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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 아직까지 많은 논란이 제기 되고 있는 다양한 유전독성에 대한 비타민 C의 방호효과를 확인하기 위하여, 실제 생활에서 쉽게 노출될 수 있는 세포독성물질인 H2O2, HgCl2 그리고 자외선과 강력한 발암성을 가진 것으로 알려진 MNNG와 4NQO 등의 유전독성물질에 의해 나타나는 유전독성을 효과적으로 방호하는지를, DNA 수준에서 직접적으로 확인 할 수 있는 유전독성시험인 Comet assay를 이용하여 비교 분석하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 CHO-K1 세포는 서울의대 삼성암연구소 부설 한국세포주은행에서 구입하였으며, CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에서 10% BS (Bovine Serum, Gibco, USA), Penicillin G (한독약품, KOR), Streptomycin (Sigma, USA)이 포함된 RPMI-1640 (Sigma, USA)을 사용하여 2~3일 간격으로 계대배양하며 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 4 M Tris buffer로 중화시킨 후, 70% ethanol로 탈수 시켜 실온에서 완전히 건조한 뒤 ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 형광현미경으로 40배율로 관찰하였다. 각각의 slide 별로 50개 세포를 임의로 선택하여 Olive tail moment (OTM)의 평균 및 표준편차를 Kinetic Komet 5.5 analysis program을 이용하여 구하였고, Sigma stat 3.5 program을 이용하여 통계적 유의성을 조사하였다(p＜0.05).
- 5 그리고 10 J만큼 조사하였다. 독성물질의 처리와 염색이 끝난 세포를 혈구계수기를 이용하여 총 500개의 세포 중에서 푸르게 염색되어 있는 죽은 세포의 수를 세어 생존율(살아있는 세포수 / 총세포수)을 계산하였으며, Sigma stat 3.5 program을 이용하여 통계적 유의성을 조사하였다(p＜0.05). PBS 또는 배양액만 처리한 대조군의 생존율을 100%로 하여 이의 80%에 해당하는 생존율을 보이는 농도를 독성물질 처리 최고 농도로 설정하여 1/2, 1/4로 희석하여 처리하였다.
이론/모형
- H2O2, HgCl2, 자외선, MNNG, 4NQO 및 비타민 C의 세포독성을 확인하고, 독성물질의 유전독성 및 비타민 C의 방호효과를 측정하기 위한 Comet assay의 처리 농도를 결정하기 위하여 Trypan blue exclusion assay로 CHO-K1 세포의 생존율을 측정하였다. 배양기에서 24 시간 동안 단층배양한 후 세포에 10, 100 nM, 1, 10, 100 μM 및 1 mM의 농도로 H2O2, HgCl2, MNNG, 4NQO 그리고 비타민 C를 원하는 시간 동안 처리하였으며, 자외선은 자외선등(파장 254 nm, Philips TUV, 6 W)을 사용하여 1.
- 더 나아가 암, 신경변성, 염증, 세포사멸 및 알츠하이머병의 치료에 관여한다는 보고[5, 6]가 있다. 따라서 유전독성에 대한 비타민 C의 방호효과를 확인하고자 Comet assay를 이용하여 시험하였다. 시험 결과, 비타민 C를 10 μM 이하로 병용 처리하였을 경우에는 유전독성물질을 단독 투여했을 때에 비해서 DNA 손상이 감소되었으며, 방호효과는 비타민 C의 농도 의존적임이 밝혀졌다.
성능/효과
- Trypan blue exclusion assay에서 H2O2, HgCl2, 자외선, MNNG 그리고 4NQO가 세포독성을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 이들이 유전독성을 가지고 있는 지를 확인하기 위하여 Comet assay를 이용하여 시험한 결과, 시험에 사용한 모든 시험물질에서 DNA에 손상을 주는 유전독성을 확인 할 수 있었으며, 이들의 유전독성은 농도 의존적으로 DNA 손상을 일으킨다는 것을 확인하였다(Table 2).
- 이와 같은 결과는 비타민 C가 강력한 항산화제로써, 1차적인 항산화작용을 담당하는 것으로 세포외액과 세포내의 세포질에 존재하며 유전독성물질과 직접적으로 작용하거나 항산화효소를 활성화하여 다양한 방식의 유전독성에 효과적으로 방호한다는 것을 보여 주는 것으로 생각된다. 그러나 이와는 달리 비타민 C 후처리에서의 결과는 일단 유전독성물질에 의해서 DNA 손상이 유발된 경우에는 효과적으로 방호를 하지 못한다는 것을 보여주는 것으로 생각된다. 4NQO의 경우 in vivo 실험에서 암의 발생, 증식, 전이를 억제한다는 실험결과[13, 14]가 있을 뿐, 어떤 기작에 의하여 DNA 손상이 이루어지는지 아직 정확히 밝혀져 있지 않다.
