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문제 정의
- 이 연구는 주로 경기 지역 남부와 충남 소재의 양돈장에서 도축 출하되는 비육돈에 대한 폐 병변 육안 검사, 세균분리, 혈청형 동정, ELISA를 이용한 혈청학적 분석을 통해 경기도 지역과 인근 지역에서 유행하고 있는 APP 감염실태와 혈청형 분포를 더욱 정확히 파악하여 향후 효과적인 질병 방제를 위한 대책을 제시하고 관련 검사기법을 정립하여 지속적인 모니터링 체계를 구축하는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- Multiplex PCR에 AccuPowerⓇ multiplex PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하였으며 template DNA 1 μL, primer mix 2 μL (각각 2 pmole/μL), DNase free water 17 μL를 첨가하여 총량 20 μL에 제품설명서의 반응 조건을 적용했으며, 일반 PCR은 AccuPowerⓇ PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하여 template-DNA 4 μL, primer 2 μL (10 pmole/μL), DNase free water 14 μL를 첨가하여 총량 20 μL에 문헌의 반응조건을 적용하였다.
- Multiplex PCR에 AccuPowerⓇ multiplex PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하였으며 template DNA 1 μL, primer mix 2 μL (각각 2 pmole/μL), DNase free water 17 μL를 첨가하여 총량 20 μL에 제품설명서의 반응 조건을 적용했으며, 일반 PCR은 AccuPowerⓇ PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하여 template-DNA 4 μL, primer 2 μL (10 pmole/μL), DNase free water 14 μL를 첨가하여 총량 20 μL에 문헌의 반응조건을 적용하였다. PCR 증폭산물은 전기영동자동화장비(Multina, Shimadzu, Japan)를 사용하여 특이밴드를 확인하였다.
- 2011년 7월부터 2012년 11월까지 경기도 소재 도축장(안양 협신, 화성 스마일, 부천 농협)에 출하된 돼지에 대해 농가당 20두씩 총 2,204두에 대한 폐 병변 육안검사를 실시하였다. 검사 항목으로는 폐에서 병변이 확인되는 위치, 진행경과, 농양의 숫자, 크기 등을 조사하였으며, 대부분 경기 지역과 일부 충남지역의 농가를 대상으로 검사를 진행하였다.
- Oliveira (2009)는 동일한 실험조건에서 준임상형 APP 감염을 찾아내기 위해 ELISA 종류별 성능 비교를 시도하였다. 당시 apxIV antibody ELISA kit(IDEXX)의 QA/QC 문제로 인해 이를 제외한 serotype-specific ELISA (Biovet)와 multi-APP ELISA(University of Montreal)를 사용하여 1, 3, 5, 7, 10, 12, 15형의 균주를 실험적으로 감염시킨 각각의 그룹에 대해 감염 후 49일 시점까지 주단위로 비교 실험을하였으며 편도와 폐의 균 분리와 PCR이 병행되었다. 두 제품 모두 LC-LPS를 항원으로 하는 같은 방식임에도 검사 결과의 일관성과 초기의 혈청양전을 감지하는 민감도에 중요한 차이점이 확인되었다.
- 도축장에서 육안검사를 통해 흉막폐렴으로 의심되는 폐 병변 부위를 무균적으로 채취하고 5℃ 냉장 상태에서 실험실로 운반하여 6시간 이내에 세균분리를 시도하였다. 접종 방법은 폐 병변 부위를 무균적으로 절개하고 멸균된 면봉으로 절개면을 충분히 문지른 뒤 준비된 용액이 담긴 1.
- 접종 방법은 폐 병변 부위를 무균적으로 절개하고 멸균된 면봉으로 절개면을 충분히 문지른 뒤 준비된 용액이 담긴 1.5 mL 튜브에 40분간 정치하였으며, 이후 초콜릿 한천배지(한일코메드, 한국)에 접종하여 10% CO2 37℃ 인큐베이터에 18∼24시간 배양하였다.
