포질에 존재하는 catenin 단백질과 복합체를 형성하는데, 이 복합체 역시 세포 골격 구성요소와 함께 세포간 유착 접합부 형성에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 암세포의 침윤 조절의 핵심인자로 알려져 있다(32,33). 따라서 글루타민 결핍 조건이 snail 및 E-cadherin의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사한 결과, 전사 및 번역수준에서 글루타민의 결핍 조건에서 배양된 시간이 증가함에 따라 E-cadherin의 발현은 전사 및 번역 수준에서 감소하였으나, snail의 발현은 점차 감소되었다(Fig. 6). 이는 LnCaP 세포에서 글루타민 결핍이 E-cadherin 및 snail의 발현을 상반되게 조절함으로써 이동성과 침윤능을 억제하는 것으로 생각되어지지만 이에 대한 구체적인 상관관계에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것이다.
본 연구에서는 LnCaP 전립선 암세포의 이동성 및 침윤성에 미치는 글루타민 결핍 효능을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 LnCaP 세포에서 글루타민 결핍에 의하여 세포의 이동성 및 세포의 침윤성이 현저하게 억제되었으며, 이러한 이동성 및 침윤성 억제는 TIMPs의 발현 증대에 의한 MMPs의 발현 감소 및 그들의 효소적 활성 저하와 연관성이 있었다. 또한 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포에서 TER의 현저한 증가가 관찰되었는데, 이는 TJs의 조절인자인 claudin family 발현의 차단에 의한 것으로 생각되어진다.
본 연구의 결과에 의하면 LnCaP 세포에서 글루타민 결핍에 의하여 세포의 이동성 및 세포의 침윤성이 현저하게 억제되었으며, 이러한 이동성 및 침윤성 억제는 TIMPs의 발현 증대에 의한 MMPs의 발현 감소 및 그들의 효소적 활성 저하와 연관성이 있었다. 또한 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포에서 TER의 현저한 증가가 관찰되었는데, 이는 TJs의 조절인자인 claudin family 발현의 차단에 의한 것으로 생각되어진다. 본 연구의 결과에 의하면 암세포의 증식에서 글루타민의 결핍은 TJ의 결합력 증대와 MMPs의 활성을 저하시킴으로써 암세포 전이에 가장 기본적인 과정인 암세포의 이동성과 침윤성을 억제시킬 수 있을 것으로 생각된다.
또한 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 LnCaP 세포에서 TER의 현저한 증가가 관찰되었는데, 이는 TJs의 조절인자인 claudin family 발현의 차단에 의한 것으로 생각되어진다. 본 연구의 결과에 의하면 암세포의 증식에서 글루타민의 결핍은 TJ의 결합력 증대와 MMPs의 활성을 저하시킴으로써 암세포 전이에 가장 기본적인 과정인 암세포의 이동성과 침윤성을 억제시킬 수 있을 것으로 생각된다.

