오메가-3 지방산에 의한 COX-2/MMPs/VEGF 억제에 따른 대장암세포의 종양 형성 및 침윤 억제 ω3-Polyunsaturated Fatty Acids-induced Inhibition of Tumorigenicity and Invasion by Suppression of COX-2/MMPs/VEGF through NF-kB in Colon Cancer Cells원문보기
대장암은 미국 등 서양 국가뿐만 아니라 국내에서도 2번째로 많이 발병이 되는 암으로 알려져 있다. 역학조사에 의하면 오메가-3를 많이 섭취한 인종에서 대장암 발생빈도가 감소하고 최근 오메가-3는 수종의 암에 대해 항암작용을 나타낸다고 한다. 이에 본 연구에서는 대장암에서 DHA의 항침윤, 항혈관 신생 및 항종양 형성능 억제의 기전을 규명하여 다음과 같은 결과를 얻었다. DHA는 인체 대장암 세포주 HT29 의 증식을 농도 의존적으로 억제하였으나 AA는 거의 영향이 없었다. FACS 분석에서 DHA 처리했을 때 Sub G1 phase의 세포가 DHA의 농도 의존적으로 증가 하였다. DHA 처리 후 cleaved PARP가 증가하고, uncelaved caspase-3가 감소 하였다. HT29 세포의 침윤능은 DHA 처리에 의해 억제 되었다. DHA 처리 후 MMP-9 및 MMP-2 mRNA양이 감소 되었을 뿐만 아니라 그 promoter의 reporter 활성도 억제하였으며 VEGF promoter 활성도 DHA에 의해 억제 되었다. NF-kB promoter 활성 및 핵으로의 이동도 DHA에 의해 억제 되었다. In vivo 동물실험에서 생쥐 대장암 세포주인 MCA38에 대한 Fat-1 transgenic mice에서의 종양 형성능은 현저히 억제 되었다. 면역형광염색법을 이용한 Fat-1 transgenic mice의 종양 조직에서의 TUNEL 양성세포는 wild type mice에 비해 현저히 증가하였으나 CD31의 형광강도는 감소 되었다. 이상의 결과로 오메가-3는 대장암 세포에서 NF-kB 억제에 따른 COX-2, MMP-2 및 MMP-9 등 matrix matalloproteinase의 억제를 통한 침윤능의 억제, VEGF 억제를 통한 혈관신생의 억제등 복합적 기전에 의해 항암작용을 나타내리라 생각되며, 따라서 오메가-3는 대장암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으리라 생각된다.
대장암은 미국 등 서양 국가뿐만 아니라 국내에서도 2번째로 많이 발병이 되는 암으로 알려져 있다. 역학조사에 의하면 오메가-3를 많이 섭취한 인종에서 대장암 발생빈도가 감소하고 최근 오메가-3는 수종의 암에 대해 항암작용을 나타낸다고 한다. 이에 본 연구에서는 대장암에서 DHA의 항침윤, 항혈관 신생 및 항종양 형성능 억제의 기전을 규명하여 다음과 같은 결과를 얻었다. DHA는 인체 대장암 세포주 HT29 의 증식을 농도 의존적으로 억제하였으나 AA는 거의 영향이 없었다. FACS 분석에서 DHA 처리했을 때 Sub G1 phase의 세포가 DHA의 농도 의존적으로 증가 하였다. DHA 처리 후 cleaved PARP가 증가하고, uncelaved caspase-3가 감소 하였다. HT29 세포의 침윤능은 DHA 처리에 의해 억제 되었다. DHA 처리 후 MMP-9 및 MMP-2 mRNA양이 감소 되었을 뿐만 아니라 그 promoter의 reporter 활성도 억제하였으며 VEGF promoter 활성도 DHA에 의해 억제 되었다. NF-kB promoter 활성 및 핵으로의 이동도 DHA에 의해 억제 되었다. In vivo 동물실험에서 생쥐 대장암 세포주인 MCA38에 대한 Fat-1 transgenic mice에서의 종양 형성능은 현저히 억제 되었다. 면역형광염색법을 이용한 Fat-1 transgenic mice의 종양 조직에서의 TUNEL 양성세포는 wild type mice에 비해 현저히 증가하였으나 CD31의 형광강도는 감소 되었다. 이상의 결과로 오메가-3는 대장암 세포에서 NF-kB 억제에 따른 COX-2, MMP-2 및 MMP-9 등 matrix matalloproteinase의 억제를 통한 침윤능의 억제, VEGF 억제를 통한 혈관신생의 억제등 복합적 기전에 의해 항암작용을 나타내리라 생각되며, 따라서 오메가-3는 대장암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으리라 생각된다.
