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문제 정의
- pleuropneumoniae 의 혈청형 분포를 확인하고, 항생제 감수성 검사를 통하여 효과적인 항생제 선발에 활용하고자 하였다. 또한 항생제 중에서 oxytetracycline과 florfenicol에 내성이 있는 균주에 대한 내성 유전자 분포를 확인하고자 하였다.
- pleuropneumoniae 76주에 대한 항생제 감수성 검사결과 penicillin, ceftiofur 및 enrofloxacin 등에 감수성이 높다고 발표하였다. 본 실험에서는 국내 각 지역에서 분리된 총 32개의 균주를 대상으로 12종의 항생제에 대해 감수성 시험을 하였다. 그 결과 enrofloxacin이 내성균 없이 모두 감수성이 있는 것으로 나타났으며 amoxicillin/clavulanic acid, trimethoprim/ sulfamethoxazole, ceftiofur 가 내성률이 10% 미만으로 감수 성이 좋은 약제로 확인되어 기존과 비슷한 결과를 보였다.
- 본 연구는 2008년에서 2010년까지 코미팜 병성감정실에 의뢰된 육성, 비육돈의 폐에서 분리한 A. pleuropneumoniae 의 혈청형 분포를 확인하고, 항생제 감수성 검사를 통하여 효과적인 항생제 선발에 활용하고자 하였다. 또한 항생제 중에서 oxytetracycline과 florfenicol에 내성이 있는 균주에 대한 내성 유전자 분포를 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 2008년에서부터 2010년까지 국내 양돈농장에서 분리된 A. pleuropneumoniae 32점에 대해 혈청형의 분포를 조사하고 항생제 감수성 검사를 통해 항생제에 따른 내성률을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- DNA 추출은 kit의 매뉴얼을 따라 실시하였고 PCR에 사용되기 전 –20oC에 보관하였다. A. pleuropneumoniae로 확인된 균주에서 혈청형을 구분하기 위해 15가지 혈청형 중 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12형에 대해 PCR을 실시하였다. 각 혈청형에 대한 primer 정보는 기존에 보고된 문헌을 참고하였다[1, 11, 16, 21].
- Oxytetracycline 또는 florfenicol에 내성을 나타낸 균주에 한하여 oxytetracycline 내성유전자인 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO [3]와 florfenicol 내성 유전자인 floR [10]을 검출하기 위한 PCR을 실시하였다. 각각의 유전자를 검출하기 위한 primer 정보 및 PCR 조건은 기존의 문헌에 따라 실시하였다.
- Oxytetracycline과 florfenicol에 내성을 나타낸 31점, 8점균주에 대한 내성 결정 유전자를 PCR법으로 조사하였다. Oxytetracycline 내성 결정 유전자 중 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO에 한해 검사한 결과, tetB가 22점(68.
- Premix는 Maxime PCR premix(i-Star Taq) (iNtron Biotech)을 사용하였고, 추출한 DNA 5 µL와 각각의 primer를 1 µL(10 pmol) 및 DNase RNase free water 13 µL를 첨가하여 최종 용량이 20 µL가 되도록 하였다. PCR 반응조건은 문헌에 나와있는 대로 혈청형별로 달리하였으며 PCR이 끝난 산물은 1.2% agarose gel을 사용하여 전기영동 후 혈청형별 특이밴드를 확인하였다.
- Premix는 Maxime PCR premix(i-Star Taq) (iNtron Biotech)을 사용하였고, 추출한 DNA 5 µL와 각각의 primer를 1 µL(10 pmol) 및 DNase RNase free water 13 µL를 첨가하여 최종 용량이 20 µL가 되도록 하였다.
- Oxytetracycline 또는 florfenicol에 내성을 나타낸 균주에 한하여 oxytetracycline 내성유전자인 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO [3]와 florfenicol 내성 유전자인 floR [10]을 검출하기 위한 PCR을 실시하였다. 각각의 유전자를 검출하기 위한 primer 정보 및 PCR 조건은 기존의 문헌에 따라 실시하였다.
- 5로의 농도로 조절한 다음 NAD를 첨가한 Mueller-Hinton 배지에 도말하였다. 각각의 항생제 디스크를 접종한 후 37oC의 3~5% CO2 환경에서 18~24시간 배양한 다음 디스크 주위의 완전 억제존의 직경을 측정하여 내성여부를 판정하였다. 내성의 판정은 Becton-Dickinson 사 메뉴얼과 CLSI 의 기준에 따라 판정하였고, 항생제 감수성 검사의 표준균주로 A.
- pleuropneumoniae ATCC 27090을 사용하였다. 또한 분리균 중에서 혈청형이 확인된 1, 2, 5, 12형에 한하여 혈청형에 따른 항생제 내성률을 비교하였다.