- 준비된 용액은 기존의 선택배지 제조법(Branka 등, 2004)을 변형하여 NAD (Sigma, USA), bacitracin (Sigma, USA), lincomycin (Sigma, USA), nystantin (Sigma, USA)을 각각 0.0025%, 8 IU/mL, 2μg/mL, 450 μg/mL의 농도로 혼합하여 필터를 통과시킨 멸균 용액이며, 사용 편의를 위해 1.5 mL 튜브에 300 μL씩 분주하여 -40℃에 냉동 보관하여 사용하였다.
- 폐 병변 육안검사와 균 분리 및 혈청형 동정 결과를 토대로 APP 균주가 분리된 농장에서 흉막폐렴 증상이 관찰된 개체들을 혈청형별로 그룹화하여 감염 경과, 농양 개수, 병변 크기를 비교하였다. 그 결과 감염 경과는 [acute/subacute/chronic] 1형(n=11) [0.
대상 데이터
- 2011년 7월부터 2012년 11월까지 경기도 소재 도축장(안양 협신, 화성 스마일, 부천 농협)에 출하된 돼지에 대해 농가당 20두씩 총 2,204두에 대한 폐 병변 육안검사를 실시하였다. 검사 항목으로는 폐에서 병변이 확인되는 위치, 진행경과, 농양의 숫자, 크기 등을 조사하였으며, 대부분 경기 지역과 일부 충남지역의 농가를 대상으로 검사를 진행하였다.
- 도축장 병변검사와 함께 농가당 5두 내외의 혈액 시료를 무작위로 채취하였으며 83농가 452두의 혈청을 수집하여 -40℃에 냉동 보관하였다. 이후 수집된 혈청에 대한 APP 항체 수준을 검사하기 위해 시판중인 APP apxIV antibody ELISA kit (IDEXX, USA), APP [1, 9, 11], [2], [3, 6, 8], [4, 7], [5a, 5b], [10], [12] antibody test kit (Biovet, Canada)을 사용하였으며 실험 방법은 각 제조사의 설명서에 따라 수행되었다.
- 이 연구에서는 도축장에서 수집된 452점(83농가)의 혈청에 대해 serotype specific antibody ELISA kit와 apxIV antibody ELISA kit를 실험에 사용하였다. 전자는 혈청형 그룹(1, 9, 11; 2; 3, 6, 8; 4, 7; 5a, 5b; 10;12)을 동정하기 위한 7가지의 키트로 구성되어 있으며, 후자는 apxIV 항체를 검출하기 위한 단일키트로 혈청형 감별은 불가능하지만 특이도가 매우 높다는 장점이 있다.
이론/모형
- 순수 배양된 세균 집락은 동물질병표준검사법(국립수의과학검역원, 2008)에 따라 boiling법으로 DNA를 추출하였으며, −20℃에서 보관하면서 PCR을 위한 template DNA로 사용하였다. APP 혈청형 분포 조사를 위한 PCR은 공통유전자와 1, 7 및 12 혈청형은 Angen 등(2008), 2, 5 및 6 혈청형은 Jessing 등(2003), 그리고 8 혈청형은 Schuchert 등(2004)이 제시한 염기서열을 이용하여 1차 동정을 실시하였으며, 2차로 Gram 등(2000)과 Serrano-Rubio 등(2008)이 각각 제시한 apx/omlA와 biovar 1, 2형 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 혈청형을 최종 동정하였다(Table 1). Multiplex PCR에 AccuPowerⓇ multiplex PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하였으며 template DNA 1 μL, primer mix 2 μL (각각 2 pmole/μL), DNase free water 17 μL를 첨가하여 총량 20 μL에 제품설명서의 반응 조건을 적용했으며, 일반 PCR은 AccuPowerⓇ PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하여 template-DNA 4 μL, primer 2 μL (10 pmole/μL), DNase free water 14 μL를 첨가하여 총량 20 μL에 문헌의 반응조건을 적용하였다.
- 순수 배양된 세균 집락은 동물질병표준검사법(국립수의과학검역원, 2008)에 따라 boiling법으로 DNA를 추출하였으며, −20℃에서 보관하면서 PCR을 위한 template DNA로 사용하였다.
