[논문]Lactobacillus bifermentans로 발효한 율피의 항아토피 효과

김배진; 손우림; 최미옥; 조성경; 정희경; 이진태; 김학윤; 권대준

doi:10.3746/jkfn.2013.42.9.1378

Lactobacillus bifermentans로 발효한 율피의 항아토피 효과
Anti-atopic Effects of Castanea crenata Inner Shell Extracts Fermented by Lactobacillus bifermentans 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.42 no.9, 2013년, pp.1378 - 1386

김배진 ((재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터) , 손우림 ((재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터) , 최미옥 ((재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터) , 조성경 ((재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터) , 정희경 ((재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터) , 이진태 (대구한의대학교 화장품약리학과) , 김학윤 (계명대학교 환경생물학과) , 권대준 ((재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터)

초록
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본 연구에서는 DNCB 도포를 통해 아토피 피부염을 유발시킨 NC/Nga mice에 율피 발효물을 각각 0.1%, 1%, 5%로 도포하고 항아토피 효능을 평가하였다. 율피 발효물의 유효성분은 HPLC 분석 결과, gallic acid와 ellagic acid가 각각 10.18 mg/g, 2.14 mg/g 함량을 나타내었다. 실험군 간의 유의적 체중 변화는 관찰되지 않았으며, 육안 평가를 통해 홍반, 가려움과 피부건조, 부종과 혈종, 짓무름 그리고 태선화와 같은 일반적인 아토피 피부염 증상의 심각도를 측정한 점수 결과에서는 DNCB 도포를 통해 아토피 피부염을 유발한 atopic dermatitis(AD)군($13.17{\pm}0.40$)과 비교 시, 아토피 피부염 유발 후 5% 율피 발효물을 도포한 fermented Castanea crenata inner shell(FCS) 5군에서 $7.50{\pm}0.43$ 으로 나타나 아토피 피부염 증상이 빠르게 개선되는 것을 확인하였다(P<0.01). 피부 측정 기기인 MPA5 580을 이용하여 피부멜라닌지수, 피부홍반지수, 피부수분지수를 측정한 결과, AD군은 각각 $296.61{\pm}8.11$, $264.33{\pm}10.15$, $3.15{\pm}0.54$를 나타내었으며 FCS 5군은 각각 $105.86{\pm}2.92$, $199.56{\pm}4.22$, $17.62{\pm}1.75$로 개선효과가 유의적으로 나타났다(P<0.05). 각 실험군 mice의 면역반응을 확인하기 위해 비장 무게(mg)를 체중(g)으로 나누어 산출한 비장 수치의 경우, 아토피 피부염 유발로 인해 AD군에서 증가된 비장 수치($5.55{\pm}0.31$)가 FCS 0.1군, FCS 1군, FCS 5군에서는 각각 $4.53{\pm}0.24$, $3.80{\pm}0.40$, $3.32{\pm}0.24$로 나타나 율피 발효물의 도포 농도에 의존적으로 감소되는 경향을 나타냈으며 특히 FCS 5군에서는 유의적으로 낮게 나타났다(P<0.05). 이는 율피 발효물이 아토피 피부염 상태에서 증가된 비장 내 T-림프구를 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. Quantitative real-time PCR을 통해 피부조직에서 IL-$1{\beta}$, TNF-${\alpha}$와 같은 염증 유전자의 발현 변화를 분석한 결과, 두 유전자 모두 정상군의 relative quantification값이 1일 때 AD군은 각각 1.30, 1.26으로 증가되었으며 FCS 5군에서는 1.11, 0.93으로 나타나 율피 발효물 도포에 의한 유의적인 감소(P<0.05)를 확인할 수 있었다. 아토피 피부염의 면역학적 지표인 혈청 내 IgE 함량을 분석한 결과에서는 각 실험군 간의 유의적 차이는 보이지 않았으나 AD군($1,628.71{\pm}202.59ng/mL$)과 비교 시, 율피 발효물을 도포한 FCS 0.1군, FCS 1군, FCS 5군에서 각각 $1,530.15{\pm}198.70ng/mL$, $1,462.15{\pm}83.79ng/mL$, $1,187.47{\pm}140.09ng/mL$로 나타나 율피 발효물 도포에 의해 감소되는 경향을 확인할 수 있었다. 따라서 율피 발효물은 아토피 피부염 증상 개선을 위한 기능성 천연물의 소재로 활용될 수 있을 것이라 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Atopic dermatitis (AD) is a common skin disease characterized by chronic and relapsing inflammatory dermatitis with immunological disturbances. In spite of the continuous increase in the incidence of AD, it is regrettable that till date there is no effective treatment to treat the same. Therefore, the present study was designed to examine the possible anti-atopic effects of Castanea crenata inner shell extracts fermented by Lactobacillus bifermentans (FCS) in 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) induced AD in NC/Nga mice. Based on the results of HPLC analysis, we found that FCS contains anti-inflammatory factors such as gallic acid (10.18 mg/g) and ellagic acid (2.14 mg/g). The groups that we have used in this study included 0.1%, 1%, 5% fermented Castanea crenata inner shell extracts (FCS 0.1, FCS 1, FCS 5), 1,3-butylene glycol treated control (AD), and normal mice. After topical FCS treatment, we observed that the clinical severity score for AD was lower in both the FCS 1 and FCS 5 groups than the AD group. We also proved beyond doubt that there was improvement of melanin, erythema and skin moisture indices in the FCS 5 group. Spleen index and gene expression levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-$1{\beta}$ and TNF-${\alpha}$ were significantly decreased in the FCS 5 group compared to the AD group (P<0.05). Further, we also found that the level of serum immunoglobulin E (IgE) in the FCS-treated group was decreased in a concentration-dependent manner. The results of our study suggest that FCS can be effectively used as a cosmeceutical ingredient for both the prevention and improvement of AD.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 아토피 피부염의 증상을 개선시킬 수 있는 유효성분 개발을 위해 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB)으로 유도된 아토피 피부염 NC/Nga mice에서 Lactobacillus(L.) bifermentans로 발효한 율피 발효물의 농도별 항아토피 효능을 조사하였다.

