Objectives : Seungmagalgeun-tang (SMGGT) is traditional medicine widely used for inflammatory disease and flu. But SMGGT exhibits potent anti-inflammatory activity with an unknown mechanism. To elucidate the molecular mechanisms of SMGGT water extract on pharmacological and biochemical actions in in...
Objectives : Seungmagalgeun-tang (SMGGT) is traditional medicine widely used for inflammatory disease and flu. But SMGGT exhibits potent anti-inflammatory activity with an unknown mechanism. To elucidate the molecular mechanisms of SMGGT water extract on pharmacological and biochemical actions in inflammation, we examined the effect of SMGGT on pro-inflammatory mediators in Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)+A23187-stimulated mast cells. Methods : In the present study, pro-inflammatory cytokine production was determined by performing enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and western blot analysis to measure the activation of MAPKs. Cells were treated with SMGGT 1 h prior to the addition of 50 nM of PMA and $1{\mu}M$ of A23187. Cell viability was measured by MTS assay. The investigation focused on whether SMGGT inhibited the expressions of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in PMA+A23187-stimulated mast cells. Results : SMGGT has no cytotoxicity at examined concentration (100, 250, and $500{\mu}g/ml$). Also, gene expression of IL-6 and IL-8 in HMC-1 cells stimulated by PMA+A23187 was down regulated by SMGGT. Furthermore, SMGGT suppressed the PMA+A23187-induced phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and c-jun N-terminal Kinase(JNK). But, SMGGT could not regulate phosphorylation of p38 MAPK. Conclusions : These results suggest that SMGGT has inhibitory effects on PMA+A23187-induced IL-6 and IL-8 production. These inhibitory effects occur through blockades on the phosphorylation of ERK and JNK.
Objectives : Seungmagalgeun-tang (SMGGT) is traditional medicine widely used for inflammatory disease and flu. But SMGGT exhibits potent anti-inflammatory activity with an unknown mechanism. To elucidate the molecular mechanisms of SMGGT water extract on pharmacological and biochemical actions in inflammation, we examined the effect of SMGGT on pro-inflammatory mediators in Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)+A23187-stimulated mast cells. Methods : In the present study, pro-inflammatory cytokine production was determined by performing enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and western blot analysis to measure the activation of MAPKs. Cells were treated with SMGGT 1 h prior to the addition of 50 nM of PMA and $1{\mu}M$ of A23187. Cell viability was measured by MTS assay. The investigation focused on whether SMGGT inhibited the expressions of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in PMA+A23187-stimulated mast cells. Results : SMGGT has no cytotoxicity at examined concentration (100, 250, and $500{\mu}g/ml$). Also, gene expression of IL-6 and IL-8 in HMC-1 cells stimulated by PMA+A23187 was down regulated by SMGGT. Furthermore, SMGGT suppressed the PMA+A23187-induced phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and c-jun N-terminal Kinase(JNK). But, SMGGT could not regulate phosphorylation of p38 MAPK. Conclusions : These results suggest that SMGGT has inhibitory effects on PMA+A23187-induced IL-6 and IL-8 production. These inhibitory effects occur through blockades on the phosphorylation of ERK and JNK.
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문제 정의
이에 본 연구는 升麻葛根湯 물추출물의 항염증 활성을 조사하기 위하여 protein kinase C activator인 PMA와 Calcium Ionophore인 A23187로 자극된 HMC-1 세포가 방출하는 IL-6, IL-8의 생성과 그것을 억제하는 기전을 밝히고자 한다.
제안 방법
MAPKs의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse p-ERK, p-JNK, p-p38 (1 : 1000)과 anti-rabbit ERK, JNK, p38 (1 : 1000)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL Substrate로 3분 간 반응 후 ImageQuantTM LAS 4000 mini을 이용하여 Chemiluminescence을 촬영하였다.
