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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 RAPD, AFLP 등의 무작위(random) 분자표지를 사용하지 않고, 유전자 연관지도 작성에 사용할 양친의 대량 염기서열 분석(NGS resequencing)을 통해 위치 정보가 알려져 있는 COSII 분자표지를 선택적으로 선발하여 SNP(HRM) 분자표지로 개발한 후, 이를 이용하여 고추 유전자 연관지도를 쉽고 빠르게 작성할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.
- zSNP (HRM) markers developed in this study.
제안 방법
- 또한 해독된 염기서열을 바탕으로 ‘NB1’과 ‘Jolokia’ 사이를 비교하여 SNP를 탐색하였다.
- 유전자지도 작성용 양친인 ‘NB1’과 ‘Jolokia’를 next generation resequencing 방법으로 유전체 염기서열을 해독하였다.
- 마지막으로 95°C에서 10초간 denaturation 반응을 시킨 후, 68°C에서 90°C까지 0.2°C씩 올리면서 각 온도에서 5초간 유지하는 동안 형광을 측정하여 HRM melting 그래프를 그렸고, Precision Melt Analysis 프로그램(Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 유전자형을 분석하였다.
- PCR 반응은 CFX96을 이용하여 98°C에서 초기 denaturation을 수행한 뒤, 95°C에서 10초간 denaturation과 60°C에서 20초간 annealing하는 과정을 40회 반복하였다.
- PCR 반응액은 genomic DNA 10ng, 10× PCR buffer 2µL(ELPIS Bio, Korea), 10mM dNTP mixture 1µL(ELPIS Bio), rTaq PLUS polymerase 0.1µL(ELPIS Bio), LCGreenⓇ Plus+ Melting Dye 1µL(BioFire Diagnostics, UT, USA), 각 분자표지에 해당하는 한 쌍 각각의 10pmole･µL-1 프라이머(Table 2) 1µL, 그리고 멸균된 삼차증류수로 총 20µL로 맞추었다.
- 추출된 DNA는 100ng･µL-1 농도로 맞추어 총 10μg을 NGS resequencing에 사용하였다. NGS resequencing 및 생물정보학적인 분석은 ㈜씨더스(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 수행하였다.
- , 1993). 연관 그룹은 LOD 4.0과 최대거리 30cM을 기준으로 하여 나누었다. 또한 연관 거리는 Kosambi(1944) 계산식을 사용하여 산출하였다.
- 앞에서 개발된 116개의 SNP 분자표지와 1개의 SSR 분자표지(Hpms1-117)를 사용하여 NB1 × Jolokia-F2 분리집단 94개체에 분석함으로써 고추 유전자지도를 작성할 수 있었다(Fig. 2).
- 앞에서 탐색한 176만개의 SNP는 그 수가 너무 많아 모두 분자표지로 개발한다는 것은 불가능에 가깝다. 본 연구는 QTL mapping 분석에 사용할 수 있는 고추 유전자지도를 쉽고 빠르게 작성할 수 있는 방법을 제시하기 위한 것이기 때문에 고추 유전자지도 전체를 포함하는 분자표지를 일부 선발하여 분석에 사용하였다. 따라서, 고추 유전자지도 내고르게 분포되어 있는 SNP를 선발하여야 하는데, 이를 위해 이미 고추 유전자지도 내 위치가 보고되어 있는 2,122개의 COSII 분자표지 염기서열을 사용하여 SNP를 선발하였다(Bombarely et al.
- 본 연구에서 HRM 분자표지 개발 성공 확률이 80%였다. 개발된 HRM 분자표지는 선발할 때 사용한 COSII 분자표지, 본 연구에서 작성한 유전자지도에서의 연관군 및 위치, 그리고 COSII 분자표지 염기서열에 해당하는 유전자 정보를 Table 2에 리스트하였다.