Epidemiology studies have reported a reduced incidence of colon cancer among populations that consume a large quantity of ${\omega}3-polyunsaturated$ fatty acids (${\omega}3-PUFAs$) of marine origin. Herein, we demonstrated a mechanism of anticancer action of ${\omega}3-PU...
Epidemiology studies have reported a reduced incidence of colon cancer among populations that consume a large quantity of ${\omega}3-polyunsaturated$ fatty acids (${\omega}3-PUFAs$) of marine origin. Herein, we demonstrated a mechanism of anticancer action of ${\omega}3-PUFAs$, showing that they suppressed invasion and tumorigenicity in colon cancer cells. Docosahexaenoic acids (DHA) inhibited the cell growth of HT29 cells. This action likely involved apoptosis, given that the DHA treatment increased the cleaved form of PARP and sub G1 cells. Moreover, the invasiveness of HT29 cells was inhibited following DHA treatment, whereas arachidonic acid (AA) had no effect. The levels of Matrix-metalloproteinase-9 (MMP-9) and MMP-2 mRNA decreased after DHA pretreatment. DHA treatment inhibited MMP-9 and MMP-2 promoter activities and reduced VEGF promoter activity. DHA pretreatment also inhibited the activities of prostaglandin-2 (PGE2)-induced MMPs and the VEGF promoter. Cyclooxygenase-2 (COX-2) overexpression increased the activity of MMPs and that of the Vascular endotherial growth factor (VEGF) promoter in HT29 cells, and DHA inhibited NF-kB and COX-2 promoter reporter activities. As shown by in vivo experiments, when mouse colon cancer cells (MCA38) were implanted into Fat-1 and wild-type mice, both the tumoral size and volume were dramatically inhibited in Fat-1 transgenic mice. Furthermore, TUNEL-positive cells increased in tumors from Fat-1 mice compared with wild mice. In immunohistochemistry, the intensity of CD31 in Fat-1 tumors was weaker. These findings suggest that ${\omega}3-PUFAs$ may inhibit tumorigenicity and angiogenesis as well as cancer cell invasion by suppression of COX-2, MMPs and VEGF via the reduction of NF-kB in colon cancer.
Epidemiology studies have reported a reduced incidence of colon cancer among populations that consume a large quantity of ${\omega}3-polyunsaturated$ fatty acids (${\omega}3-PUFAs$) of marine origin. Herein, we demonstrated a mechanism of anticancer action of ${\omega}3-PUFAs$, showing that they suppressed invasion and tumorigenicity in colon cancer cells. Docosahexaenoic acids (DHA) inhibited the cell growth of HT29 cells. This action likely involved apoptosis, given that the DHA treatment increased the cleaved form of PARP and sub G1 cells. Moreover, the invasiveness of HT29 cells was inhibited following DHA treatment, whereas arachidonic acid (AA) had no effect. The levels of Matrix-metalloproteinase-9 (MMP-9) and MMP-2 mRNA decreased after DHA pretreatment. DHA treatment inhibited MMP-9 and MMP-2 promoter activities and reduced VEGF promoter activity. DHA pretreatment also inhibited the activities of prostaglandin-2 (PGE2)-induced MMPs and the VEGF promoter. Cyclooxygenase-2 (COX-2) overexpression increased the activity of MMPs and that of the Vascular endotherial growth factor (VEGF) promoter in HT29 cells, and DHA inhibited NF-kB and COX-2 promoter reporter activities. As shown by in vivo experiments, when mouse colon cancer cells (MCA38) were implanted into Fat-1 and wild-type mice, both the tumoral size and volume were dramatically inhibited in Fat-1 transgenic mice. Furthermore, TUNEL-positive cells increased in tumors from Fat-1 mice compared with wild mice. In immunohistochemistry, the intensity of CD31 in Fat-1 tumors was weaker. These findings suggest that ${\omega}3-PUFAs$ may inhibit tumorigenicity and angiogenesis as well as cancer cell invasion by suppression of COX-2, MMPs and VEGF via the reduction of NF-kB in colon cancer.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 먼저 HT29 등 대장암세포에서 DHA에 의한 세포독성 기전을 확인하고, DHA의 침윤능 및 혈관신생의 억제뿐만 아니라 Fat-1 mice를 이용한 동물모델에서 종양 형성능 억제기전을 규명하여 약간의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
상기 실험에서 DHA에 의해 MMP-2 및 MMP-9 mRNA양 이 각각 감소하였는데 이들의 억제가 전사 단계에서 조절되는 지 확인하기 위해 DHA 처리한 후 MMP-2 및 MMP-9의 promoter 활성을 측정하였다. 6-well plate에 HT29를 배양하여 MMP-2 및 MMP-9 promoter 유전자가 포함된 reporter plasmid를 transient transfection 후 그 활성에 대한 DHA의 영향 을 lucifersae 활성을 측정함으로 검색하였다. 먼저 MMP-2 promoter의 luciferase 활성은 HT29 세포에서 DHA 처리 후 억제되었으며 이는 농도의존적으로 나타났다.