제안 방법

NC/Nga mice의 심장으로부터 채취한 혈액을 원심분리한 후 혈청을 획득하고 혈청 내 IgE 농도는 Mouse Serum IgE ELISA kit(Shibayagi, Gunma, Japan)를 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 혈청 5 μL와 buffer solution 45 μL를 혼합하여 각각의 well에 50 μL씩 분주하고 20~25℃에서 2시간 동안 방치한 후 washing buffer로 3회 세척하였다.
각 실험군별 NC/Nga mice의 등 부위를 관찰하여 아토피 피부염 병변의 형태학적 변화를 확인하였다. 정상군에서는 피부의 형태학적 변화가 나타나지 않았으나, DNCB를 처리한 AD군에서는 홍반, 가려움과 피부건조, 짓무름, 부종과 혈종 등의 아토피성 피부 변화가 확인되었다.
그 후 1% DNCB 용액(acetone : olive oil=3:1) 200 μL를 등 부위에 도포하여 피부감작을 유도하였다.
도포 3일 후 0.4% DNCB 용액 150 μL를 다시 도포하였으며, 4일 후부터는 주 3회씩 3주 동안 0.4% DNCB 용액 150 μL를 도포하여 아토피 피부염을 유발시켰다(19,20).
본 연구에서는 DNCB 도포를 통해 아토피 피부염을 유발시킨 NC/Nga mice에 율피 발효물을 각각 0.1%, 1%, 5%로 도포하고 항아토피 효능을 평가하였다. 율피 발효물의 유효성분은 HPLC 분석 결과, gallic acid와 ellagic acid가 각각 10.
시료 도포가 끝난 후, NC/Nga mice를 희생시켜 비장을 적출하고 무게를 측정하였다. 비장 수치(spleen index)는 NC/Nga mice의 비장 무게(mg)를 체중(g)으로 나누어 산출 하였다(23).
시료 도포가 끝난 후, NC/Nga mice를 희생시켜 비장을 적출하고 무게를 측정하였다. 비장 수치(spleen index)는 NC/Nga mice의 비장 무게(mg)를 체중(g)으로 나누어 산출 하였다(23).
실험기간 중 사료와 물은 자유로이 섭취시켰으며 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 55±15% 그리고 명암은 12시간 주기를 유지하였다. 실험군은 DNCB(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 도포한 atopic dermatitis(AD)군, DNCB 및 0.1% 율피 발효물을 도포한 fermented Castanea crenata inner shell(FCS) 0.1군, DNCB 및 1% 율피 발효물을 도포한 FCS 1군, DNCB 및 5% 율피 발효물을 도포한 FCS 5군, 그리고 아무것도 도포하지 않은 정상군을 포함하여 총 5개 군으로 나누었으며 각 군에 6마리씩 배정하여 실험하였다. 이 동물실험은 (재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: BHCC-IACUC-2012-02)을 받아 수행되었다.
실험시료는 DNCB 도포가 끝난 후, FCS 0.1, FCS 1, FCS 5군에 매일 정해진 시간에 율피 발효물을 각각 0.1%, 1%, 5%의 농도로 1,3-butylene glycol(Sigma-Aldrich) 200 μL에 희석하여 3주간 도포하였으며 동일 기간 동안 AD 군에는 1,3-butylene glycol 200 μL를 도포하였다.
분석하였다. 실험시료의 도포가 끝난 NC/Nga mice의 등 부위 피부를 3번 연속 측정하여 평균값을 얻었으며 측정 장소는 실내온도 21~23℃, 습도 50~60%가 유지되는 조건에서 계측하였다.
아토피 피부염 유발 및 율피 발효물 도포에 의한 NC/Nga mice의 면역반응을 확인하기 위해 비장 수치를 비교․분석하였다(Fig. 5). 정상군은 3.