HMC-1의 염증성 cytokine 분비를 확인하기 위해 IL-6, IL-8을 ELISA를 하였다. 실험 결과, PMA와 A23187을 병용 투여한 HMC-1 세포에서 IL-6과 IL-8 가 발현 되었으며, 升麻葛根湯 물추출물이 투여된 HMC-1에서는 IL-6의 발현이 농도 의존적으로 억제되었으며, IL-8의 발현도 억제되었음을 확인할 수 있다 (Figure 2).
1% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. MAPKs의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse p-ERK, p-JNK, p-p38 (1 : 1000)과 anti-rabbit ERK, JNK, p38 (1 : 1000)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL Substrate로 3분 간 반응 후 ImageQuantTM LAS 4000 mini을 이용하여 Chemiluminescence을 촬영하였다.
PMA + A23187의 자극 경로를 확인하기 위해 MAPKs (ERK, JNK, p38)의 인산화를 Western blot을 통해 확인하였다. 실험 결과, 실험 결과, PMA와 A23187을 병용 투여한 HMC-1 세포에서 ERK, JNK, p38이 인산화되었으며, 升麻葛根湯 물추출물이 투여된 HMC-1에서는 ERK, JNK의 인산화가 억제되었음을 확인 할 수 있었고, p38은 변화가 없었다 (Figure 4).
升麻葛根湯 물추출물에 의한 IL-6, IL-8 mRNA 발현과의 상관성을 알아보기 위하여 RT-PCR로 mRNA 발현을 조사하였다. HMC-1을 6 well plate에 5 × 106 cells로 분주한 다음, 30분간 안정화 시켰다.
이때 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 3분 동안 반응시켰다. 만들어진 RNA를 2% Agarose Gel에 전기영동시켜 EtBr을 사용하여 UV 검출기로 확인하였다.
먼저 HMC-1을 같은 수 (1 × 104 cells)로 준비한 후 30분이 지나서 升麻葛根湯 물추출물을 농도별로 처리하였다.
세포 독성은 MTS assay를 이용하여 확인하였다. 먼저 HMC-1을 같은 수 (1 × 104 cells)로 준비한 후 30분이 지나서 升麻葛根湯 물추출물을 농도별로 처리하였다.
5µg을 넣어 cDNA를 만들었다. 여기에 IL-6, IL-8, GADPH Primer를 넣고 유전자 증폭기(thermal cycler)를 이용하여 증폭시켰다. 이때 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 3분 동안 반응시켰다.
염증성 cytokine인 IL-6, IL-8의 gene의 발현을 확인하기 위해 IL-6, IL-8 mRNA의 전사를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 실험 결과, PMA와 A23187을 병용 투여한 HMC-1세포에서 IL-6과 IL-8의 mRNA가 발현되었으며, 升麻葛根湯 물추출물이 투여된 HMC-1에서는 IL-6와 IL-8의 mRNA의 발현이 억제되었음을 확인 할 수 있다 (Figure 3).
대상 데이터
IMDM 배지와 항생제는 Hyclone (Hyclone Labs Logan, UT)에서 구입하였다. Cell culture dish와 plate는 SPL(SPL Life Science, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. IL-6, IL-8 은 효소결합면역측정 (ELISA) 키트를 R&D Systems (R&D Systems Inc.
Human mast cell-1 (HMC-1)은 항생제 (100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin)를 첨가하고 불활성화된 FBS가 10% 비율로 함유된 IMDM 배지에서 온도 37℃ 이산화탄소 5% 조건에서 배양하였다.
IL-6, IL-8 은 효소결합면역측정 (ELISA) 키트를 R&D Systems (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였으며, COX-2, MAPKs (ERK, JNK, p38) 항체 및 Peroxidase conjugated 2차 항체는 Santa Cruz(CA, USA)사에서 구입하였다.
모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차 (Mean±SD)를 구했으며, 그 유의성은 Student’s t-test 분석법을 이용하여 신뢰수준 95% 이상 (p < 0.05)에서 통계적 유의성을 평가하였다.