- 따라서 본 연구 결과, 비타민 C는 1차적인 항산화작용을 담당하는 강력한 항산화제로써, 유전독성물질에 의해서 유발되는 DNA 손상 방호에 긍정적인 영향을 주는 것으로 생각되어지나, 여러 유전독성물질에 의해서 일어나는 다양한 방식의 DNA 손상 기작을 모두 방호하지 못한다고 생각된다. 한편, 최근에 비타민 C와 비타민C를 환원시켜주는 효소인 Glutathione을 병용 처리 하였을 때 DNA 손상이 매우 감소한다는 보고가 있으며, 과산화수소에 의한 산화적 스트레스와 γ-irradiation에 의한 DNA 손상을 복구하는 체계가 다르게 작용한다는 보고가 있다[20].
- 비타민 C의 방호효과가 나타난 H2O2, HgCl2, 자외선 그리고 4NQO를 시험물질로 하여 비타민 C를 전처리 한 다음, 시험물질들을 후처리 한 시험군에서는 유전독성에 의한 DNA 손상이 다소 감소하는 것으로 나타났다(Table 4). 또한, 시험물질을 전처리 한 다음 비타민 C를 후처리 한 시험군에서는 H2O2, HgCl2, 그리고 4NQO에서 유전독성에 의한 DNA 손상이 감소하지 않은 반면에(Table 4) 자외선을 전처리하고 비타민 C를 후처리 한 시험군에서는 비타민 C를 전처리하고 자외선을 후처리 한 시험군과 비슷한 수준의 방호효과가 나타났다.
- 뿐만 아니라 비타민 C에서도 농도 의존적으로 세포독성이 나타나는 것을 확인 할 수 있었다(Table 1). 이러한 결과는 비타민 C가 염색체 이상 및 여러 종류의 돌연변이 유발시험에서 양성으로 나타난 기존의 보고[3, 4, 11, 15]와 일치하며, 비타민 C 자체가 돌연변이 유발원이 될 수 있다는 것을 확인시켜주는 것으로 생각된다.
- 세포독성물질로 알려져 있는 H2O2, HgCl2, 자외선, MNNG 그리고 4NQO의 세포독성 및 유전독성을 확인하기 위해 실시한 Trypan blue exclusion assay와 Comet assay의 결과로 미루어 볼 때, H2O2, HgCl2, 자외선, MNNG 그리고 4NQO의 세포독성과 유전독성은 농도 의존적으로 DNA 손상과 세포사멸에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었으며(Table 1, Table 2), 이러한 결과는 기존의 보고들과 같은 결과를 보였다[1, 7, 9, 24].
- 따라서 유전독성에 대한 비타민 C의 방호효과를 확인하고자 Comet assay를 이용하여 시험하였다. 시험 결과, 비타민 C를 10 μM 이하로 병용 처리하였을 경우에는 유전독성물질을 단독 투여했을 때에 비해서 DNA 손상이 감소되었으며, 방호효과는 비타민 C의 농도 의존적임이 밝혀졌다. 이 같은 결과로 보아 비타민 C가 H2O2, HgCl2 그리고 4NQO에 의해 유발된 DNA 손상을 방호하는데 효과가 있음을 알 수 있었다(Table 3).
- 시험 결과, 비타민 C를 10 μM 이하로 병용 처리하였을 경우에는 유전독성물질을 단독 투여했을 때에 비해서 DNA 손상이 감소되었으며, 방호효과는 비타민 C의 농도 의존적임이 밝혀졌다. 이 같은 결과로 보아 비타민 C가 H2O2, HgCl2 그리고 4NQO에 의해 유발된 DNA 손상을 방호하는데 효과가 있음을 알 수 있었다(Table 3). 즉, 위의 결과는 비타민 C가 강력한 항산화물질이라는 것을 확인시켜주는 것으로 생각되며, 친핵성을 갖는 비타민 C가 친전자성을 갖는 유전독성물질에 의해 유발된 DNA 손상을 감소시켰다는 이전의 연구와 일치한다[21, 22].
- , 자외선, MNNG 그리고 4NQO가 세포독성을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 이들이 유전독성을 가지고 있는 지를 확인하기 위하여 Comet assay를 이용하여 시험한 결과, 시험에 사용한 모든 시험물질에서 DNA에 손상을 주는 유전독성을 확인 할 수 있었으며, 이들의 유전독성은 농도 의존적으로 DNA 손상을 일으킨다는 것을 확인하였다(Table 2). 이러한 결과는 시험에 사용한 시험물질이 DNA 단일 또는 이중 가닥의 손상 그리고 염색체 돌연변이를 일으킨다는 기존의 보고[1, 24]와 일치하였다.
- 또한, 시험물질을 전처리 한 다음 비타민 C를 후처리 한 시험군에서는 H2O2, HgCl2, 그리고 4NQO에서 유전독성에 의한 DNA 손상이 감소하지 않은 반면에(Table 4) 자외선을 전처리하고 비타민 C를 후처리 한 시험군에서는 비타민 C를 전처리하고 자외선을 후처리 한 시험군과 비슷한 수준의 방호효과가 나타났다. 이와 같은 결과는 비타민 C가 강력한 항산화제로써, 1차적인 항산화작용을 담당하는 것으로 세포외액과 세포내의 세포질에 존재하며 유전독성물질과 직접적으로 작용하거나 항산화효소를 활성화하여 다양한 방식의 유전독성에 효과적으로 방호한다는 것을 보여 주는 것으로 생각된다. 그러나 이와는 달리 비타민 C 후처리에서의 결과는 일단 유전독성물질에 의해서 DNA 손상이 유발된 경우에는 효과적으로 방호를 하지 못한다는 것을 보여주는 것으로 생각된다.