안정화 기간이 지난 후, animal clipper(JP-6116, Joas Electronics, Namyangju, Korea)를 이용하여 모든 NC/Nga mice의 등 부위를 깨끗하게 제모하고 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 그 후 1% DNCB 용액(acetone : olive oil=3:1) 200 μL를 등 부위에 도포하여 피부감작을 유도하였다.
Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)은 Corbett Research RG-6000(Corbett Life Science, Sydney, Australia)을 이용하여 수행하였다. 염증 유발 cytokine의 유전자 발현은 QuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen)를 사용하였고, endogenous control은 GAPDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 10 pM이 되게 반응시켰다. 유전자 발현의 fold change는 delta-delta Ct 방법을 이용하여 산출하였다(24).
율피 발효물에 함유되어 있는 gallic acid와 ellagic acid의 함량은 high performance liquid chromatography(HPLC, e2790/5 HPLC system, Waters Co., Milford, MA, USA) 분석을 통해 측정하였다. 분석을 위한 시료는 율피 발효물 0.
율피 발효물의 항아토피 효과 유효성을 평가하기 위해 아토피 피부염의 면역학적 지표로 알려진 혈청 내 IgE 함량을 측정하였다. 그 결과 정상군(479.
율피 발효물의 항아토피 효능이 염증 유발 cytokine의 발현 변화와 관련 있는지 알아보기 위해 피부 조직으로부터 mRNA를 추출하여 qRT-PCR을 수행하였다. 피부 조직에서 IL-1β mRNA 유전자 발현은 정상군의 relative quantification(RQ) 값이 1일 때, AD군 1.
본 실험에 사용된 율피는 (주)푸드웰(대구)에서 제공받아 사용하였다. 율피의 추출은 율피에 시료 중량 대비 10배의 물을 가하여 압력식 추출기(KSNP B1130, KyungSeo Machines, Incheon, Korea)에서 70℃, 3시간씩 3회 반복 추출하고 감압 농축기(rotary vacuum evaporator, N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축한 다음 동결건조 하여 준비하였다. 율피 발효물 제조에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받은 L.
추출된 RNA 의 농도는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 측정하였으며 cDNA synthesis kit(Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 5 μg의 mRNA를 cDNA로 합성한 후 real-time PCR에 사용하였다.
평가 항목은 홍반(erythema), 가려움과 피부건조(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion) 그리고 태선화(lichenification)이며 각각의 항목에 대해 증상 없음(0점), 약함(1점), 보통(2점), 심함(3점)으로 채점한 후, 합산하여 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여하였다(21,22).
피부 측정 기기인 Multiprobe Adapter System(MPA5580, Courage & Khazaka Gmbh, Cologne, Germany)을 이용하여 아토피 피부염 상태에서 변화하는 피부수분지수(Corneometer® CM825), 피부멜라닌지수 그리고 피부홍 반지수(Mexameter® MX18)를 측정 및 비교․분석하였다.