DHA가 처리된 세포와 control 세포로부터 각각 조제한 total RNA 1 μg, 8 μl의 5x RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 250 mM KCl, 50 mM MgCl2, 2.5 mM spermidine, 50 mM DTT), 2.5 mM dNTP 4μl, oligo-dT (100 pmol/μl) 1 μl, RNase inhibitor (4 unit/μl) 2 μl, AMV reverse transcriptase (5 unit/ μl) 2 μl를 42℃에서 1시간 동안 반응하여 single-strand cDNA 를 합성하였다.
Fat-1 mice와 wild type mice의 종양 형성능의 차이를 검색 하기 위하여 C57BL6에서 유래된 대장암 세포주인 MCA38을 배양하여 3×106 cells/100 μl로 조절하여 6-7주령된 Fat-1 mice 와 C57BL6 wild mice의 오른쪽 옆구리의 피하에 각각 주입하 고 종양의 발생 및 성장에 미치는 영향을 검색하였다.
Transfection된 세포에 DHA등의 약물을 처리하여 일정시간 배양한 후 세포 를 1X reporter lysis buffer로 lysis 시키고 luciferase assay system (Promega사)을 이용하여 반응시킨 후 Luminometer (Thermo사)로 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase활성의 측정은 효소액의 단백질 양을 측정한 후 동일한 단백질 양으로 조절한 다음 시행하였다.
Transfection된 세포에 DHA등의 약물을 처리하여 일정시간 배양한 후 세포 를 1X reporter lysis buffer로 lysis 시키고 luciferase assay system (Promega사)을 이용하여 반응시킨 후 Luminometer (Thermo사)로 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase활성의 측정은 효소액의 단백질 양을 측정한 후 동일한 단백질 양으로 조절한 다음 시행하였다.
6A). NF-kB report활성이 감소 하였음으로 핵속에서 NF-kB 단백질 양의 감소를 확인하기 위해 HT29 세 포를 DHA 처리 후 NF-kB subunit인 p65에 대한 면역 형광염 색을 시행하였다. HT29 세포를 10 μM DHA로 24시간 처리 후 control과 비교했을 때 NF-kB단백은 핵속에서 거의 검출되 지 않았으나 오메가-6인 AA처리 후에는 control과 큰 차이를 보이지 않았다(Fig.
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) DHA가 처리된 세포와 control 세포로부터 각각 조제한 total RNA 1 μg, 8 μl의 5x RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 250 mM KCl, 50 mM MgCl2, 2.5 mM spermidine, 50 mM DTT), 2.5 mM dNTP 4μl, oligo-dT (100 pmol/μl) 1 μl, RNase inhibitor (4 unit/μl) 2 μl, AMV reverse transcriptase (5 unit/ μl) 2 μl를 42℃에서 1시간 동안 반응하여 single-strand cDNA 를 합성하였다.