이론/모형
Effect of SMGGT extract on cell viability in HMC-1 cells. Cell viability was evaluated with the MTS assay. Data represent the means ± SD.
升麻葛根湯 물추출물이 세포의 생존에 미치는 영향을 측정하기 위해 MTS를 사용한 분석법을 이용하였다. 升麻葛根湯 물추출물은 500 ug/mL 이하 농도에서 90%이상의 생존율을 보여 세포의 생존에 큰 영향을 미치지 않았다(Figure 1).
이후 升麻葛根湯 물추출물 (100, 250, and 500 µg/mL)을 1시간 동안 처리한 후, PMA (50 nM)와 A23187 (1 µM)로 HMC-1을 8시간 자극한 후 세포 부유액을 원심분리하여 세포들을 침전시켜 상층액을 수집하고, 상층액 내 IL-6, IL-8 생성량을 ELISA kit를 이용하여 사용자 매뉴얼에 기재된 방법인 Sandwich ELISA법대로 정량하여 분석하였다.
2. 升麻葛根湯가 PMA + A23187로 유도된 HMC-1에서 MAPKs 인산화를 저해 하는지 알아보기 위해 western blot으로 확인한 결과 MAPKs (ERK, JNK, but not p38), 인산화가 저해되었다.
HMC-1의 염증성 cytokine 분비를 확인하기 위해 IL-6, IL-8을 ELISA를 하였다. 실험 결과, PMA와 A23187을 병용 투여한 HMC-1 세포에서 IL-6과 IL-8 가 발현 되었으며, 升麻葛根湯 물추출물이 투여된 HMC-1에서는 IL-6의 발현이 농도 의존적으로 억제되었으며, IL-8의 발현도 억제되었음을 확인할 수 있다 (Figure 2).
염증성 cytokine인 IL-6, IL-8의 gene의 발현을 확인하기 위해 IL-6, IL-8 mRNA의 전사를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 실험 결과, PMA와 A23187을 병용 투여한 HMC-1세포에서 IL-6과 IL-8의 mRNA가 발현되었으며, 升麻葛根湯 물추출물이 투여된 HMC-1에서는 IL-6와 IL-8의 mRNA의 발현이 억제되었음을 확인 할 수 있다 (Figure 3).
PMA + A23187의 자극 경로를 확인하기 위해 MAPKs (ERK, JNK, p38)의 인산화를 Western blot을 통해 확인하였다. 실험 결과, 실험 결과, PMA와 A23187을 병용 투여한 HMC-1 세포에서 ERK, JNK, p38이 인산화되었으며, 升麻葛根湯 물추출물이 투여된 HMC-1에서는 ERK, JNK의 인산화가 억제되었음을 확인 할 수 있었고, p38은 변화가 없었다 (Figure 4).
요약하면, 升麻葛根湯 물추출물은 염증성 cytokine인 IL-6, IL-8의 분비를 억제하고, IL-6와 IL-8의 mRNA로의 전사 또한 억제하며, 이 억제는 MAPKs 중 ERK와 JNK의 인산화를 억제함으로써 나타난다고 할 수 있다. 이러한 연구 결과는 升麻葛根湯이 예로부터 傷寒, 溫病 등에 사용되어 온 것을 실험적으로 확인하는 것이며, 升麻葛根湯이 염증질환에 대한 유효한 치료 약물이 될 수 있다는 것을 알 수 있다.
요약하면, 升麻葛根湯 물추출물은 염증성 cytokine인 IL-6, IL-8의 분비를 억제하고, IL-6와 IL-8의 mRNA로의 전사 또한 억제하며, 이 억제는 MAPKs 중 ERK와 JNK의 인산화를 억제함으로써 나타난다고 할 수 있다. 이러한 연구 결과는 升麻葛根湯이 예로부터 傷寒, 溫病 등에 사용되어 온 것을 실험적으로 확인하는 것이며, 升麻葛根湯이 염증질환에 대한 유효한 치료 약물이 될 수 있다는 것을 알 수 있다.