- 도축장 병변검사와 함께 농가당 5두 내외의 혈액 시료를 무작위로 채취하였으며 83농가 452두의 혈청을 수집하여 -40℃에 냉동 보관하였다. 이후 수집된 혈청에 대한 APP 항체 수준을 검사하기 위해 시판중인 APP apxIV antibody ELISA kit (IDEXX, USA), APP [1, 9, 11], [2], [3, 6, 8], [4, 7], [5a, 5b], [10], [12] antibody test kit (Biovet, Canada)을 사용하였으며 실험 방법은 각 제조사의 설명서에 따라 수행되었다.
성능/효과
- 두 제품 모두 LC-LPS를 항원으로 하는 같은 방식임에도 검사 결과의 일관성과 초기의 혈청양전을 감지하는 민감도에 중요한 차이점이 확인되었다. MultiAPP ELISA에서 검사 결과의 일관성이 더 높게 나타났으며 serotype-specific ELISA보다 1주 빠르게 혈청 양전을 감지하였다. 또한 serotype-specific ELISA의 혈청형별 교차실험을 통해 교차반응이 없음을 확인하여 전자는 돈군의 스크리닝에 후자는 혈청형 감별에 적합하다는 결론을 내렸다.
- 전자는 혈청형 그룹(1, 9, 11; 2; 3, 6, 8; 4, 7; 5a, 5b; 10;12)을 동정하기 위한 7가지의 키트로 구성되어 있으며, 후자는 apxIV 항체를 검출하기 위한 단일키트로 혈청형 감별은 불가능하지만 특이도가 매우 높다는 장점이 있다. Serotype-specific ELISA 검사 결과 [2]형의 항체 양성률은 19.1% (77/404)로 가장 높은 비율로 나타났으며 다음으로 [3, 6, 8]형, [5a, 5b]형, [4, 7]형 순으로 각각 7.1% (32/452), 6.9% (28/404), 6.2% (28/452)의 비슷한 양성률을 나타냈다. 이는 그동안 국내에서 주로 균 분리에 의한 혈청형 분포 조사 결과와는 다른 것으로 [3, 6, 8]형과 [4, 7]형의 준임상형 감염이 국내에 상재하고 있음을 의미하는 것이다.
- 경기도 소재 양돈농가의 APP 혈청형 분포 및 감염률 조사를 위해 도축장에 출하된 비육돈 2,204두(110농가) 중 폐 병변의 균 분리 및 동정 결과 2형과 5형이 75% (36/48)를 차지하였으며, 혈청형별 폐 병변을 비교한 결과 5형의 병원성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한, 2011년 1형이 국내에서 처음 분리 보고된 이후 이번 연구에서도 3개 균주가 분리되었으며, 12형은 apx/omlA 및 biovar 유전자 검사에서 모두 비정형 패턴을 보였다.
- 폐 병변 육안검사와 균 분리 및 혈청형 동정 결과를 토대로 APP 균주가 분리된 농장에서 흉막폐렴 증상이 관찰된 개체들을 혈청형별로 그룹화하여 감염 경과, 농양 개수, 병변 크기를 비교하였다. 그 결과 감염 경과는 [acute/subacute/chronic] 1형(n=11) [0.0%/45.5%/54.5%], 2형(n=80) [13.8%/25.0%/61.2%], 5형 (n=48) [43.8%/29.2%/25.0%], 12형(n=7) [28.6%/14.3%/57.1%]이었으며, 농양 개수는 [0개/1개/2개 이상] 1형[0.0%/90.9%/9.1%], 2형[47.5%/33.8%/18.7%], 5형[10.4%/56.3%/33.3%], 12형[0.0%/85.7%/14.3%]으로 확인되었다. 또한, 병변의 크기는 [1 cm 이하/2∼5 cm/5 cm 초과] 1형[9.
- 3% (223/452)로 전자가 후자에 비해 현저히 낮은 것으로 확인되어 Oliveira(2009)가 지적한 serotype-specific ELISA kit의 민감도 문제가 이번 실험에도 반영된 것으로 생각된다. 그밖에 농장 오염도를 분석해보면 serotype-specific ELISA에서 최소한 한 개이상의 키트에서 양성이 나온 비율이 60.2% (50/83), apxIV antibody ELISA에서는 71.1% (59/83)로 확인되어 국내의 APP 농장 오염도가 상당히 높은 수준임을 알 수 있었다(Table 4).
