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문제 정의
- 본 연구는 기존 연구와 일치하는 결과를 보였 는데,목향추출물은 농도-그리고 시간-의존적 으로 A549세포 생존율을 감소시켰고 이러한 세포사멸은 apoptosis으로 인한 것임을 확인할수 있었다.목향에 의해 유발된 세포독성이 ROS와 연관이 있는지 조사하고자,목향추출물 처리에 따른 A549세포에서의 ROS변화를 살펴 보았다.그 결과 목향추출물에 의해 ROS생성이 크게 증가하였고,뿐만 아니라 항산화제 NAC 의 전처리는 A549세포의 세포독성을 현저하게 감소시켰다.
- 본 연구에서는 Nrf2를 조절 단백질인 keap1 인 돌연변이로 인해 Nrf2가 과발현 상태인 폐암 세포주, A549세포에서 목향의 세포독성 효과를 관찰하였다.목향에 의해 유도된 세포독성은 ROS가 중심적 역할을 하는 것으로 확인되었다.
- 따라서,최근 Nrf2의 억제하는 방법을 통해 폐암을 효율적으로 치료하 고자 하는 접근이 고려되고 있다.이에 우리는 목향추출물의 Nrf2의 억제의 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
제안 방법
- A549cells에 24시간동안 0,15,그리고 30㎍/㎖ 목향추출물을 처리한 후 GSH의 변화를 관찰하 였다.그 결과,목향은 GSH 수준을 통계적으로 유의하게 농도-의존적으로 감소시켰다(Fig.
- A549cells에서 목향추출물로 인한 세포죽음이 apoptosis인지 necrosis인지 확인하기 위해서 FACS분석을 실시하였다.그 결과,목향추출물을 처리하지 않은 군에 비해 목향추출물을 처리한 처리군에서 sub-G1phase의 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig2).
- A549세포를 2x106개씩 100cm 2plate에 각각 분주하고,목향추출물(0,5,15,30㎍/㎖)을 24시간 동안 처리하였다.목향 처리된 세포를 모은 후, RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 lysis시킨 다음 단백질을 Brad-fordassay를 통해서 정량 하였다.
- A549세포를 6wellplate에 2×105개씩 분주 하고 vehicle(DMSO)또는 목향추출물(5,15,30 ㎍/㎖)을 24시간 처리하였다.
- A549세포를 96wellplate에 4×103개씩 분주 하고 vehicle(DMSO)또는 목향추출물(1,5,15, 30㎍/㎖)을 24시간 처리하였다.
- A549세포에 vehicle(DMSO)또는 목향추출물 (15,30㎍/㎖)을 24시간 처리 후 빛을 차단한후 20 μM DCFDA에 노출시켜 37°C에서 30분간 반응시켰다.
- A549세포에 vehicle(DMSO)또는 목향추출물(15,30㎍/㎖)을 24시간 처리한 다음,GSH assay kit(Cayman Chem,USA)을 이용하여 Tecanmicroplatereader(Sunnyvale,CA,USA) 을 통해 405-414nm에서 GSH양을 측정하였다.
- A549세포에 vehicle(DMSO)또는 목향추출물 (15,30㎍/㎖)을 24시간 처리 후 빛을 차단한후 20 μM DCFDA에 노출시켜 37°C에서 30분간 반응시켰다.PBS로 3번 세척한 다음 FACS분석 (FACSCalibur;BD Bioscience,Franklin Lakes,NJ,USA)을 통해 측정하였다.우리는 또다른 방법으로 ROS의 여부를 확인하기 위해, A549세포에 vehicle(DMSO)또는 목향추출물 (30㎍/㎖)을 24시간 처리한 후 20 μM DCFDA에 노출시켜 37°C에서 30분간 반응시킨 후 형광현미경 (Nikon,UV-2A)을 이용하여 통해 관찰하였다.