5 μg/well로 COX-2 reporter plasmid 등을 lip-ofectamine을 이용하여 transfection 하였다. Transfection된 세포에 DHA등의 약물을 처리하여 일정시간 배양한 후 세포 를 1X reporter lysis buffer로 lysis 시키고 luciferase assay system (Promega사)을 이용하여 반응시킨 후 Luminometer (Thermo사)로 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase활성의 측정은 효소액의 단백질 양을 측정한 후 동일한 단백질 양으로 조절한 다음 시행하였다.
type 및 Fat-1 mice의 종양 조직으로부터 얻은 paraffin-embedded tissue section을 deparaffinized와 rehydrated 후 상온에서 30분간 blocking한 다음 anti-CD31 antibody와 ofectamine을 이용하여 transfection 하였다.
대장암 세포를 6-well culture plate에 80% confluent하게 plating한 후 0.5 μg/well로 COX-2 reporter plasmid 등을 lip-ofectamine을 이용하여 transfection 하였다.
먼저 matrigel drop assays는 Szymczak 등[39]의 방법을 변 개하여 시행하였다. 즉, HT29 세포를 trypsin-EDTA 처리 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 세척하고 1×106 cells/ml로 세포 수를 조절한 다음 matrigel (BD)과 1:1로 혼합하였다.
즉 침윤능 검색을 위하여 filter위에 Matrigel을 도포시킨 후 37℃에서 2시간 배양하여 젤화 되도록 한 다음 세포현탁액 200 μl (2×105 cells)를 upper chamber에 넣고 lower chamber에는 DHA가 포함된 배양액을 넣은 후 일정시간 배양시켰다. 배양이 끝나면 filter 윗면의 세포들을 면봉을 이용해 제거한 후 filter를 분리해 hematoxylin-eosin으로 염색한 후 현미경을 이용해 filter 아랫 면의 세포 수를 검경 계수하여 판독하였다.
이는 HT29 세포에서 DHA에 의한 MMP-9 및 MMP-2 유전자 발현의 억제가 오메가-3의 특이 작용임을 시사 하는 것이다. 상기 실험에서 DHA에 의해 MMP-2 및 MMP-9 mRNA양 이 각각 감소하였는데 이들의 억제가 전사 단계에서 조절되는 지 확인하기 위해 DHA 처리한 후 MMP-2 및 MMP-9의 promoter 활성을 측정하였다. 6-well plate에 HT29를 배양하여 MMP-2 및 MMP-9 promoter 유전자가 포함된 reporter plasmid를 transient transfection 후 그 활성에 대한 DHA의 영향 을 lucifersae 활성을 측정함으로 검색하였다.
혈관신생은 종양형성능과 밀접히 관련 되어 있으며, 혈관신 생에는 VEGF 등 혈관신생인자의 발현이 중요하다고 알려져 있다 Yun 등[46]은 Fat-1 mice에서 VEGF에 의한 혈관신생이 억제된다고 하였다. 상기 실험에서 DHA에 의해 VEGF promoter 활성이 억제 되었음으로, 이에 Fat-1 mice의 종양조직에 서 혈관신생의 억제 여부를 검색하기 위해 혈관 내피세포에 존재하는 혈관의 표식자인 CD31의 조직 형광면역염색을 시 행하였다. Fat-1 mice의 종양조직에서 CD31 intensity는 wild type mice에 비해 현저히 감소하였다(p<0.
이는 Fat-1 mice가 오메가-3가 wild type에 비해 높은 점을 감안할 때, 오메가-3가 대장암의 종양형성능을 억제할 수 있음을 시사 한다. 상기 실험에서 Fat-1 mice에서 MCA38 대장암 세포의 종양 형성능이 감소되었는 바 이의 기전을 밝히기 위해 형성된 종 양조직에서 TUNEL assay를 시행하여 apoptotic cells를 검색 하였다. Fat-1 mice에서는 wild type mice에 비해 apoptotic index가 현저히 증가 하였는데(p<0.
상기 실험에서도 PGE2가 MMP-9 및 MMP-2 promoter 활성조절에 밀접히 관련되어 있 음으로 AA로부터 COX-2에 의해 합성된 PGE2가 그 조절에 관련되어 있는지를 확인하기 위해 COX-2 유전자를 과발현 시킨 후 MMP-2, MMP-9 및 VEGF promoter의 reporter 활성 의 변동 및 DHA에 의한 조절을 검색하였다. HT29세포에서 COX-2유전자를 과발현 시켰을 때 MMP-9, MMP-2, 및 VEGF promoter의 활성이 증가 하였으며 이는 DHA 전처리 후 억제 되었다(Fig.
