Objectives : There is a possibility LRE as remedy in Alzheimer disease (AD), but it's nerve protection effect and mechanism have to be elucidate. In this research, we applied LRE on $A{\beta}_{25-35}$ pre-treated SH-SY5Y cells, to find out the nerve protection effect and mechanism in AD c...
Objectives : There is a possibility LRE as remedy in Alzheimer disease (AD), but it's nerve protection effect and mechanism have to be elucidate. In this research, we applied LRE on $A{\beta}_{25-35}$ pre-treated SH-SY5Y cells, to find out the nerve protection effect and mechanism in AD cell model. Methods : We tried to confirm that effect by experimenting with 20, 50, and $100{\mu}g/ml$ concentration of LRE as a medicine. Next experiment, we assessed damage effect which induced $A{\beta}_{25-35}$, known to cause AD, on SH-SY5Y cell. In addition, cellular viability test is executed under $H_2O_2$ treatment condition in a SH-SY5Y cell. Results : 1. In $A{\beta}_{25-35}$ treated SH-SY5Y cell, LRE exhibited an anti-phosphorylation effect about tau protein, JNK, and IKB. 2. LRE prevent nerve cell apoptosis, which indued $A{\beta}_{25-35}$ and oxidative stress, modify JNK engaged synaptic structure and $NF{\kappa}B$ induced p75-neurotrophin receptor polymorphism. Conclusions : We found that LRE prevented oxidative stress-induced cellular destruction, for example, increased SOD activity of $A{\beta}_{25-35}$ treated SH-SY5Y cell and reduced toxicity of oxygen free radical. Consequently, the ingredients of LRE have a role as a catalyzer for $A{\beta}_{25-35}$ clearance and as scavenger for active oxygen free radical.
Objectives : There is a possibility LRE as remedy in Alzheimer disease (AD), but it's nerve protection effect and mechanism have to be elucidate. In this research, we applied LRE on $A{\beta}_{25-35}$ pre-treated SH-SY5Y cells, to find out the nerve protection effect and mechanism in AD cell model. Methods : We tried to confirm that effect by experimenting with 20, 50, and $100{\mu}g/ml$ concentration of LRE as a medicine. Next experiment, we assessed damage effect which induced $A{\beta}_{25-35}$, known to cause AD, on SH-SY5Y cell. In addition, cellular viability test is executed under $H_2O_2$ treatment condition in a SH-SY5Y cell. Results : 1. In $A{\beta}_{25-35}$ treated SH-SY5Y cell, LRE exhibited an anti-phosphorylation effect about tau protein, JNK, and IKB. 2. LRE prevent nerve cell apoptosis, which indued $A{\beta}_{25-35}$ and oxidative stress, modify JNK engaged synaptic structure and $NF{\kappa}B$ induced p75-neurotrophin receptor polymorphism. Conclusions : We found that LRE prevented oxidative stress-induced cellular destruction, for example, increased SOD activity of $A{\beta}_{25-35}$ treated SH-SY5Y cell and reduced toxicity of oxygen free radical. Consequently, the ingredients of LRE have a role as a catalyzer for $A{\beta}_{25-35}$ clearance and as scavenger for active oxygen free radical.
MTT assay는 우선 12 well plate에 SH-SY5Y 세포(1×105/well)를 12시간 배양한 후 FBS가 없는 배지로 교환하여 16시간동안 안정화시키고, 여러 농도로 약물을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.
그리고 MTT 2 mg/ml를 넣고, incubator에서 4시간 배양한 후 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma)로 용해시켜 570 nm의 파장에서 microplate reader(Molecular devices, USA)로 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 계산하였다.
2차 항체 반응 뒤 막을 씻고 enhanced chemiluminiscence system (ECL, Pierce)으로 원하는 단백질을 가시화 하였다. 단백질의 가시화 및 정량 분석은 image 장비(LAS-3000, Fuji film, Japan)를 이용하였다.
SH-SY5Y cell에 Aβ를 처리하기 30분 전에 蓮根 추출물을 전 처리 후, 24시간이 지난 후에 세포 활성도를 측정하였다.
SH-SY5Y cell에 각각 20, 50μg/ml의 蓮根 추출물을 30분 전에 전 처리한 후 Aβ25-35를 처리하고 24시간 지난 후 MTT 방법으로 세포 생존율을 관찰하였다.