대상 데이터

Body weight of the experimental groups. The groups that we have used in this study included 0.1%, 1%, 5% fer- mented Castanea crenata inner shell extracts (FCS 0.1, FCS 1, FCS 5), 1,3-butylene glycol treated control (AD), and normal mice. All experimental groups were no significant differences in body weight (n=6 per group).
본 실험에 사용된 율피는 (주)푸드웰(대구)에서 제공받아 사용하였다. 율피의 추출은 율피에 시료 중량 대비 10배의 물을 가하여 압력식 추출기(KSNP B1130, KyungSeo Machines, Incheon, Korea)에서 70℃, 3시간씩 3회 반복 추출하고 감압 농축기(rotary vacuum evaporator, N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축한 다음 동결건조 하여 준비하였다.
본 실험에서 사용한 실험동물은 6주령 된 수컷 NC/Nga mice(21~26 g)로, (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 공급받아 실험동물사에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험기간 중 사료와 물은 자유로이 섭취시켰으며 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 55±15% 그리고 명암은 12시간 주기를 유지하였다.
평가 항목은 홍반(erythema), 가려움과 피부건조(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion) 그리고 태선화(lichenification)이며 각각의 항목에 대해 증상 없음(0점), 약함(1점), 보통(2점), 심함(3점)으로 채점한 후, 합산하여 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여하였다(21,22). 시료 도포가 끝난 NC/Nga mice의 체중은 전자저울(CP423S, Sartorius AG, Goettingen, Germany)을 이용하여 측정하였다.
bifermentans를 이용하였다. 율피 발효를 위한 배지는 1/10 MRS와 0.5% 율피 추출물을 혼합한 배지를 이용하였으며, L. bifermentans의 전배양액은 MRS 배지 5 mL에 백금이로 접종한 뒤 24시간 동안 배양하여 준비하였다. 율피 발효물은 율피발효 배지 500 mL에 L.
율피의 추출은 율피에 시료 중량 대비 10배의 물을 가하여 압력식 추출기(KSNP B1130, KyungSeo Machines, Incheon, Korea)에서 70℃, 3시간씩 3회 반복 추출하고 감압 농축기(rotary vacuum evaporator, N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축한 다음 동결건조 하여 준비하였다. 율피 발효물 제조에 사용한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받은 L. amylophilus(KCCM 40980)와 L. bifermentans(KCCM 40981)를 대상으로 균주 생육과 각 균주를 이용한 율피 발효물의 피부세포 독성을 조사하여 율피 추출물에서 우수한 생육을 나타내고 발효 후 HS68 피부세포에 대한 세포독성을 감소시킨 L. bifermentans를 이용하였다. 율피 발효를 위한 배지는 1/10 MRS와 0.
bifermentans의 전배양액은 MRS 배지 5 mL에 백금이로 접종한 뒤 24시간 동안 배양하여 준비하였다. 율피 발효물은 율피발효 배지 500 mL에 L. bifermentans 전배양액 5 mL를 접종하여 24시간 발효한 후 원심분리기를 사용하여 상층액을 회수하고 동결건조 하여 본 연구에 사용하였다.

데이터처리

Data represent mean±SD. One-way ANOVA.
결과는 각 실험군별 평균±표준편차로 표시하였으며, 평균 간의 유의성은 Student's t-test와 One way ANOVA 검증을 통한 Duncan's multiple range test로 P<0.05 수준에서 검증하였다.
실험 결과의 분석은 Statistical Package for Social Science(SPSS, win 12.0 version, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 이용하여 기술적인 통계치를 산출하였다. 결과는 각 실험군별 평균±표준편차로 표시하였으며, 평균 간의 유의성은 Student's t-test와 One way ANOVA 검증을 통한 Duncan's multiple range test로 P<0.