25 μg/ml)을 처리한 후 propidium iodide (50 μg/ ml)를 이용하여 염색하고, spectra/Mesh Nylon로 filter하여 측정하였다. 세포주기별 분포율은 FACscan (Becton Dickinson)의 FL-2A와 FL-2W linear plot에 근거하여, Cell Quest software를 이용한 histogram으로 계산하였다.
유세포 계측은 ethanol로 고정된 세포에 RNase A (0.25 μg/ml)을 처리한 후 propidium iodide (50 μg/ ml)를 이용하여 염색하고, spectra/Mesh Nylon로 filter하여 측정하였다.
이 들 세포를 Tween 20이 포함된 PBS로 3회 washing한 후 FITC 가 conjugation된 mouse 2차 antibody와 반응 시킨 다음 RNAase (5 μg/ml)가 포함된 PI로 핵을 염색한 후 confocal microscopy로 검경하였다.
Western blot은 SDS-PAGE 후에 분리된 단백을 전기적 전 사법으로 nitrocellulose membrane에 옮긴 후 전사된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk로 실온에서 1시간 blocking한 다음 동일 용액으로 PARP, caspase-3, β-actin 등 의 antibody (1:1,000)로 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이 후 TBS-T로 수회 세척하고 peroxidase conjugated secondary antibody를 5% skim milk/PBS-T용액에 1:10,000으로 희석하여 1시간 반응시키고 TBS-T로 수회 세척한 후 ECL Western blotting detection system을 이용하여 단백질 band를 확인하였다.
이를 20 μl (1×104 cells)씩 6-well plate상에 떨어뜨리고 37℃ CO2 incubator에서 5분 동안 방치하여 matrigel을 굳힌 다음 2% FBS 가 포함된 배지에서 24시간 배양한 후 Matrigel droplet 밖으 로 이동된 세포 수를 측정하였다.
이를 MMP-9 및 MMP-2 유전자의 primer (MMP-2, Forward: 5’-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3’, Reverse: 5’-GGCATCCAGGTTATCGGGGA-3’; MMP-9, Forward: 5’-TGGACGATGCCTGCAACGTG-3’, Reverse: 5’-GT CGTGCGTGTCCAAAGGCA-3’)와 dNTP, Taq polymerase, Taq buffer등과 섞어 94℃ 1분, 65℃ 1분, 72℃ 1분씩 30 cycle 을 반응시킨 후 1.5% agarose gel에 전기영동하여 그 변동을 확인하였다.
이에 DHA의 대장암세포에 미치는 영향이 세포독 성 유도 외에 세포 침윤능 억제작용도 있는가를 밝히기 위해 HT29세포의 침윤능을 검색하였는데 이 때 세포증식에 거의 영향을 미치지 않는 농도인 10, 25 μM의 DHA를 사용하였다.
이에 Fat-1 mice에서 대장암세포의 종양 형성능을 검색하기 위해 Fat-1 mice (n=5)와 wild type mice (n=5)에 C57BL6에서 유래된 대장암 MCA38세포 3x106 cells/100 μl를 오른편 옆구 리에 피하 주사하여 4일 후부터 2일마다 종양의 크기를 측정 하였다.
Pavlovic 등[31]은 macrophage에서 PGE2에 의해 MMP-9의 활성이 증가된다고 하였고, Yun 등[46]은 유방암 세포에서 AA 및 COX-2/PGE2에 의해 MMP-2 및 MMP-9 promoter 활 성이 증가하며 이는 DHA에 의해 억제된다고 하였다. 이에 먼저 대장암 HT29 세포에서 transient transfection한 MMP-9, MMP-2 및 VEGF promoter 활성에 대한 PGE2의 영향을 검색 한 바 MMP-9 promoter의 luciferase 활성이 PGE2에 의해 증 가하였으며, 이는 DHA 전 처리에 의해 감소하였다(Fig. 5A). Larkin 등[23]은 COX-2의 억제가 유방암세포의 침윤 및 MMPs의 발현을 억제한다고 하였다.
