본 연구는 닭 정액 동결 보존을 위하여 동결 보호제로 7%의 DMA, DMF 그리고 7.5%의 MA를 이용하여 동결 융해 후 정자의 생존율, 정상 첨체율 및 미토콘드리아의 활성도를 FACS를 이용하여 평가하고, 수정률과의 상관관계를 조사하고자 수행하였다. 닭 정액을 동결한 결과, DMF를 사용하였을 때 생존율은 $52.1{\pm}5.52%$로 DMA와 MA에 비해 유의적으로 높았으며(P<0.05), DMA $46.94{\pm}5.06%$, MA $36.56{\pm}4.66%$순으로 나타났다(P<0.05). 첨체막이 파열되고 죽은 정자는 이와 반대로 MA를 이용하여 동결한 정액이 $61.16{\pm}1.86%$로서 가장 높았고, DMA $47.48{\pm}1.9%$ DMF $36.56{\pm}1.42%$순으로 유의적 차이를 보였다(p<0.05). 정자 미토콘드리아 막이 손상되지 않은 생존 정자는 DMF를 이용하여 동결한 정액에서 $52.68{\pm}1.07%$로 가장 높게 나타났고, DMA $44.46{\pm}1.04%$, MA $38.36{\pm}1.88%$순으로 유의적 차이를 나타냈다(p<0.05). 7% DMF를 사용하여 동결하였을 때 수정률은 유의적인 차이가 없었지만, 생존율 및 미토콘드리아 활성도가 유의적으로 가장 높았으며, 정상 첨체율이 유의적으로 높았다. 이는 DMF를 이용한 닭 정자 동결법이 정자의 세포막과 첨체의 손상에 미치는 영향이 가장 낮은 동결 보호제인 것으로 사료된다.
본 연구는 닭 정액 동결 보존을 위하여 동결 보호제로 7%의 DMA, DMF 그리고 7.5%의 MA를 이용하여 동결 융해 후 정자의 생존율, 정상 첨체율 및 미토콘드리아의 활성도를 FACS를 이용하여 평가하고, 수정률과의 상관관계를 조사하고자 수행하였다. 닭 정액을 동결한 결과, DMF를 사용하였을 때 생존율은 $52.1{\pm}5.52%$로 DMA와 MA에 비해 유의적으로 높았으며(P<0.05), DMA $46.94{\pm}5.06%$, MA $36.56{\pm}4.66%$순으로 나타났다(P<0.05). 첨체막이 파열되고 죽은 정자는 이와 반대로 MA를 이용하여 동결한 정액이 $61.16{\pm}1.86%$로서 가장 높았고, DMA $47.48{\pm}1.9%$ DMF $36.56{\pm}1.42%$순으로 유의적 차이를 보였다(p<0.05). 정자 미토콘드리아 막이 손상되지 않은 생존 정자는 DMF를 이용하여 동결한 정액에서 $52.68{\pm}1.07%$로 가장 높게 나타났고, DMA $44.46{\pm}1.04%$, MA $38.36{\pm}1.88%$순으로 유의적 차이를 나타냈다(p<0.05). 7% DMF를 사용하여 동결하였을 때 수정률은 유의적인 차이가 없었지만, 생존율 및 미토콘드리아 활성도가 유의적으로 가장 높았으며, 정상 첨체율이 유의적으로 높았다. 이는 DMF를 이용한 닭 정자 동결법이 정자의 세포막과 첨체의 손상에 미치는 영향이 가장 낮은 동결 보호제인 것으로 사료된다.
The purpose of this study was to evaluate the sperm viability, normal acrosome and mitochondrial activity in the frozen-thawed fowl semen by different cryoprotectants. The experiment was carried out on 10 sexually adult roosters of Ogye. The semen was collected twice a week and pooled semen was dilu...