이론/모형

추출된 RNA 의 농도는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 측정하였으며 cDNA synthesis kit(Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 5 μg의 mRNA를 cDNA로 합성한 후 real-time PCR에 사용하였다. Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)은 Corbett Research RG-6000(Corbett Life Science, Sydney, Australia)을 이용하여 수행하였다. 염증 유발 cytokine의 유전자 발현은 QuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen)를 사용하였고, endogenous control은 GAPDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 10 pM이 되게 반응시켰다.
염증 유발 cytokine의 유전자 발현은 QuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen)를 사용하였고, endogenous control은 GAPDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 10 pM이 되게 반응시켰다. 유전자 발현의 fold change는 delta-delta Ct 방법을 이용하여 산출하였다(24). qRT-PCR에 사용된 염증 cytokine primer와 각각의 염기배열은 다음과 같다.

성능/효과

(B) Significant improvement of mRNA expression level of TNF-α observed in only 5% FCS treated NC/Nga atopic mice group (n=6 per group).
6B). 0.1%의 율피 발효물을 도포한 FCS 0.1군에서는 염증 유전자의 발현 변화가 나타나지 않았으며 이는 육안 평가, 피부 측정 그리고 비장 수치에서 유의적 효과가 없는 결과와 일치하여 FCS 0.1군에는 항아토피 효능이 없음을 확인하였다.
정상군에서는 피부의 형태학적 변화가 나타나지 않았으나, DNCB를 처리한 AD군에서는 홍반, 가려움과 피부건조, 짓무름, 부종과 혈종 등의 아토피성 피부 변화가 확인되었다. 1%와 5% 율피 발효물을 도포한 FCS 1군, FCS 5군에서는 이러한 아토피성 증상들이 개선되는 효과를 나타내었고, 특히 FCS 5군에서는 정상군과 유사한 피부 형태를 나타내었다. 실험시료 도포 3주 후, 아토피 피부염의 여러 증상들을 종합하여 점수화 하는 육안 평가 시험 결과, 정상군 1.
DNCB 도포를 통해 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga mice에 농도를 달리한 율피 발효물을 3주간 도포한 후, 각 실험군별 NC/Nga mice의 체중 변화를 측정한 결과, 정상군은 31.15±1.1 g, DNCB를 도포한 AD군은 29.18±0.4 g, 그리고 DNCB 도포 후 율피 발효물을 처리한 FCS 0.1, FCS 1, FCS 5군은 각각 29.04±0.3 g, 28.69±0.84 g, 29.14±0.51 g으로 나타났다(Fig. 2).
Quantitative real-time PCR을 통해 피부조직에서 IL-1β, TNF-α와 같은 염증 유전자의 발현 변화를 분석한결과, 두 유전자 모두 정상군의 relative quantification값이 1일 때 AD군은 각각 1.30, 1.26으로 증가되었으며 FCS 5군에서는 1.11, 0.93으로 나타나 율피 발효물 도포에 의한 유의적인 감소(P<0.05)를 확인할 수 있었다.
TNF-α mRNA 유전자 발현 역시 정상군의 RQ 값이 1일 때, AD군 1.26, FCS 0.1군 1.24, FCS 1군 1.19, FCS 5군 0.93으로 나타나 5% 율피 발효물의 도포에 의한 TNFα mRNA 유전자 발현 감소 효과를 확인할 수 있었다(Fig. 6B).
각 실험군 mice의 면역반응을 확인하기 위해 비장 무게(mg)를 체중(g)으로 나누어 산출한 비장 수치의 경우, 아토피 피부염 유발로 인해 AD군에서 증가된 비장 수치(5.55±0.31)가 FCS 0.1군, FCS 1군, FCS 5군에서는 각각 4.53±0.24, 3.80±0.40, 3.32±0.24로 나타나 율피 발효물의 도포 농도에 의존적으로 감소되는 경향을 나타냈으며 특히 FCS 5군에서는 유의적으로 낮게 나타났다 (P<0.05).