- 그 다음 trypsin을 이용하여 세포를 떼어낸 후 70% EtOH로 세포를 고정시켰다.PI(propidium Iodine)를 30분간 37도에서 반응하여 FACS 분석(FACSCalibur; BD Bioscience,Franklin Lakes,NJ,USA)을 이용하여 세포내 DNA를 염색한 후,DNA 양의 변화를 측정하였다.
- )를 이용하여 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였 다.또한,목향추출물이 유발한 세포독성이 ROS 에 의한 것인지를 확인하기 위해 목향추출물 처리 1시간 전에 ROS제거능을 가진 N-acetylL-cysteine(NAC;Sigma,St.Louis,MO,USA) 을 전 처리한 후 목향추출물을 처리하여 세포생 존율을 측정하였다.
- 43%이었으며 냉장보관 후 DMSO 에 녹여 실험에 사용하였다.목향 추출물내의 costunolide함량 분석은 AcQUITY UPLCTM System (Waters,UK)으로 분석하여 179.17ppm 의 농도로 함유된 것을 확인 후 사용하였다.
- 목향추출물의 A549cells에서의 세포독성을 평가하고자 MTT assay를 실시하였다. 24시간의 0,1,5,15,그리고 30㎍/㎖ 목향추출물이 처리된 A549cells에서 세포 생존율이 농도-의존 적으로 감소하였다(Fig1A).
- 정량 된 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 크기 별로 분리하였다.분리된 단백질을 PVDFmembrane에 옮긴 후,PVDFmembrane 을 blocking용액(5% BSA in TBS within 0.1% tween20)으로 1시간 동안 처리하였다. Blocking후,Nrf-2(#8882;cellsignaling),Lamin B(sc-6216;santa-cruz)1차 항체를 첨가 한 후 4℃에서 20rpm으로 overnight반응시켰다.
- 1mM NAC이 1시간 전처리된 후 목향추출물이 처리된 A549세포에서의 ROS의 수준은 목향추출물만 처리된 세포에 비해 ROS의 양이 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig3A,B).뿐만 아니라, 우리는 세포의 형태변화의 관찰을 통해 NAC 처리가 세포 생존에 영향을 미친 것을 확인하여 (Fig3C),이를 확인하기 위해,NAC을 전처리한 A549cell에서 세포독성을 MTT assay를 이용하여 생존율을 확인하였다.그 결과 NAC전 처리에 의해서 목향추출물의 세포독성이 크게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig3D).
- 우리는 또다른 방법으로 ROS의 여부를 확인하기 위해, A549세포에 vehicle(DMSO)또는 목향추출물 (30㎍/㎖)을 24시간 처리한 후 20 μM DCFDA에 노출시켜 37°C에서 30분간 반응시킨 후 형광현미경 (Nikon,UV-2A)을 이용하여 통해 관찰하였다.
- 목향 처리된 세포를 모은 후, RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 lysis시킨 다음 단백질을 Brad-fordassay를 통해서 정량 하였다.정량 된 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 크기 별로 분리하였다.분리된 단백질을 PVDFmembrane에 옮긴 후,PVDFmembrane 을 blocking용액(5% BSA in TBS within 0.
대상 데이터
- 목향(Saussureaeradix,옴니허브,영천)은 파쇄한 후 에탄올을 사용하여 추출하였다.추출 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다.
- 그 다음으로 55±2℃에서 회전 감압농축기(EYELA, Tokyo,Japan)로 감압농축하고 초저온냉동고 (Nihonfreezer,Japan)에서 동결한 후 동결건조 기(Labconco,USA)에서 건조하였다.목향의 최종 수율은 8.43%이었으며 냉장보관 후 DMSO 에 녹여 실험에 사용하였다.목향 추출물내의 costunolide함량 분석은 AcQUITY UPLCTM System (Waters,UK)으로 분석하여 179.