SH-SY5Y cell에 50μg/ml 蓮根추출물을 30분전에 전 처리 후 20μM Aβ25-35로 24시간 동안 자극을 준 후 Superoxide dismutase (SOD)의 활성을 chromagen concentration으로 측정하였다.
SH-SY5Y cell에을 50μg/ml의 蓮根추출물을 처리 후 20 μM Aβ25-35로 자극을 준 후 6시간 후에 세포를 회수하여 IkB alpha (IκBα)의 인산화를 면역학적 블로팅법으로 관찰하였다.
SH-SY5Y cell에 50μg/ml의 蓮根추출물을 처리 후 Aβ25-35를 처리하고 6시간 후에 세포를 회수하여 JNK의 인산화를 면역학적 블로팅법으로 관찰하였다.
病因으로“痴獃證 凡平素無痰而或以鬱結 或以不遂 或以思慮或以疑貳 或以驚恐而漸致痴獃”라 하여 情緖상의 문제로 보았고 病理로 “脈必或弦或數 或大或小 變易不常此其逆氣在心 或肝膽二經 氣有不淸而然”이라 하여 逆氣가 心에 있거나 肝膽二經의 氣不淸을 원인으로 보았다.
에서 “人有終日不言不語 不飮不食 忽笑忽歌 忽愁忽哭 與之所饌則不受 與之糞穢則大喜 與之依不服 與之草木之葉則又大喜 人以爲此呆病不必治也”라 하여 병전과 다른 성격과 인격의 변화에 대해서 서술하였고 “終日 閉戶獨居 口中喃喃 多不可解將自己衣服 鍼線蜜蜂 與之飮食 時而用 時而不用 嘗有數日 고腹 而不呼飢餓者 見炭最善 食之如爽口之物人皆棄之” 외부환경과의 소외, 언어곤란, 식사상태변화 등에 관해 언급하였다. 병리로는 肝氣鬱滯와 胃氣衰退가 원인이 된 胸中의 痰이 積滯되는 것을 언급하고 치법으로 開氣鬱結 逐其痰 健其胃을 제시하였다. 淸代 王7)은 <醫林改錯>에서 “靈機記性不在心在腦”라 하여 精神思惟活動이 腦에 의해 이루어짐을 인식하였고, “小兒無記性者 腦髓未滿 高年無記性者 腦髓漸空”이라 하여 老年虛衰로 인해 腦髓가 空虛하게 되면 呆病에 걸릴 수 있음을 설명하였다.
AD를 유발하는 Aβ25-35로 처리된 SH-SY5Y cell에서 蓮根추출물의 신경세포 보호효과를 실험하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
1% Tween 20을 포함하는 Tris-buffered saline (TBS-T)로 씻은 후 5% Skim milk로 30분 이상 blocking하였다. 인산화 IKBa (p-IKBa), IKBa, 인산화 JNK (p-JNK), JNK (Cell signaling tech. USA), 인산화 tau (p-tau, Ser262) 및 actin 항체(Cell signaling tech. USA)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음 막을 TBS-T에서 10분씩 3회 세척한 후 blot을 2차 항체와 함께 1시간 반응시켰다. 2차 항체 반응 뒤 막을 씻고 enhanced chemiluminiscence system (ECL, Pierce)으로 원하는 단백질을 가시화 하였다.
대상 데이터
실험에 사용한 neuroblastoma cell line, SH-SY5Y 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입을 하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (FBS; Invitrogen, USA)이 함유된 DMEM (Invitrogen, USA)배지를 사용하여 배양하였다.
실험에 사용한 neuroblastoma cell line, SH-SY5Y 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입을 하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (FBS; Invitrogen, USA)이 함유된 DMEM (Invitrogen, USA)배지를 사용하여 배양하였다. 오염 방지를 위해 항생제로 100 unit/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin (Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다.
데이터처리
모든 측정값은 평균값 표준편차(mean±S.D.)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 window용 SPSS Program의 student t-test로 검정하여 p 값이 0.05 이하인 경우 유의한 것으로 인정하였다.
이론/모형
MTT (tetrazolium3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) assay는 Sladowski의 방법15)을 따라 행하였다. MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 세포의 능력을 이용하는 검사법이다.