각 실험군별 NC/Nga mice의 피부멜라닌지수를 측정한결과, 정상군 48.19±10.34, AD군 296.61±8.11, FCS 0.1군 282.61±12.32, FCS 1군 228.72±14.26, FCS 5군 105.86±2.92로 나타나 아토피 피부염 유발로 인해 증가된 멜라닌 함량이 1%와 5% 율피 발효물 도포에 의해 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 4A).
그 결과 정상군(479.38±53.22 ng/mL)과 비교시 AD군은 1,628.71±202.59 ng/mL로 정상군에 비해 유의적으로 증가하였다.
그에 반해 FCS 0.1군, FCS 1군, FCS 5군은 각각 4.53±0.24, 3.80±0.40, 3.32±0.24로 비장 수치가 율피 발효물의 도포 농도에 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 5% 율피 발효물을 도포한 군에서는 유의적 감소를 나타내었다.
그리고 또 다른 폴리페놀계 화합물인 ellagic acid는 Ca²⁺의 억제와 NF-κB의 활성 증가를 통해 염증 유발 인자의 분비를 감소시켜 IgE와 관련된 과민성 반응을 억제시킨다(27). 따라서 gallic acid와 ellagic acid가 함유되어 있는 율피 발효물은 아토피 피부염과 같은 염증성 알레르기 질환의 개선에 적합한 새로운 효능물질이될 수 있을 것으로 판단된다.
이러한 결과들은 천연자원이 가지는 항아토피 효능이 발효를 통해 증대되는 것을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 율피에 함유되어 있는 폴리페놀계 화합물의 작용뿐만 아니라 발효를 통한 다양한 면역 조절 작용에 의해 아토피 피부염의 증상 완화가 나타나는 것으로 사료된다.
그러므로 아토피 피부염을 효과적으로 억제하기 위해서는 혈청 내 IgE의 함량을 조절할 수 있어야 한다. 따라서 비록 유의적인 차이는 관찰되지 않았지만 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga mice에서 율피 발효물의 도포가 혈청 내 IgE의 함량을 줄이는 것으로 보아 아토피 피부염 개선에 긍정적인 효과를 가질 것으로 판단되어진다.
따라서 상기의 유의적인 결과는 일정농도 이상의 율피 발효물이 IL-1β와 TNF-α와 같은 염증 유발 cytokine의 발현을 조절하여 아토피 피부염에 대한 개선 효과를 나타내고 있음을 보여준다.
이와 반대로 비장 내 Th1 cell과 Th2 cell의 균형이 이루어지면 증가된 T-림프구가 감소되고 히스타민의 생성을 억제시켜 아토피피부염의 증상 완화를 나타낼 수 있다(34,35). 따라서 율피 발효물에 의한 비장 수치의 감소는 아토피 피부염 유발로 인한 비장 내 T-림프구의 불균형을 고농도의 율피 발효물이 효과적으로 조절할 수 있음을 보여주며, 이러한 T-림프구의 조절을 통해 최종적으로 아토피 피부염을 개선하는 것으로 사료된다.
따라서 율피 발효물은 피부에서의 면역인자 조절 작용 외에 비장 내에서 IL-4와 같은 Th2 cytokine의 발현을 감소시키고 IFN-γ와 같은 Th1 cytokine의 발현을 증가시켜 두 세포 간의 균형을 이루게 함으로써 결과적으로 아토피 피부염의 증상을 완화시킬 수 있을 것으로 사료된다.
아토피 피부염이 발병하면 과민 반응으로 인해 여러 증상과 더불어 피부장벽이 손상되는데, 이를 통해 여러 자극물질들이 피부 내로 침투하여 심한 소양증 및 염증반응이 가중된다(31). 본 실험에서는 일정 농도 이상의 율피 발효물 도포가 육안 상 아토피 피부염 증상을 완화시킬 수 있음을 확인할 수 있으며, 이는 율피 발효물이 항염증 및 면역억제 효능에 영향을 미칠 수 있음을 제시한다.
실험군 간의 유의적 체중 변화는 관찰되지 않았으며, 육안 평가를 통해 홍반, 가려움과 피부건조, 부종과 혈종, 짓무름 그리고 태선화와 같은 일반적인 아토피 피부염 증상의 심각도를 측정한 점수 결과에서는 DNCB 도포를 통해 아토피 피부염을 유발한 atopic dermatitis(AD)군(13.17±0.40)과 비교 시, 아토피 피부염 유발 후 5% 율피 발효물을 도포한 fermented Castanea crenata inner shell(FCS) 5군에서 7.50±0.43으로 나타나 아토피 피부염 증상이 빠르게 개선되는 것을 확인하였다(P<0.01).
실험시료 도포 3주 후, 아토피 피부염의 여러 증상들을 종합하여 점수화 하는 육안 평가 시험 결과, 정상군 1.00±0.45, AD군 13.17±0.40, FCS 0.1군 12.67±0.61, FCS 1군 10.50±0.43, FCS 5군 7.50±0.43으로 나타나 아토피 피부염 증상들이 FCS 5군에서 빠르게 호전되는 것을 확인하였으며 FCS 1군 역시 대조군에 비해 점수가 유의적으로 감소되었다(Fig. 3).