- 도축장에서 수집된 83농가 452점의 혈청에 대한 serotype-specific ELISA 결과 양성율은 [2]형 19.1% (77/404), [3, 6, 8]형 7.1% (32/452), [5a, 5b]형 6.9% (28/404), [4, 7]형 6.2% (28/452), [12]형 2.8% (9/320),[1, 9, 11]형 2.0% (9/452), [10]형 0.0% (0/452)로 확인되었으며, apxIV Ab ELISA 양성률은 49.3% (223/452)이었다. 또한 농가 감염률은 [2]형 35.
- 당시 apxIV antibody ELISA kit(IDEXX)의 QA/QC 문제로 인해 이를 제외한 serotype-specific ELISA (Biovet)와 multi-APP ELISA(University of Montreal)를 사용하여 1, 3, 5, 7, 10, 12, 15형의 균주를 실험적으로 감염시킨 각각의 그룹에 대해 감염 후 49일 시점까지 주단위로 비교 실험을하였으며 편도와 폐의 균 분리와 PCR이 병행되었다. 두 제품 모두 LC-LPS를 항원으로 하는 같은 방식임에도 검사 결과의 일관성과 초기의 혈청양전을 감지하는 민감도에 중요한 차이점이 확인되었다. MultiAPP ELISA에서 검사 결과의 일관성이 더 높게 나타났으며 serotype-specific ELISA보다 1주 빠르게 혈청 양전을 감지하였다.
- MultiAPP ELISA에서 검사 결과의 일관성이 더 높게 나타났으며 serotype-specific ELISA보다 1주 빠르게 혈청 양전을 감지하였다. 또한 serotype-specific ELISA의 혈청형별 교차실험을 통해 교차반응이 없음을 확인하여 전자는 돈군의 스크리닝에 후자는 혈청형 감별에 적합하다는 결론을 내렸다.
- 경기도 소재 양돈농가의 APP 혈청형 분포 및 감염률 조사를 위해 도축장에 출하된 비육돈 2,204두(110농가) 중 폐 병변의 균 분리 및 동정 결과 2형과 5형이 75% (36/48)를 차지하였으며, 혈청형별 폐 병변을 비교한 결과 5형의 병원성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한, 2011년 1형이 국내에서 처음 분리 보고된 이후 이번 연구에서도 3개 균주가 분리되었으며, 12형은 apx/omlA 및 biovar 유전자 검사에서 모두 비정형 패턴을 보였다. 앞서 기술한 균 분리에 의한 혈청형 분포와 달리 serotype-specific ELISA에서 [3, 6, 8]형, [4, 7]형 그룹의 양성률이 [5a, 5b]형과 비슷한 것으로 확인되었으며, 실제로 serotype-specific ELISA와 apxIV antibody ELISA에서 농장 감염률이 각각 60.
- 또한, 2011년 1형이 국내에서 처음 분리 보고된 이후 이번 연구에서도 3개 균주가 분리되었으며, 12형은 apx/omlA 및 biovar 유전자 검사에서 모두 비정형 패턴을 보였다. 앞서 기술한 균 분리에 의한 혈청형 분포와 달리 serotype-specific ELISA에서 [3, 6, 8]형, [4, 7]형 그룹의 양성률이 [5a, 5b]형과 비슷한 것으로 확인되었으며, 실제로 serotype-specific ELISA와 apxIV antibody ELISA에서 농장 감염률이 각각 60.2% (50/83), 71.1% (59/83)로 확인되어 국내에 준임상형 감염을 포함한 APP 오염도가 매우 높은 것이 확인되었다.
- 4%)까지 높아진다는 연구 결과가 있다(Branka 등, 2004). 여기에 사용된 항생제와 화학제제를 응용하여 이 연구에서도 앞서 재료 및 방법에서 기술한 대로 2012년 5월부터 실험에 적용한 결과 APP 분리율이 15.4% (10/65)에서 49.4% (38/77)로 34% 상승하는 효과가 있었다(Data not shown). 이 방법의 가장 큰 장점은 항생물질 첨가제를 상용화된 초콜릿 한천배지에 직접 적용하기 때문에 선택배지를 제조하는 시간과 노동력을 절감할 수 있다는 것이다.