Fat-1 mice와 wild type mice의 종양 형성능의 차이를 검색 하기 위하여 C57BL6에서 유래된 대장암 세포주인 MCA38을 배양하여 3×106 cells/100 μl로 조절하여 6-7주령된 Fat-1 mice 와 C57BL6 wild mice의 오른쪽 옆구리의 피하에 각각 주입하 고 종양의 발생 및 성장에 미치는 영향을 검색하였다. 종양형 성이 육안으로 확인된 날부터 2주동안 종양의 크기 및 용적계 측을 시행하였다. 종양의 용적은 다음의 공식으로 계산하였다.
즉 96 well microtiter tissue culture plate에 대장암 세포를 5~10×103 cells/well로 plating하고 하룻밤 배양 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교환 한 다음 24시간 배양하고 DHA 등을 농도별로 처리하였다.
Inc, USA)을 이용하여 조제하였다. 즉, 각 약물을 처리한 HT29 세포를 일정 시간 배양한 후에 배지를 제거하고 PBS로 2회 씻은 다음 PBS 1 ml씩을 가해 세포를 수집한 후 여기에 Ultraspec Ⅱ 용액을 일정량 가하여 세포를 용해시켜 4℃에서 5분간 방치한 후 0.1 배 용량의 chloroform용액을 가하고 진탕, 혼합하였다. 이를 다시 4℃에서 5분간 방치하고, 4℃에서 12,000 rpm으로 15분 간 원심분리하였다.
대상 데이터
Agarose와 RPMI 1640, fetal bovine serum 등 세포배양에 필요한 시약들은 GIBCO-BRL사(Gaithersburg, MD, USA)에서, caspase-3, PARP, β–actin 등의 항체는 Santa Crutz사 (Santa Cruz Biotechnology Inc., TX, USA), DHA과 AA는 Cayman Chemical사(Michigan, USA), sodium dodecyl sulfate (SDS) 등 기타 시약은 Sigma사(MO, USA)의 것을 사용하였다.
실험에 사용한 생쥐는 특정 미생물 미감염(SPF) 하에서 유 지하였으며, 충남대학교 실험동물위원회의 가이드라인에 따 라 시행 하였다(동물승인번호: CNU-00552). Fat-1 mice는 Harvard Universitydml Dr. Jing X. Kang 으로부터 분양 받았 다. Fat-1 mice와 wild type mice의 종양 형성능의 차이를 검색 하기 위하여 C57BL6에서 유래된 대장암 세포주인 MCA38을 배양하여 3×106 cells/100 μl로 조절하여 6-7주령된 Fat-1 mice 와 C57BL6 wild mice의 오른쪽 옆구리의 피하에 각각 주입하 고 종양의 발생 및 성장에 미치는 영향을 검색하였다.
실험에 사용한 생쥐는 특정 미생물 미감염(SPF) 하에서 유 지하였으며, 충남대학교 실험동물위원회의 가이드라인에 따 라 시행 하였다(동물승인번호: CNU-00552). Fat-1 mice는 Harvard Universitydml Dr.
인체 대장암 세포주 HT29 및 C57BL6에서 유래된 대장암 세포주인 MCA38의 배양은 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/ml), streptomycin (100 μg/ ml)을 첨가한 RPMI1640 및 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)을 배양액으로 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하고 세포의 밀도가 높아지면 수분간의 trypsin-EDTA (0.05% trypsin, 0.02% EDTA in Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium)로 처리하고 실험 시 지수기에 있도록 계대배양 하였고, 모든 실험 전에는 FBS가 포함되지 않은 배지로 serum deprivation을 24시간 시킨 후 사용하였다.
즉, 6.5 mm 직경의 8 μm pores를 가진 polycarbonate filter를 내장한 transwell culture chamber (Costa, Cambridge, MA)를 이용하였다.
이론/모형
Transwell chamber를 통한 침윤능의 측정은 Yoon 등[45] 의 방법에 따라 시행하였다. 즉, 6.
대장암 세포주의 증식능에 대한 DHA 등의 영향은 colorimetric MTT assay를 이용해 측정하였다. 즉 96 well microtiter tissue culture plate에 대장암 세포를 5~10×103 cells/well로 plating하고 하룻밤 배양 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교환 한 다음 24시간 배양하고 DHA 등을 농도별로 처리하였다.