대상 데이터
- 2010년에 Capsicum annuum ‘NB1’을 모계로 사용하고 인도에서 도입된 C. chinense ‘Jolokia’를 부계로 사용하여 교배한 F1을 자가수정하여 F2 종자를 확보하였다.
- chinense ‘Jolokia’를 부계로 사용하여 교배한 F1을 자가수정하여 F2 종자를 확보하였다. 2011년에 F2 세대의 종자를 파종, 육묘, 정식하여 94개 식물체에서 잎을 채취하여 유전자 연관지도 작성에 사용하였다.
- 본 연구는 QTL mapping 분석에 사용할 수 있는 고추 유전자지도를 쉽고 빠르게 작성할 수 있는 방법을 제시하기 위한 것이기 때문에 고추 유전자지도 전체를 포함하는 분자표지를 일부 선발하여 분석에 사용하였다. 따라서, 고추 유전자지도 내고르게 분포되어 있는 SNP를 선발하여야 하는데, 이를 위해 이미 고추 유전자지도 내 위치가 보고되어 있는 2,122개의 COSII 분자표지 염기서열을 사용하여 SNP를 선발하였다(Bombarely et al., 2011; Wu et al., 2009). 이미 고추와 토마토 유전자지도는 COSII 분자표지를 이용하여 서로 자세하게 비교되어 있기 때문에 쉽게 분자표지의 위치를 파악할 수 있었다(Wu et al.
- , 2009). 이 중에서 최종적으로 145개의 COSII 분자표지를 선발하여 SNP 분자표지 개발에 사용하였다(Table 2).
- 1. Patterns of two HRM markers, 144075 (A) and 565921 (B), developed in this study. A, Plants of ‘NB1’ genotype; B, Plants of ‘Jolokia’ genotype; H, Heterozygous plants.
데이터처리
- 또한 연관 거리는 Kosambi(1944) 계산식을 사용하여 산출하였다. 최종 연관 지도는 MAPCHART v. 2.1 프로그램을 사용하여 그렸다(Voorrips, 2002).
이론/모형
- 5mL 튜브에 채취하여 Prince et al.(1997)의 방법대로 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 100ng･µL-1 농도로 맞추어 총 10μg을 NGS resequencing에 사용하였다.
- HRM 분석(high resolution melting analysis; Wittwer et al., 2003)은 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응액은 genomic DNA 10ng, 10× PCR buffer 2µL(ELPIS Bio, Korea), 10mM dNTP mixture 1µL(ELPIS Bio), rTaq PLUS polymerase 0.
- 0과 최대거리 30cM을 기준으로 하여 나누었다. 또한 연관 거리는 Kosambi(1944) 계산식을 사용하여 산출하였다. 최종 연관 지도는 MAPCHART v.
- SNP 유전자형 분석은 방법이 간편하고 비용이 상대적으로 저렴한 HRM 분석 방법을 사용하였다(Wittwer et al., 2003). 특히 SNP는 서로 구분이 잘 되는 A/G, A/C, T/G 및 T/C 조합만 선발하여 프라이머를 디자인하였다(Wittwer et al.
성능/효과
- 그 결과, ‘NB1’은 고추 reference genome(2.6Gbp)의 1.74배에 해당하는 4.6Gbp를 읽었고, ‘Jolokia’는 2.32배에 해당하는 6.2Gbp를 읽었다(Table 1).
후속연구
- 본 연구에서 사용한 고추 유전자지도 작성 방법은 집단만 만들어져 있다면 두 달 내에 유전자지도 작성을 완료할 수 있기 때문에 QTL mapping에 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 또한 이 방법은 분자표지 위치 예측이 상당히 정확하기 때문에 특정 위치를 fine mapping할 때도 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
- 본 연구에서 사용한 고추 유전자지도 작성 방법은 집단만 만들어져 있다면 두 달 내에 유전자지도 작성을 완료할 수 있기 때문에 QTL mapping에 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 또한 이 방법은 분자표지 위치 예측이 상당히 정확하기 때문에 특정 위치를 fine mapping할 때도 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
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