- 75 µg), oxytetracycline(30 µg)과 CLSI의 메뉴얼을 참고하여 제작한 enrofloxacin(10 µg), florfenicol(30 µg), ceftiofur(30 µg) 디스크를 사용하였다. 멸균면봉으로 배양된 콜로니를 채취하여 PBS에 부유시켜 MacFarland No. 0.5로의 농도로 조절한 다음 NAD를 첨가한 Mueller-Hinton 배지에 도말하였다. 각각의 항생제 디스크를 접종한 후 37oC의 3~5% CO2 환경에서 18~24시간 배양한 다음 디스크 주위의 완전 억제존의 직경을 측정하여 내성여부를 판정하였다.
- 배양된 액체배지를 200 µL 채취하여 G-spin Genomic DNA extraction kit(iNtron Biotech, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
- 세균분리는 한일코메드(한국)에서 제조, 판매하는 5% 면양한천혈액배지와 초콜렛 한천배 지를 사용하였고, 혈액배지에는 Staphylococcus aureus 균을 획선도 말하였다. 배지는 촛불병배양법(Candle jar method)으로 3~5% CO2 환경을 만들어 37oC에서 18~24시간 배양하였다. 순수 배양된 집락은 위성집락현상, CAMP test 양성 및 유전자 검사법으로 Apx IV 유전자를 검사하여 확인하였다.
- 배지는 촛불병배양법(Candle jar method)으로 3~5% CO2 환경을 만들어 37oC에서 18~24시간 배양하였다. 순수 배양된 집락은 위성집락현상, CAMP test 양성 및 유전자 검사법으로 Apx IV 유전자를 검사하여 확인하였다. 분리된 균은 총 32점으로 2008년 5점, 2009년 10점, 2010년 17점을 실험에 사용하였다.
- 초콜렛 한천배지에서 순수 배양된 집락을 채취하여 5 µg/ mL의 NAD를 첨가한 Brain heart infusion(Difco, USA)배지에 접종 후 37oC에서 18시간 배양하였다.
대상 데이터
- 2008년부터 2010년까지 전국 32개 농장으로부터 호흡기 문제로 코미팜 병성감정실로 검사 의뢰된 육성 및 비육돈의 폐를 세균 분리 재료로 사용하였다. 육안적으로 폐는 섬유소성 흉막염 및 폐출혈 등의 돼지흉막폐렴의 전형적인 소견을 나타내었고, 육안검사 후 병원체를 검출하기 위해서 폐 병변 부위를 무균적으로 채취하였다.
- 순수 배양된 집락은 위성집락현상, CAMP test 양성 및 유전자 검사법으로 Apx IV 유전자를 검사하여 확인하였다. 분리된 균은 총 32점으로 2008년 5점, 2009년 10점, 2010년 17점을 실험에 사용하였다.
- 항생제 디스크는 Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 10종 인 penicillin(10 U), ampicillin(10 µg), amoxicillin/clavulanic acid(20/10 µg), neomycin(30 µg), amikacin(30 µg), gentamicin(10 µg), kanamycin(30 µg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.25/23.75 µg), oxytetracycline(30 µg)과 CLSI의 메뉴얼을 참고하여 제작한 enrofloxacin(10 µg), florfenicol(30 µg), ceftiofur(30 µg) 디스크를 사용하였다.
이론/모형
- pleuropneumoniae로 확인된 균주에서 혈청형을 구분하기 위해 15가지 혈청형 중 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12형에 대해 PCR을 실시하였다. 각 혈청형에 대한 primer 정보는 기존에 보고된 문헌을 참고하였다[1, 11, 16, 21]. Premix는 Maxime PCR premix(i-Star Taq) (iNtron Biotech)을 사용하였고, 추출한 DNA 5 µL와 각각의 primer를 1 µL(10 pmol) 및 DNase RNase free water 13 µL를 첨가하여 최종 용량이 20 µL가 되도록 하였다.
- 각각의 항생제 디스크를 접종한 후 37oC의 3~5% CO2 환경에서 18~24시간 배양한 다음 디스크 주위의 완전 억제존의 직경을 측정하여 내성여부를 판정하였다. 내성의 판정은 Becton-Dickinson 사 메뉴얼과 CLSI 의 기준에 따라 판정하였고, 항생제 감수성 검사의 표준균주로 A. pleuropneumoniae ATCC 27090을 사용하였다. 또한 분리균 중에서 혈청형이 확인된 1, 2, 5, 12형에 한하여 혈청형에 따른 항생제 내성률을 비교하였다.
- 본 실험에서는 국내 양돈농장에서 분리된 A. pleuropneumoniae 균주를 PCR 법을 이용하여 혈청형 조사를 하였다. 총 32점 중 5형이 16점으로 확인되어 50%로 가장 검출율이 높았고 다음으로 1, 2, 12형 순으로 확인되어 최근에 발표된 문헌과 [17] 비슷한 결과를 보였다.