성능/효과
HT29 세포를 10 μM DHA로 24시간 처리 후 control과 비교했을 때 NF-kB단백은 핵속에서 거의 검출되 지 않았으나 오메가-6인 AA처리 후에는 control과 큰 차이를 보이지 않았다(Fig. 6B).
상기 실험에서도 PGE2가 MMP-9 및 MMP-2 promoter 활성조절에 밀접히 관련되어 있 음으로 AA로부터 COX-2에 의해 합성된 PGE2가 그 조절에 관련되어 있는지를 확인하기 위해 COX-2 유전자를 과발현 시킨 후 MMP-2, MMP-9 및 VEGF promoter의 reporter 활성 의 변동 및 DHA에 의한 조절을 검색하였다. HT29세포에서 COX-2유전자를 과발현 시켰을 때 MMP-9, MMP-2, 및 VEGF promoter의 활성이 증가 하였으며 이는 DHA 전처리 후 억제 되었다(Fig. 5B). 이는 DHA가 COX-2 억제에 따른 PGE2 신호 전달경로를 억제하여 MMP-9, MMP-2 및 VEGF promoter의 전사를 조절하였으리라 생각되며 따라서 침윤 및 혈관신생을 억제할 수 있음을 시사한다.
Immunohistochemistry Wild type 및 Fat-1 mice의 종양 조직으로부터 얻은 paraffin-embedded tissue section을 deparaffinized와 rehydrated 후 상온에서 30분간 blocking한 다음 anti-CD31 antibody와 등 세포주기 변동을 분석하였는데, DHA 처리 후 subG1 population이 농도에 의존적으로 현저히 증가하였다(Fig. 1D).
또한 HT29세포를 transwell chamber에 5x105 cells/well로 조절하고 10, 25 μM 의 DHA로 처리한 다음 24~48시간 후에 filter를 통해 이동한 세포를 측정하여 침윤능을 검색하였을 때도 DHA에 의한 HT29 (Fig. 2B)의 침윤능은 억제되었다.
3B). 또한 MMP-9 promoter 활성에 대한 DHA의 영향을 luficerase 활성을 측정 함으로 검색한 바 DHA 처리 후 MMP-9 promoter 활성이 억 제되었고 이는 DHA 농도의존적으로 나타났으나, AA는 MMP-9 활성에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 3C).
6-well plate에 HT29를 배양하여 MMP-2 및 MMP-9 promoter 유전자가 포함된 reporter plasmid를 transient transfection 후 그 활성에 대한 DHA의 영향 을 lucifersae 활성을 측정함으로 검색하였다. 먼저 MMP-2 promoter의 luciferase 활성은 HT29 세포에서 DHA 처리 후 억제되었으며 이는 농도의존적으로 나타났다. 그러나 AA는 MMP-2 활성에 영향을 미치지 않았다(Fig.
이상의 결과로 오메가-3는 대장암 세포에서NF-kB 억제에 따른 COX-2와 MMP-2 및 MMP-9 등 matrix metalloproteinase의 억제를 통한 침윤능의 억제, VEGF 억제를 통한 혈 관신생의 억제등 복합적 기전에 의해 항암작용을 나타내리라 생각되며(Fig. 8), 따라서 오메가-3의 복용은 대장암의 예방 및 치료 목적으로 유용하게 사용할 수 있으리라 시사된다. 감사의 글 본 연구는 2015년 충남대학교 학술연구비에 의해 지원 되었 음.
또한 MMP-9 [2, 11], VEGF [40], COX-2 [10] 등의 유전자 promoter 에는 공통적으로 NF-kB가 결합할 수 있는 cis element가 존재 한다고 한다. 이에 DHA에 의한 NF-kB 활성 변동을 검색하기 위해 먼저 NF-kB binding element를 가진 reporter plasmid를 transient transfection 후 DHA의 영향을 검색한 바 DHA 처리 후 NF-kB reporter 활성은 감소하였으며 이는 농도의존적으 로 나타났다(Fig. 6A). NF-kB report활성이 감소 하였음으로 핵속에서 NF-kB 단백질 양의 감소를 확인하기 위해 HT29 세 포를 DHA 처리 후 NF-kB subunit인 p65에 대한 면역 형광염 색을 시행하였다.