아토피 피부염 유발 후, 율피 발효물을 도포한 FCS 0.1군, FCS 1군, FCS 5군에서는 혈청 내 IgE 함량이 각각 1,530.15±198.70 ng/mL, 1,462.15±83.79 ng/mL, 1,187.47±140.09 ng/mL로 율피 발효물의 도포 농도에 의존적으로 감소하는 경향을 보였지만 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Fig. 7).
아토피 피부염의 면역학적 지표인 혈청 내 IgE 함량을 분석한 결과에서는 각 실험군 간의 유의적 차이는 보이지 않았으나 AD군 (1,628.71±202.59 ng/mL)과 비교 시, 율피 발효물을 도포한 FCS 0.1군, FCS 1군, FCS 5군에서 각각 1,530.15±198.70 ng/mL, 1,462.15±83.79 ng/mL, 1,187.47±140.09 ng/mL로 나타나 율피 발효물 도포에 의해 감소되는 경향을 확인할 수 있었다.
1%, 1%, 5%로 도포하고 항아토피 효능을 평가하였다. 율피 발효물의 유효성분은 HPLC 분석 결과, gallic acid와 ellagic acid가 각각 10.18 mg/g, 2.14 mg/g 함량을 나타내었다. 실험군 간의 유의적 체중 변화는 관찰되지 않았으며, 육안 평가를 통해 홍반, 가려움과 피부건조, 부종과 혈종, 짓무름 그리고 태선화와 같은 일반적인 아토피 피부염 증상의 심각도를 측정한 점수 결과에서는 DNCB 도포를 통해 아토피 피부염을 유발한 atopic dermatitis(AD)군(13.
05). 이러한 결과로 미루어 볼 때, 실험기간 동안 환경적 요인 및 스트레스 요인에 의한 체중 변화가 발생하지 않았으며 실험시료가 생체 내 안전성에도 큰영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
이와 마찬가지로 피부수분지수 측정값의 변화에서도 정상군 36.24±2.74, AD군 3.15±0.54, FCS 0.1군 3.21±0.59, FCS 1군 6.35±0.97, FCS 5군 17.62±1.75로 나타나 DNCB 도포에 의해 감소된 피부의 수분 함량이 5% 율피 발효물의 도포에 의해 유의적으로 증가되었다(Fig. 4C).
각 실험군별 NC/Nga mice의 등 부위를 관찰하여 아토피 피부염 병변의 형태학적 변화를 확인하였다. 정상군에서는 피부의 형태학적 변화가 나타나지 않았으나, DNCB를 처리한 AD군에서는 홍반, 가려움과 피부건조, 짓무름, 부종과 혈종 등의 아토피성 피부 변화가 확인되었다. 1%와 5% 율피 발효물을 도포한 FCS 1군, FCS 5군에서는 이러한 아토피성 증상들이 개선되는 효과를 나타내었고, 특히 FCS 5군에서는 정상군과 유사한 피부 형태를 나타내었다.
피부 조직에서 IL-1β mRNA 유전자 발현은 정상군의 relative quantification(RQ) 값이 1일 때, AD군 1.30, FCS 0.1군 1.29, FCS 1군 1.12, FCS 5군 1.11로 나타나 아토피 피부염 유발로 인해 증가된 IL-1β mRNA 발현이 1%와 5% 율피 발효물 도포에 의해 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 6A).
피부 측정 기기인 MPA5 580을 이용하여 피부멜라닌지수, 피부홍반지수, 피부수분지수를 측정한 결과, AD군은 각각 296.61±8.11, 264.33±10.15, 3.15±0.54를 나타내었으며 FCS 5군은 각각 105.86±2.92, 199.56±4.22, 17.62±1.75로 개선효과가 유의적으로 나타났다(P<0.05).
피부세포에 대한 세포독성 감소효과를 나타내는 L. bifermentans 율피 발효물의 gallic acid 및 ellagic acid 함량을 HPLC로 분석한 결과, 율피 발효물 g당 10.18 mg/g, 2.14 mg/g으로 각각 측정되었다(Fig. 1.). Gallic acid는 폴리페놀계 화합물(polyphenolic compounds)의 하나로 비만세포에서 발현되는 염증 유발 cytokine과 히스타민의 분비를 억제시킨다(25,26).
피부홍반지수를 측정한 결과에서는 정상군 172.56±10.11, AD군 264.33±10.15, FCS 0.1군 252.45±7.89, FCS 1군 232.22±8.52, FCS 5군 199.56±4.22로 나타나 5% 율피 발효물의 도포에 의한 피부 홍반의 유의적 감소 효과를 확인할 수 있었다(Fig. 4B).