후속연구

6에서 알 수 있듯이 글루타민 결핍 시간이 증가함에 따라서 E-cadherin의 억제자로 알려져 있는 snail의 발현이 전사 및 번역 수준에서 감소하였지만 E-cadherin의 발현은 증가되었다. 비록 이 두 유전자들이 암세포의 전이에 미치는 영향에 대하여서는 여전히 논란이 많지만, 글루타민 결핍에 노출된 LnCaP 세포에서의 상반된 발현 양상은 매우 흥미로운 결과로서 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
6). 이는 LnCaP 세포에서 글루타민 결핍이 E-cadherin 및 snail의 발현을 상반되게 조절함으로써 이동성과 침윤능을 억제하는 것으로 생각되어지지만 이에 대한 구체적인 상관관계에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	MMPs는 어떤 기능을 하는 효소인가?	한편 MMPs는 활성 부위에 아연을 포함하는 구조적으로 유사한 일군의 단백분해효소로서 세포외 기질을 분해하는 기능을 나타내며 정상적인 상태에서는 상처 치유나 조직재생 과정에 관여한다. 이들은 모두 전구효소(proenzyme)의 형태로 발현된 후 일부분의 단백질이 잘려나가면서 활성화 되고 각각의 MMPs는 종류에 따라 기질특이성을 나타낸다.
	암에 의한 사망의 주된 원인은?	항암치료 적용을 위한 방사선 및 약물 요법의 발달로 암환자의 수명과 삶의 질이 현저히 개선된 것은 사실이나 아직까지 암에 의한 사망률이 높은 편이며, 이러한 사망의 주된 원인은 암세포의 전이(metastasis)이다. 따라서 암세포 전이의 가장 기본적인 단계인 암세포의 이동(migration)이나 침윤(invasion)을 억제하는 기전의 규명이나 효과적인 치료 약물 개발이 많은 연구자들의 주된 표적이 되고 있다.
	암세포의 침윤과 전이는 암세포에서부터 분비되는 단백질 분해효소에 의해서 빠른 시간 내에 세포외 기질이 파괴되는데, 이때 관여하는 대표적인 기질 단백질 분해효소는 무엇인가?	암세포의 침윤과 전이는 매우 복합적이고 연속적인 분자적 기전들에 의해 유발된다고 알려져 있으며, 특히 암세포에서부터 분비되는 단백질 분해효소에 의해서 빠른 시간 내에 세포외 기질(extracellular matrix)의 파괴가 이루어지는 것이 특징이다(1). 대표적인 기질 단백질 분해효소에는 serine protease, cystein protease 그리고 matrix metalloproteinases(MMPs) 등이 알려져 있으며, 이들은 암세포의 침윤과 전이뿐만 아니라 신생혈관 형성 등에서도 중용한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(2,3). 특히 암의 전이에서 암세포의 기질로의 침윤은 전이 초기에 가장 중요한 단계로 인식되어지고 있다(4).

참고문헌 (33)

Woodhouse EC, Chuaqui RF, Liotta LA. 1997. General mechanisms of metastasis. Cancer 80: S1529-S1537.

상세보기
Chambers AF, Matrisian LM. 1997. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. J Natl Cancer Inst 89: 1260-1270.

상세보기
Roeb E, Matern S. 2001. Matrix metalloproteinases: Promoters of tumor invasion and metastasis－A review with focus on gastrointestinal tumors. Z Gastroenterol 39: 807-813.

상세보기
Leber MF, Efferth T. 2009. Molecular principles of cancer invasion and metastasis (review). Int J Oncol 34: 881-895.

상세보기
Morin PJ. 2005. Claudin proteins in human cancer: promising new targets for diagnosis and therapy. Cancer Res 65:9603-9606.

상세보기
Tagliarino C, Pink JJ, Dubyak GR, Nieminen AL, Boothman DA. 2001. Calcium is a key signaling molecule in $\beta$ -lapachone-mediated cell death. J Biol Chem 276: 19150-19159.

상세보기
Kominsky SL, Argani P, Korz D, Evron E, Raman V, Garrett E, Rein A, Sauter G, Kallioniemi OP, Sukumar S. 2003. Loss of the tight junction protein claudin-7 correlates with histological grade in both ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma of the breast. Oncogene 22: 2021-2033.

상세보기
Mauro L, Bartucci M, Morelli C, Ando S, Surmacz E. 2001. IGF-I receptor-induced cell-cell adhesion of MCF-7 breast cancer cells requires the expression of junction protein ZO-1. J Biol Chem 276: 39892-39897.

상세보기
Lombard C, Saulnier J, Wallach J. 2005. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie 87: 265-272.

상세보기
Kohrmann A, Kammerer U, Kapp M, Dietl J, Anacker J. 2009. Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in primary human breast cancer and breast cancer cell lines: New findings and review of the literature. BMC Cancer 9:188.

상세보기
Gibbs DF, Warner RL, Weiss SJ, Johnson KJ, Varani J. 1999. Characterization of matrix metalloproteinases produced by rat alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol 20: 1136-1144.

상세보기
Mook OR, Frederiks WM, Van Noorden CJ. 2004. The role of gelatinases in colorectal cancer progression and metastasis. Biochim Biophys Acta 1705: 69-89.
Lambert E, Dasse E, Haye B, Petitfrere E. 2004. TIMPs as multifacial proteins. Crit Rev Oncol Hematol 49: 187-198.

상세보기
Lee WJ, Hawkins RA, Wina JR, Peterson DR. 1998. Glutamine transport by the blood-brain barrier: a possible mechanism for nitrogen removal. Am J Physiol Cell Physiol 274:C1101-C1107.