- 이러한 결과는 비타민 C가 직접적으로 자외선(UV-B와 C)과 결합하지 못하기 때문으로 생각된다. 즉, 비타민 C에 의해 방호되지 못한 자외선이 DNA에 직접 흡수되었고 이로 인해 DNA에 피리미딘 이량체가 생성되어 유전독성이 나타난 반면에 DNA에 흡수되지 않는 자외선(UV-A)에 의하여 생성되어진 산화적 스트레스는 비타민 C가 방호함으로써 다소나마 자외선에 방호효과가 있는 것으로 나타난 것으로 생각된다. 한편 MNNG와 NMOR에 의하여 유발된 DNA 손상의 회복에 미치는 비타민 C의 방호효과에 대한 Sona의 연구에서는 MNNG와 NMOR은 N-nitroso compounds (NNC)의 같은 그룹의 물질로 두 물질 모두 DNA 메틸화를 유발하지만 ‘MNNG는 신진대사 활성화를 필요로 하지 않는 직접-행동 알킬화제이지만, N-nitrosomorpholine (NMOR)은 Nitroreductase에 의한 신진대사 활성화를 필요로 하는 간접-행동 알킬화제로 DNA 손상을 유발하는 기작이 서로 달라, 비타민 C가 MNNG의 유전독성은 방호하지 못하지만 NMOR의 유전독성은 방호하는 것으로 보고하고 있으나 이에 대한 구체적인 기작에 대해서는 설명하고 있지 않다[24].
- 3). 즉, 유전독성물질의 처리 시간이 증가함에 따라 약 2 시간을 전·후하여 DNA 손상이 일정해짐을 알 수 있었으며, 유전독성물질을 제거한 경우에는 H2O2, HgCl2, MNNG 및 4NQO에서 약 3 시간을 전․후하여 DNA의 손상이 점차 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이는 기존의 DNA 복구 시험 및 이와 관련된 보고에서 확인할 수 있다[12, 16, 18].
- 한편 Comet assay를 이용하여 유전독성물질의 처리 시간에 따른 DNA 손상을 측정한 결과, 유전독성물질이 존재하는 상태에서는 DNA 손상이 일시적인 것이 아니라 지속적으로 이루어진다는 것을 확인할 수 있었으며(Fig. 2), 유전독성물질이 제거된 상태에서는 DNA 복구 기작을 통해서 DNA 손상이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
후속연구
- 이외에도 MNNG에 의한 DNA 손상에 있어 비타민 C의 구체적인 방호기작에 대해서는 밝혀진 바 없다. 따라서 본 연구에서 비타민 C가 MNNG에 의해 유도된 DNA 손상을 방호하지 못한 것 역시 MNNG의 DNA 손상 기작에 대해 비타민 C가 대응하지 못한 것으로 판단될 뿐, 그 구체적인 기작에 대해서는 더 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 이상의 결과에서 비타민 C의 항돌연변이 효과는 돌연변이 유발원의 종류에 따라 상이하게 나타난다고 알려진 연구들의 결과[17, 19, 24]와 일치하는 것으로 생각된다.
- 이러한 이유 때문에 현재까지도 비타민 C가 학자들 사이에 많은 논란이 되고 있다. 따라서 이러한 논란을 해결하기 위해서는 비타민 C의 분자생물학적 항산화 방호 기작(antioxidant defense mechanism)에 대한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 판단된다.
- 4NQO의 경우 in vivo 실험에서 암의 발생, 증식, 전이를 억제한다는 실험결과[13, 14]가 있을 뿐, 어떤 기작에 의하여 DNA 손상이 이루어지는지 아직 정확히 밝혀져 있지 않다. 이러한 연구결과 등을 종합해 볼 때, 본 연구에서 비타민 C가 4NQO에 의해 유발된 DNA 손상을 감소시키는 기작을 밝히기 위해서는 보다 많은 연구가 이루어 져야 할 것으로 생각된다.
- 한편, 최근에 비타민 C와 비타민C를 환원시켜주는 효소인 Glutathione을 병용 처리 하였을 때 DNA 손상이 매우 감소한다는 보고가 있으며, 과산화수소에 의한 산화적 스트레스와 γ-irradiation에 의한 DNA 손상을 복구하는 체계가 다르게 작용한다는 보고가 있다[20]. 이러한 연구처럼 앞으로 DNA 복구 체계에 대한 연구, 여러 항산화물질과 항산화효소를 병용 처리 하였을 경우에 이들 간의 시너지 효과 및 방호기작에 대한 연구 및 DNA 복구 체계의 연관성에 대해서 많은 연구가 필요할 것으로 판단된다. 비록 비타민 C가 다른 항산화물질에 비해 많이 연구된 항산화물질이기는 하지만 아직 다양한 항산화작용 기작에 대해 정확하게 밝혀진 것이 많지 않다.
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