데이터처리
- 윈도우용 SPSS 18.0을 사용하여 분산분석 (ANOVA test)을 실시하였으며,유의한 결과가 나온 경우 Turkeyposthoctest를 시행하여 비교분석하였다.유의수준은 5%로 설정하여 미만인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
- 1.목향추출물을 처리한 A549cell에서 세포 사멸이 관찰되었으나,항산화제인 NAC을전 처리한 경우 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되었다. 그 결과 목향추출물은 활성산 소종을 유발시켜 세포독성을 유발하는 것을 확인하였다.
- 2.세포 내에서 활성산소종 조절에 관여하는 단백질인 Nrf2의 활성정도를 측정한 결과 목향추출물을 처리한 경우 농도의존적으로 감소되는 것이 관찰되었으며, 거기에 따른 GSH의 감소도 확인되었다.
- 목향추출물의 A549cells에서의 세포독성을 평가하고자 MTT assay를 실시하였다. 24시간의 0,1,5,15,그리고 30㎍/㎖ 목향추출물이 처리된 A549cells에서 세포 생존율이 농도-의존 적으로 감소하였다(Fig1A).뿐만 아니라,15또는 30㎍/㎖ 목향추출물의 처리는 시간에 따라 세포 수가 감소되었다(Fig1B).
- 3.이상의 결과를 볼 때 목향추출물은 A549 cell에서 활성산소종 조절에 관여하는 단백 질은 Nrf2를 억제하여 GSH감소를 유도하여 세포 내 활성산소종을 증가시킴으로써 세포독성을 나타내는 것으로 확인되었다.
- 결론적으로,목형추출물은 A549세포의 생존을 효과적으로 억제시켰다;이러한 세포독성은 Nrf2경로의 억제로 Nrf2에 의해 조절되는 GSH 합성이 억제와 ROS증가로 인해 목향이 효과적으로 세포독성이 유발되는 것으로 보인다. 이러한 결과는 Nrf2의 과발현 상태인 A549 폐암세포에 있어서 세포의 과민성을 높여 항암 작용을 증진시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 뿐만 아니라, 우리는 세포의 형태변화의 관찰을 통해 NAC 처리가 세포 생존에 영향을 미친 것을 확인하여 (Fig3C),이를 확인하기 위해,NAC을 전처리한 A549cell에서 세포독성을 MTT assay를 이용하여 생존율을 확인하였다.그 결과 NAC전 처리에 의해서 목향추출물의 세포독성이 크게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig3D).따라 서,이러한 결과를 종합해 보았을 때 ROS가 목향이 유발하는 세포독성에서 매우 중요한 요인 임을 확인할 수 있었다.
- 목향에 의해 유발된 세포독성이 ROS와 연관이 있는지 조사하고자,목향추출물 처리에 따른 A549세포에서의 ROS변화를 살펴 보았다.그 결과 목향추출물에 의해 ROS생성이 크게 증가하였고,뿐만 아니라 항산화제 NAC 의 전처리는 A549세포의 세포독성을 현저하게 감소시켰다.이러한 증거들은 A549세포에서 목향추출물에 의해 생성된 ROS가 세포독성에 있어서 중요한 인자라는 것을 제시하고 있다.
- 목향추출물을 처리한 A549cell에서 세포 사멸이 관찰되었으나,항산화제인 NAC을전 처리한 경우 세포사멸이 감소되는 것이 관찰되었다. 그 결과 목향추출물은 활성산 소종을 유발시켜 세포독성을 유발하는 것을 확인하였다.
- A549cells에 24시간동안 0,15,그리고 30㎍/㎖ 목향추출물을 처리한 후 GSH의 변화를 관찰하 였다.그 결과,목향은 GSH 수준을 통계적으로 유의하게 농도-의존적으로 감소시켰다(Fig.4A). 또한 목향추출물이 GCL의 조절에 관여하는 Nrf2 조절을 감소시키는 것이 확인되었다(Fig.