상세보기
DeBerardinis RJ, Lum JJ, Hatzivassiliou G, Thompson CB. 2008. The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metab 7: 11-20.

상세보기
Weinberg F, Chandel NS. 2009. Mitochondrial metabolism and cancer. Ann NY Acad Sci 1177: 66-73.

상세보기
Ko YG, Kim EK, Kim T, Park H, Park HS, Choi EJ, Kim S. 2001. Glutamine-dependent antiapoptotic interaction of human glutaminyl-tRNA synthetase with apoptosis signalregulating kinase 1. J Biol Chem 276: 6030-6036.

상세보기
Rosenthal DI, Trotti A. 2009. Strategies for managing radiation-induced mucositis in head and neck cancer. Semin Radiat Oncol 19: 29-34.

상세보기
Martin TA, Das T, Mansel RE, Jiang WG. 2006. Synergistic regulation of endothelial tight junctions by antioxidant (Se) and polyunsaturated lipid (GLA) via Claudin-5 modulation. J Cell Biochem 98: 1308-1319.

상세보기
Wen G, Partridge MA, Li B, Hong M, Liao W, Cheng SK, Zhao Y, Calaf GM, Liu T, Zhou J, Zhang Z, Hei TK. 2011. TGFBI expression reduces in vitro and in vivo metastatic potential of lung and breast tumor cells. Cancer Lett 308:23-32.

상세보기
Koochekpour S, Majumdar S, Azabdaftari G, Attwood K, Scioneaux R, Subramani D, Manhardt C, Lorusso GD, Willard SS, Thompson H, Shourideh M, Rezaei K, Sartor O, Mohler JL, Vessella RL. 2012. Serum glutamate levels correlate with Gleason score and glutamate blockade decreases proliferation, migration, and invasion and induces apoptosis in prostate cancer cells. Clin Cancer Res 18:5888-5901.

상세보기
Fu YM, Yu ZX, Lin H, Fu X, Meadows GG. 2008. Selective amino acid restriction differentially affects the motility and directionality of DU145 and PC3 prostate cancer cells. Cell Physiol 217: 184-193.

상세보기
Fu YM, Yu ZX, Li YQ, Ge X, Sanchez PJ, Fu X, Meadows GG. 2003. Specific amino acid dependency regulates invasiveness and viability of androgen-independent prostate cancer cells. Nutr Cancer 45: 60-73.

상세보기
Visse R, Nagase H. 2003. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res 92: 827-839.

상세보기
Jiang Y, Goldberg ID, Shi YE. 2002. Complex roles of tissue inhibitors of metalloproteinases in cancer. Oncogene 21:2245-2252.

상세보기
Mignatti P, Rifkin DB. 1993. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol Rev 73: 161-195.

상세보기
Van Itallie CM, Anderson JM. 2004. The molecular physiology of tight junction pores. Physiology (Bethesda) 19: 331-338.

상세보기
Boutet A, Esteban MA, Maxwell PH, Nieto MA. 2007. Reactivation of snail genes in renal fibrosis and carcinomas:a process of reversed embryogenesis? Cell Cycle 6: 638-642.

상세보기
Mendelsohn AH, Lai CK, Shintaku IP, Fishbein MC, Brugman K, Elashoff DA, Abemayor E, Dubinett SM, St John MA. 2012. Snail as a novel marker for regional metastasis in head and neck squamous cell carcinoma. Am J Otolaryngol 33: 6-13.

상세보기
Kajita M, McClinic KN, Wade PA. 2004. Aberrant expression of the transcription factors snail and slug alters the response to genotoxic stress. Mol Cell Biol 24: 7559-7566.

상세보기
Li H, Wang H, Wang F, Gu Q, Xu X. 2011. Snail involves in the transforming growth factor $\beta$ 1-mediated epithelialmesenchymal transition of retinal pigment epithelial cells. PLoS One 6: e23322.

상세보기
Hirohashi S, Kanai Y. 2003. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci 94: 575-581.

상세보기
Hsu HP, Shan YS, Jin YT, Lai MD, Lin PW. 2010. Loss of E-cadherin and beta-catenin is correlated with poor prognosis of ampullary neoplasms. J Surg Oncol 101: 356-362.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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