- 90년대부터 지금까지 국내에 보고된 문헌으로는 주로 유행하는 APP의 혈청형은 2, 5형이며 그밖에 1, 3, 4, 6, 7, 10, 12형이 분리되었다(Jung과 Ja ng, 2012; Shin 등, 2011; Lee 등, 1999; Jung 등, 1996). 이번 연구 결과에서도 1, 2, 4, 5, 7, 12형 균주가 분리되었으며 이 중 2형 41.7% (20/48), 5형 33.3% (16/48)로 확인되어 경기 남부와 충남 일대의 양돈농가에 이 두 가지 혈청형이 유행하고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 그 외에 분리된 균주는 12형 10.4% (5/48), 1형 6.3% (3/48), 4형 2.1% (1/48), 7형 2.1% (1/48)을 차지하였다. 특히 Shin 등(2011)이 처음 분리한 1형 균주는 경북, 경기, 충남 지역의 시료에서 확인되었는데 이 실험에서 분리된 1형(n=3)은 충남과 충북에서 각각 분리된 것으로 국내 전역에 분포하고 있는 것으로 추정되며 향후 이에 대한 지속적인 모니터링과 함께 백신의 개선 및 개량이 시급한 것으로 보인다.
- 보통 혈청형의 병원성은 apx toxin (I, II, III)의 조합에 따라 나뉘는데 병원성이 가장 높은 1, 5, 9, 11형은 apxI과 II; 2, 4, 6, 8형은 apxII와 III; 병원성이 낮은 7, 12, 13형은 apxII; 10, 14형은 apxI; 3형은 apxIII를 분비한다(Fery, 2003). 이번 연구에서 분리된 균주의 serotype specific PCR에서 12형으로 확인된 균주(n=5) 모두 apx/omlA PCR에서 apxIICA, apxIBD 이외에 apxIIICA, apxIIIBD 유전자가 확인되고 omlA 3 그룹으로 분류되어 비정형의 혈청형으로 확인되었다. 이는 병원성이 상대적으로 낮은 것으로 알려진 12형 균주의 병원성이 국내에서는 2, 4, 6, 8형과 동일한 수준일 수 있다는 것을 의미하므로 앞서 언급한 1형과 함께 국내 12형 균주에 대한 병원성과 유전적 특성에 관한 집중적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 또한, 국내에서는 APP 균주의 biofilm 형성능을 평가하여 1형과 5형의 병원성이 2형보다 높다는 것을 증명하였다(Shin 등, 2011). 이번 연구에서도 혈청형별 폐 병변을 비교해 본 결과 주로 5형이 타 혈청형보다 급성 경과를 나타내며 병변의 정도가 더 심한 것으로 확인되어 국내에서 유행하는 균주 중에 가장 병원성이 큰 것을 확인할 수 있었으나 1형에서는 다른 혈청형과 비교하여 병원성이 더 크다는 결론은 내릴 수 없었다(Table 4).
- 0% (10/83)의 농장이 이에 해당하였다(Data not shown). 전체 검사대상의 APP 감염률은 serotype-specific ELISA 경우 최소한 한 개 혈청형그룹 이상에서 양성 비율이 36.7% (166/452), apxIV antibody ELISA는 49.3% (223/452)로 전자가 후자에 비해 현저히 낮은 것으로 확인되어 Oliveira(2009)가 지적한 serotype-specific ELISA kit의 민감도 문제가 이번 실험에도 반영된 것으로 생각된다. 그밖에 농장 오염도를 분석해보면 serotype-specific ELISA에서 최소한 한 개이상의 키트에서 양성이 나온 비율이 60.
후속연구
- 이번 연구에서 분리된 균주의 serotype specific PCR에서 12형으로 확인된 균주(n=5) 모두 apx/omlA PCR에서 apxIICA, apxIBD 이외에 apxIIICA, apxIIIBD 유전자가 확인되고 omlA 3 그룹으로 분류되어 비정형의 혈청형으로 확인되었다. 이는 병원성이 상대적으로 낮은 것으로 알려진 12형 균주의 병원성이 국내에서는 2, 4, 6, 8형과 동일한 수준일 수 있다는 것을 의미하므로 앞서 언급한 1형과 함께 국내 12형 균주에 대한 병원성과 유전적 특성에 관한 집중적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
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