후속연구

또한 율피와 같이 gallic acid와 ellagic acid를 주성분으로 함유하고 있는 가자(fructus chebula) 추출물을 경구투여 하면 면역학적 및 비면역학적 자극에 의한 알레르기 반응이 억제된다고 보고된바 있다(30). 따라서 유산균 발효를 통해 항아토피 활성이 강화된 율피는 화장품 소재뿐만 아니라 식품소재를 비롯한 다양한 분야의 기능성 소재로써 충분히 활용 가능할 것이다.
09 ng/mL로 나타나 율피 발효물 도포에 의해 감소되는 경향을 확인할 수 있었다. 따라서 율피 발효물은 아토피 피부염 증상 개선을 위한 기능성 천연물의 소재로 활용될 수 있을 것이라 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아토피 피부염이 심할 수록 혈청 내 IgE의 농도는 어떻게 되는가?	아토피 피부염의 발병 원인은 아직까지 명확히 규명되지 않았으나 유전적인 요인, 환경적인 요인, 그리고 면역학적 이상 등 복합적인 요인들이 관여하는 것으로 알려져 있다(4,5). 특히 많은 아토피 피부염 환자에게서 혈청 내 immunoglobulin E(IgE) 농도가 증상이 심할수록 높게 나타나는데 이로 인해 혈청 내 IgE의 농도는 아토피 피부염의 진단 지표 중 하나로 제시되고 있다(6-8). 또한 아토피 피부염 환자에게는 콜라겐(collagen)이 콜라게나이즈(collagenase)에 의해 분해되어 피부장벽의 손상이 일어나는데 이는 염증유발물질의 피부 침투와 염증에 대한 감수성을 높이게 되므로 피부장벽의 손상도 아토피 피부염의 중요한 지표가 될 수 있다(9).
	피부장벽의 손상이 아토피 피부염의 진단 지표가 될 수 있는 이유는?	특히 많은 아토피 피부염 환자에게서 혈청 내 immunoglobulin E(IgE) 농도가 증상이 심할수록 높게 나타나는데 이로 인해 혈청 내 IgE의 농도는 아토피 피부염의 진단 지표 중 하나로 제시되고 있다(6-8). 또한 아토피 피부염 환자에게는 콜라겐(collagen)이 콜라게나이즈(collagenase)에 의해 분해되어 피부장벽의 손상이 일어나는데 이는 염증유발물질의 피부 침투와 염증에 대한 감수성을 높이게 되므로 피부장벽의 손상도 아토피 피부염의 중요한 지표가 될 수 있다(9).
	아토피 피부염이란?	아토피 피부염(atopic dermatitis)은 주로 유아와 소아에서 발생하는 만성적 또는 재발성 염증 피부질환으로 멜라닌(melanin) 색소의 과침착, 피부 건조증 그리고 홍반성 피부 병변으로 특징지어진다(1). 아토피 피부염이 발병하면 과민반응으로 인해 피부를 긁게 되고 이는 홍반, 짓무름, 부종과 혈종, 가려움, 그리고 태선화 등을 동반한 염증반응을 심화시킨다(2,3).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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