- A549cells에서 목향추출물로 인한 세포죽음이 apoptosis인지 necrosis인지 확인하기 위해서 FACS분석을 실시하였다.그 결과,목향추출물을 처리하지 않은 군에 비해 목향추출물을 처리한 처리군에서 sub-G1phase의 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig2).
- 그 결과 NAC전 처리에 의해서 목향추출물의 세포독성이 크게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig3D).따라 서,이러한 결과를 종합해 보았을 때 ROS가 목향이 유발하는 세포독성에서 매우 중요한 요인 임을 확인할 수 있었다.
- GSH억제는 ROS증가,apoptosis증 가,그리고 산화적 자극에 대해 과민하게 한다 21) . 본 연구결과,목향추출물에 의해 Nrf2가 억제 되고,GSH가 감소되는 것을 확인하였고,이를 통해 우리는 목향추출물이 Nrf2억제 효과가 Nrf2및 하위 항산화/해독화 단백질의 발현을 억제하고 유도발현을 차단함으로써 A549세포의 세포독성에 영향을 미치는 것으로 보여지고 있다.하지만 직접적인 연관성을 입증하기 위해 서는 추가적인 연구를 통해 목향의 Nrf2경로 억제가 세포독성에 미치는 영향을 면밀하게 조사해야 할 것이다.
- 본 연구는 기존 연구와 일치하는 결과를 보였 는데,목향추출물은 농도-그리고 시간-의존적 으로 A549세포 생존율을 감소시켰고 이러한 세포사멸은 apoptosis으로 인한 것임을 확인할수 있었다.목향에 의해 유발된 세포독성이 ROS와 연관이 있는지 조사하고자,목향추출물 처리에 따른 A549세포에서의 ROS변화를 살펴 보았다.
- 7),17) . 이러한 특징을 보이는 A549세포를 이용하여, 본 연구에서는 Nrf2에 대한 목향의 효과를 조사한 결과 목향추출물에 의한 GSH 억제는 목향의 세포독성을 효과적으로 유도하는 데 관여했을 것으로 예상되며,목향추출물이 Nrf2를 억제 시킴으로써 GSH의 수준에 영향을 미쳤을 것으로 추측된다.
후속연구
- 암세 포에서 이런 상태는 Nrf2하위 항산화 단백질들의 적극적 증가에 관여하고 암세포의 생존에 원인으로 작용할 가능성 역시 제시하고 있다 4)-6) . 이러한 보고에 근거를 두어,선택적으로 Nrf2 경로를 억제하는 방법은 암세포의 생존을 방해 하고 더불어 항암제에 대한 감수성을 촉진시키는 효과적인 방법이 될 수 있을 제안하고 있다. A549세포-Nrf2를 조절하는 단백질인 keap1돌 연변이 폐암 세포주-는 해독화 효소와 같은 항산화 효소,thiol단백질군(thioredoxin,peroxiredoxin),GSH 합성 및 유지 관련 효소(GCL) 및 catalase등이 keap1이 정상적으로 작용하는 세포에 비해 높게 유지되는 특징을 보임으로써 항암약물에 대한 민감도를 감소시키게 된다.
- 본 연구결과,목향추출물에 의해 Nrf2가 억제 되고,GSH가 감소되는 것을 확인하였고,이를 통해 우리는 목향추출물이 Nrf2억제 효과가 Nrf2및 하위 항산화/해독화 단백질의 발현을 억제하고 유도발현을 차단함으로써 A549세포의 세포독성에 영향을 미치는 것으로 보여지고 있다.하지만 직접적인 연관성을 입증하기 위해 서는 추가적인 연구를 통해 목향의 Nrf2경로 억제가 세포독성에 미치는 영향을 면밀하게 조사해야 할 것이다.뿐만 아니라 정상 세포에서의 목향에 의한 Nrf2의 경로가 영향도 살펴봐야할 것이다.
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