정량된 단백질 시료 50μg을 4∼12% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel(Invitrogen) 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 분리하였고, nitrocellulose paper (Amersham)로 옮겼다.
8, 2% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol) 내에 boiling cell에 의해 만들어졌다. 단백질 정량은 bicinchoninic acid (BCA, Pierce)법을 사용하였다. 정량된 단백질 시료 50μg을 4∼12% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel(Invitrogen) 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 분리하였고, nitrocellulose paper (Amersham)로 옮겼다.
세포내에서 Catalase의 활성도 측정은 Catalase activity assay kit (Cell Biolabs, Inc. USA)를 사용하였다. 본 실험법의 작용기전은, 일차적으로 세포내 존재하는 catalse에 의해 외부에서 넣어준 H2O2가 물과 산소로 해리되고 남은 H2O2가 Horse radish peroxidase (HRP)에 의해 3,5-dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonic acid (DHBS), 4-aminoantipyrene (AAP)과 반응하여 Quinoneimine dye를 생성하게 된다.
SH-SY5Y cells were treated with various concentrations of LRE for 24 hours. Cell viability was determined by the MTT assay. Values are mean±S.
카탈라제 활성은 Aβ25-35만 처리한 세포의 경우보다 50μg/ml의 蓮根추출물에 전처리 후 Aβ25-35의 자극을 받은 경우 통계적으로 유의하게 저해되었다(Fig. 5).
SH-SY5Y cell에 50μg/ml의 蓮根추출물로 처리 후 20μM의 Aβ25-35로 6시간 자극을 준 후 면역학적 블로팅법으로 검사하였더니 Tau의 인산화가 통계적으로 유의하게 저해되었다(Fig. 6).
아무런 약재를 처리하기 않고 Aβ25-35만을 처리한 세포에서 JNK의 인산화는 대조군에 비해 2.5배 이상 증가하였으나 蓮根 추출물을 처리한 세포는 JNK의 인산화가 약 1.3배로 저해되었다(Fig. 7).
따라서 기존에 연구된 蓮根의 신경보호효과와 타우와 Aβ, 활성산소를 瘀血로 착안하여 지혈시키거나 瘀血을 제거하는 등 혈행의 흐름을 원활하게 해 줄 수 있는 蓮根이 AD에 유의한 효과가 나타날 것이라 사료되었다.
蓮根 추출물이 IkBα의 인산화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 세포내 IkBα의 인산화증가가 저해되었는데(Fig. 8), 이러한 결과는 蓮根 추출물이 NFκB가 활성화를 막아 세포사멸을 억제함을 의미하고, 蓮根추출물이 Aβ25-35에 의한 세포 독성을 감소시킬 때 p75-neurotrophin receptor (p75NTR)를 통한 NFκB의 신호전달 체계에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
또한 Catalase의 활성을 측정한 결과 Aβ에 의해 약 177% 정도 증가하였으나 蓮根 추출물에 의해 통계적으로 유의하게 Catalase의 활성이 저하되었다(Fig. 5).
Aβ의 독성기전 중 하나는 ROS의 영향으로, 항산화 효소(Superoxide dismutase; SOD)의 활성실험결과 Aβ25-35에 의해 SH-SY5Y cell SOD의 활성이 대조군에 비해 2배 정도 증가되었으나 蓮根 추출물에 의해 SOD의 활성이 47% 저해되었다(Fig. 4).
산화적 스트레스에 대한 蓮根 추출물의 세포보호 효과를 관찰한 결과 H2O2로 독성을 유발시킨 대조군의 세포 생존율이 75.4%에 비해 50μg/ml의 蓮根추출물로 전처리한 SH-SY5Y cell은 세포생존율이 98.24%로 증가하였다(Fig. 3).
본 연구에서는 Aβ로 유도되는 세포 독성실험에서 蓮根추출물로 실험한 SH-SY5Y cell의 세포생존율이 대조군에 비해 높게 관찰되었다.
蓮根추출물이 JNK의 인산화에 미치는 영향을 관찰한 결과 蓮根추출물은 JNK의 인산화를 저해시킴을 확인하였다. 이것은 세포사멸시 발생하는 산화적 스트레스를 억제시키고, 그 이후의 신호전달 체계인 JNK의 활성을 저해함으로써 세포사멸을 억제시킴을 시사하는 것이다.