이와 같은 結果로 보아 升麻葛根湯 물추출물은 염증성 cytokine인 IL-6, IL-8의 분비를 억제하고, IL-6와 IL-8의 mRNA로의 전사 또한 억제하며, 이 억제는 MAPKs 중 ERK와 JNK의 인산화를 억제함으로써 나타난다고 할 수 있다. 이러한 연구 결과는 升麻葛根湯이 예로부터 상한, 온병 등에 사용되어 온 것을 실험적으로 확인하는 것이며, 升麻葛根湯이 염증질환에 대한 유효한 치료 약물이 될 수 있다는 것을 알 수 있다.
MAPKs는 활성화되어 다른 kinase, 전사인자들이 활성화 되도록 하고 표적유전자의 발현을 조절하고, 표적유전자 발현의 조절은 세포 소기관과 효소를 조절하는 역할을 한다21). 이번 연구에서 HMC-1세포에 PMA와 A23187을 투여하였을 때 升麻葛根湯 물추출물이 ERK, JNK의 인산화를 억제하고, p38은 그렇지 않은 것으로 보아 升麻葛根湯 물추출물이 ERK, JNK 경로에 영향을 주고, p38경로에는 영향을 주지 않는다고 볼 수 있다.
IL-6의 분비가 증가한다는 것은 염증반응이 일어났다는 것을 뜻한다. 이번 연구에서 PMA와 A23187에 의해 자극된 HMC-1에서 升麻葛根湯 물추출물이 IL-6와 IL-8의 분비와 전사를 억제한다는 것을 확인하였다.
이와 같은 結果로 보아 升麻葛根湯 물추출물은 염증성 cytokine인 IL-6, IL-8의 분비를 억제하고, IL-6와 IL-8의 mRNA로의 전사 또한 억제하며, 이 억제는 MAPKs 중 ERK와 JNK의 인산화를 억제함으로써 나타난다고 할 수 있다. 이러한 연구 결과는 升麻葛根湯이 예로부터 상한, 온병 등에 사용되어 온 것을 실험적으로 확인하는 것이며, 升麻葛根湯이 염증질환에 대한 유효한 치료 약물이 될 수 있다는 것을 알 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
IL-6는 주로 어디에서 생성되는가?
이러한 cytokine의 발현은 염증 반응을 확인할 수 있는 수단 중 하나이다13). IL-6는 염증 반응의 매개인자인데 T cell, macrophage, monocyte, synovial fibroblast에서 주로 생성된다. IL-8은 비만세포에서 분비되어 neutrophil, T-lymphocyte, eosinophil와 같은 주변의 세포에 영향을 주고, 염증성 세포의 활성화에 중요한 역할을 한다14).
升麻葛根湯이란 무엇인가?
升麻葛根湯은 宋대 錢乙이 저술한 小兒藥証直訣의 閻氏小兒方論에 처음 수록된 처방이다. 小兒藥証直訣에는 傷寒, 溫疫, 風熱, 壯熱, 頭痛, 肢體痛, 瘡疹 등에 사용한다고 했고, 東醫寶鑑에는 溫疫만이 아니라 癍疹, 癮疹 등에 사용한다고 하였다1,2).
升麻葛根湯은 어디에 사용되는가?
升麻葛根湯은 宋대 錢乙이 저술한 小兒藥証直訣의 閻氏小兒方論에 처음 수록된 처방이다. 小兒藥証直訣에는 傷寒, 溫疫, 風熱, 壯熱, 頭痛, 肢體痛, 瘡疹 등에 사용한다고 했고, 東醫寶鑑에는 溫疫만이 아니라 癍疹, 癮疹 등에 사용한다고 하였다1,2). 傷寒, 溫疫, 癍疹, 癮疹 등의 증상은 주로 염증과 알러지성 증상으로 변화하는 경우가 많다.
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