- 총 32점의 A. pleuropneumoniae 분리균주에 대한 항생제 감수성 시험은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 방법에 준하여 디스크 확산법으로 실시하였다 [4]. 항생제 디스크는 Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 10종 인 penicillin(10 U), ampicillin(10 µg), amoxicillin/clavulanic acid(20/10 µg), neomycin(30 µg), amikacin(30 µg), gentamicin(10 µg), kanamycin(30 µg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.
성능/효과
- Oxytetracycline과 florfenicol에 내성을 나타낸 31점, 8점균주에 대한 내성 결정 유전자를 PCR법으로 조사하였다. Oxytetracycline 내성 결정 유전자 중 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO에 한해 검사한 결과, tetB가 22점(68.75%)으로 확인되었고 tetH와 tetO는 각각 6점(19.35%)과 3점(9.67%)으로 확인되었다. tetA와 tetL은 검출되지 않았다.
- pleuropneumoniae에 대한 항생제 감수성 검사결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 검사에 사용한 항생제 중 enrofloxacin이 내성을 보이는 균주 없이 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다. 그 다음으로 amoxicillin/clavulanic acid, ceftiofur, trimethoprim/sulfamethoxazole 에서 내성률이 10% 미만으로 나타났다.
- 본 실험에서는 국내 각 지역에서 분리된 총 32개의 균주를 대상으로 12종의 항생제에 대해 감수성 시험을 하였다. 그 결과 enrofloxacin이 내성균 없이 모두 감수성이 있는 것으로 나타났으며 amoxicillin/clavulanic acid, trimethoprim/ sulfamethoxazole, ceftiofur 가 내성률이 10% 미만으로 감수 성이 좋은 약제로 확인되어 기존과 비슷한 결과를 보였다. 그러나 penicillin은 50%로 내성률이 비교적 높게 나타났다.
- 25%로 가장 많이 검출되었고 다음으로 tetH, tetO, tetA 가 검출되었다 [15]. 본 실험에서 oxytetracycline에 대한 내성을 보이는 31개의 분리주에서 tet 유전자를 검사한 결과, 70% 가까이 tetB 유전자가 검출되어 비슷한 결과를 보였으며 국내에서도 이와 관련하여 내성균이 상당히 많이 퍼져있을 것으로 생각된다.
- 이 항생제의 지속적인 사용으로 인해 1990년대부터 이 약제에 대한 내성이 높아지고 있다. 본 연구에서 oxytetracycline 에 대한 내성률을 보면 96.9%로 32점 중 31점에서 내성을 나타냈다. 다른 나라에서도 tetracycline 계에서 가장 높은 내성률을 보고하였지만 이 결과는 대만 [20]의 52.
- 8% 로 확인되었고 이들 균주에서 항생제 내성 유전자인 floR을 검출하였다 [10]. 본 연구에서는 이보다 훨씬 높은 25%의 내성률을 보여 항생제의 사용량과 연관되어 향후 내성을 획득하는 균주가 더 많아질 것으로 생각된다.
- 그 다음으로 amoxicillin/clavulanic acid, ceftiofur, trimethoprim/sulfamethoxazole 에서 내성률이 10% 미만으로 나타났다. 분리균의 50% 이상이 내성을 나타내는 항생제는 kanamycin, neomycin, amikacin, oxytetracycline이었으며 oxytetracycline은 총 32점의 균주 중 31점이 내성을 보여 96.9%로 가장 높은 내성률을 나타내었다.
- pleuropneumoniae 균주를 PCR 법을 이용하여 혈청형 조사를 하였다. 총 32점 중 5형이 16점으로 확인되어 50%로 가장 검출율이 높았고 다음으로 1, 2, 12형 순으로 확인되어 최근에 발표된 문헌과 [17] 비슷한 결과를 보였다. 국내에서 혈청형 1형이 처음 보고된 이후, 본 실험에서도 32점 중 7점이 혈청형 1로 확인되어 5형 다음으로 높게 조사되었다.
- 총 32점의 A. pleuropneumoniae 분리균주를 대상으로 PCR을 통해 혈청형을 검사한 결과, 5형이 16주(50.0%)로 가장 많았고, 다음으로 1형, 2형 및 12형이 각각 7주 (21.9%), 5주(15.6%), 1주(3.1%)로 확인되었다. 나머지 3주는 혈청형이 확인되지 않았다.
- 혈청형이 확인된 1, 2, 5, 12형 균주에서 각 항생제별 내성률을 비교한 결과 혈청형에 따른 항생제 내성간의 유의성은 관찰되지 않았다(Table 2).
후속연구
- 국내에서 혈청형 1형이 처음 보고된 이후, 본 실험에서도 32점 중 7점이 혈청형 1로 확인되어 5형 다음으로 높게 조사되었다. 따라서, 새로운 혈청형의 국내 분포상황 등을 알기 위한 지속적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 효과적인 예방을 위해서는 나라별로 유행하는 혈청형을 바탕으로 하는 백신 개발이 필요하다. 또한, 시기별로 감수성이 좋은 항생제 종류가 달라지고 있는 만큼 이에 대한 조사 및 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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