이상의 결과는 蓮根추출물이 신경세포보호효과, 항산화효과, 항인산화효과를 나타낸다. 이는 Aβ 및 Tau로 야기되는 AD환자의 치료 및 예방에 도움을 줄 수 있는 신약개발에 대한 in-vitro 실험으로 향후 형질변환 백서에 대한 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다.
1. H2O2로 세포독성을 일으킨 SH-SY5Y cell에서 산화적 스트레스로 유발되는 세포사멸을 억제함을 나타냈고, 50μg/ml 蓮根추출물로 전 처리된 cell이 20μg/ml 蓮根추출물로 전 처리된 cell보다 더 유의한 세포보호효과를 나타내었다.
2. Aβ25-35로 세포독성을 일으킨 SH-SY5Y cell의 SOD활성에 대한 억제효과를 보는 실험에서 활성산소를 떨어뜨리는 효과를 나타내었다.
3. Aβ25-35로 유도된 Catalase 활성의 억제효과를 보는 SH-SY5Y cell의 실험에서 활성산소를 감소시키는 효과를 나타내었다.
4. Aβ25-35에 의해 발생하는 타우의 인산화에 대한 SH-SY5Y cell의 실험에서 유의한 항인산화효과를 나타내었다.
5. Aβ25-35에 의해 발생하는 JNK의 인산화에 대한 SH-SY5Y cell의 실험에서 유의한 항인산화효과를 나타내었다.
6. Aβ25-35로 의해 야기된 IKB의 인산화에 대한 SH-SY5Y cell의 실험에서 유의한 항인산화효과를 나타내었다.
7. 신경세포 사멸 억제 기전은 Aβ에 의해 발생하는 세포사멸에 대해 산화적 스트레스 억제와 그 이후의 신호전달 체계인 JNK의 활성을 저해함으로 억제하는 것으로 사료된다.
SH-SY5Y cell에 蓮根 추출물을 각각 20, 50μg/ml의 농도로 30분 전에 전 처리 후 200μM의 H2O2를 처리하고 24시간이 지난 후에 MTT 방법으로 세포생존율을 관찰한 결과 H2O2만을 처리한 SH-SY5Y cell의 세포 생존율보다 蓮根추출물을 처리한 세포의 생존율이 높았고 농도는 20μg/ml보다 50μg/ml에서 세포생존율이 높았다.
후속연구
이는 Aβ 및 Tau로 야기되는 AD환자의 치료 및 예방에 도움을 줄 수 있는 신약개발에 대한 in-vitro 실험으로 향후 형질변환 백서에 대한 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다.
8), 이러한 결과는 蓮根 추출물이 NFκB가 활성화를 막아 세포사멸을 억제함을 의미하고, 蓮根추출물이 Aβ25-35에 의한 세포 독성을 감소시킬 때 p75-neurotrophin receptor (p75NTR)를 통한 NFκB의 신호전달 체계에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 차후 어떠한 기전으로 IkB alpha의 인산화를 저해시켰는지에 관한 추후 연구가 더 필요하다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
한의학에서 치매는 어떤 범주에 포함되는가?
한의학적으로 치매는 呆病, 健忘, 癲狂의 범주에 포함된다3). 呆病에 관해 明代 張4)은 病因을 情緖상의 문제로 보았고 病理는 逆氣가 心에 있는 것과 肝膽二經의 氣不淸으로 보았으며 胃氣와 元氣의 强弱으로 可治와 不治로 나누었다.
蓮根은 무엇인가?
蓮根은 本草名으로 藕節로, 연꽃(蓮)Nelumbo nucifera 의 비대한 根莖이다8,9). 止血 및 瘀血을 제거하는 효능이 있어서 각종의 出血 증후에 사용한다8-11).
알츠하이머병는 환자의 뇌에 어떤 영향을 미치는가?
환자의 뇌는 특히 대뇌피질의 뇌신경세포의 소실로 인해 광범위한 뇌회의 위축이 나타나며 결과적으로 뇌실이 상대적으로 커지게 된다. 조직학적 소견으로 신경반(neuritic plaque)과 신경원섬유농축(neurofibrillary tangle, NFT)이 나타난다2).
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