이에 대장암 HT29 세포에서 DHA에 의한 MMP-9 및 MMP-2 발현을 검색하기 위하여 DHA 처리 후 total RNA 를 조제하여 RT-PCR을 시행한 바 농도의존적으로 MMP-9 및 MMP-2 mRNA양이 감소하였으나 AA에 의해서는 영향이 없 었다(Fig. 3A). 이는 HT29 세포에서 DHA에 의한 MMP-9 및 MMP-2 유전자 발현의 억제가 오메가-3의 특이 작용임을 시사 하는 것이다.
이에 먼저 대장암 HT29 세포에서 오메가-3가 COX-2 및 VEGF의 전사를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 COX-2 및 VEGF promotor 활성에 대한 DHA의 영향을 검색한바 COX-2 및 VEGF promotor 활성이 각각 억제 되었다(Fig. 4) 이는 오메가-3인 DHA가 COX-2 및 VEGF의 전사를 억제할 수 있음을 시사한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
필수지방산의 종류는?
필수지방산에는 오메가-3 지방산(이하 오메가-3) 및 오메가 -6 지방산(이하 오메가-6)이 있는데 이들은 인지질의 구성성분 으로 세포막을 이루고 있으며 phospholipase A2에 의해 절단 되며, prostaglandin을 포함한 eicosanoids합성의 전단계 물질 로써 중요하다[14, 19]. 중요한 오메가-6에는 arachidonic acid (AA), 오메가-3에는 eicosapentaenoic acid (EPA) 및 docosahexaenoic acid (DHA) 등이 있으며 이들은 그 생리적인 기능 이 다르다고 알려져 있는데, 오메가-6는 암의 형성, 성장, 전이 등을 증가시키는 반면에 오메가-3는 이들 효과를 억제한다고 [6, 19, 32] 한다.
오메가-6의 생리적 기능은?
필수지방산에는 오메가-3 지방산(이하 오메가-3) 및 오메가 -6 지방산(이하 오메가-6)이 있는데 이들은 인지질의 구성성분 으로 세포막을 이루고 있으며 phospholipase A2에 의해 절단 되며, prostaglandin을 포함한 eicosanoids합성의 전단계 물질 로써 중요하다[14, 19]. 중요한 오메가-6에는 arachidonic acid (AA), 오메가-3에는 eicosapentaenoic acid (EPA) 및 docosahexaenoic acid (DHA) 등이 있으며 이들은 그 생리적인 기능 이 다르다고 알려져 있는데, 오메가-6는 암의 형성, 성장, 전이 등을 증가시키는 반면에 오메가-3는 이들 효과를 억제한다고 [6, 19, 32] 한다. 따라서 오메가-6 및 오메가-3의 절대량 보다 오메가-6/오메가-3의 비율이 중요하며 이들 비율의 감소가 암 을 포함한 염증 관련 질환의 예방 뿐만 아니라 치료에 중요하 다고[1, 13, 21, 28, 36, 44] 한다.
서양식이의 오메가-6/오메가-3의 비율은?
따라서 오메가-6 및 오메가-3의 절대량 보다 오메가-6/오메가-3의 비율이 중요하며 이들 비율의 감소가 암 을 포함한 염증 관련 질환의 예방 뿐만 아니라 치료에 중요하 다고[1, 13, 21, 28, 36, 44] 한다. 서양식이는 오메가-6 함량이 많아 오메가-6/오메가-3 비율이 약 30:1로 매우 높아 오메가-6 를 많이 함유한 식이가 염증을 유발하고 따라서 암의 발생 빈도를 높이는 반면에, 생선을 섭취하면 생선에 다량 함유된 오메가-3 섭취를 높여 오메가-6/오메가-3의 비율이 낮아지며, 따라서 암을 예방할 수 있으리라 생각되고 있다[16, 19]. 그린 랜드 에스키모인들이 서양인들에 비해 대장암 발생 빈도가 낮다고 보고[7]되고 있는데, 이는 이들의 식이에 오메가-3 함 량이 서양식이 보다 높기 때문[33] 이라고 한다.
참고문헌 (47)
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