The purpose of this study was to evaluate the sperm viability, normal acrosome and mitochondrial activity in the frozen-thawed fowl semen by different cryoprotectants. The experiment was carried out on 10 sexually adult roosters of Ogye. The semen was collected twice a week and pooled semen was diluted 1:1 EK extender containing no cryoprotectant at $5^{\circ}C$. After equilibration for 30 minutes, diluted chicken semen was diluted 1:1 extender containing either 7% dimethylacetamide (DMA), 7% dimethylformamide (DMF) or 7.5% methylacetamide (MA) at final concentration and was put in 0.5 mL plastic straws and frozen for 30 minutes by exposure to liquid nitrogen vapor 4 cm above the surface of liquid nitrogen, followed by plunging into liquid nitrogen. Frozen semen was thawed in water bath at $5^{\circ}C$ for 2 minutes. For cytometric analysis, the frozen-thawed semen was diluted with EK extender to a final concentration of 90 million spermatozoa per mL. Sperm membrane integrity was evaluated as SYBR-14 and propidium iodide (PI). Acrosome integrity was assessed with fluorescein isothiocyanate-labeled PSA and PI. The percentage of mitochondrial function was estimated by using Rhodamine123 (R123) and PI. In conclusion, freezing rooster semen by using 7% DMF as cryoprotectant was significantly highest in rates of survival and mitochondrial function while its rate of damage of acrosome was significantly lowest. As a result, DMF is the cryoprotectant that has the lowest influences on sperm membranes and acrosome integrity. Therefore it could be used for freezing method of animal genetic conservation method for poultry diversity.
The purpose of this study was to evaluate the sperm viability, normal acrosome and mitochondrial activity in the frozen-thawed fowl semen by different cryoprotectants. The experiment was carried out on 10 sexually adult roosters of Ogye. The semen was collected twice a week and pooled semen was diluted 1:1 EK extender containing no cryoprotectant at $5^{\circ}C$. After equilibration for 30 minutes, diluted chicken semen was diluted 1:1 extender containing either 7% dimethylacetamide (DMA), 7% dimethylformamide (DMF) or 7.5% methylacetamide (MA) at final concentration and was put in 0.5 mL plastic straws and frozen for 30 minutes by exposure to liquid nitrogen vapor 4 cm above the surface of liquid nitrogen, followed by plunging into liquid nitrogen. Frozen semen was thawed in water bath at $5^{\circ}C$ for 2 minutes. For cytometric analysis, the frozen-thawed semen was diluted with EK extender to a final concentration of 90 million spermatozoa per mL. Sperm membrane integrity was evaluated as SYBR-14 and propidium iodide (PI). Acrosome integrity was assessed with fluorescein isothiocyanate-labeled PSA and PI. The percentage of mitochondrial function was estimated by using Rhodamine123 (R123) and PI. In conclusion, freezing rooster semen by using 7% DMF as cryoprotectant was significantly highest in rates of survival and mitochondrial function while its rate of damage of acrosome was significantly lowest. As a result, DMF is the cryoprotectant that has the lowest influences on sperm membranes and acrosome integrity. Therefore it could be used for freezing method of animal genetic conservation method for poultry diversity.
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문제 정의
본 연구는 닭 정액 동결 보존을 위하여 동결 보호제로 7%의 DMA, DMF 그리고 7.5%의 MA를 이용하여 동결 융해 후 정자의 생존율, 정상 첨체율 및 미토콘드리아의 활성도를 FACS를 이용하여 평가하고, 수정률과의 상관관계를 조사하고자 수행하였다. 닭 정액을 동결한 결과, DMF를 사용하였을 때 생존율은 52.
본 연구에서는 DMA, DMF 및 MA를 동결 보호제로 사용하여 동결 보존한 닭 정액에 관하여 융해 후 상술된 기법을 활용하여 정자 생존율, 정상 첨체율, 미토콘드리아 활성도를 비교하였으며, 가금 유전자원의 효율적 보존 방법에 적합한 동결 보호제를 선발하는 기초 자료로 활용하고자 실험을 수행하였다.
Amide 계열의 DMA, DMF 및 MA 동결 보호제가 동결 과정 동안에 정자세포를 보호하는 동일한 역할을 하지만, 각기 동결 보호제들은 서로 다른 기작으로 동결 보호제로서의 역할을 수행한다(오신애 등, 2012). 본 연구에서는 닭 정액의 동결보존에 있어서 DMA, DMF 및 MA 동결 보호제를 이용하여 동결융해 후 정자의 생존율, 정상 첨체율, 미토콘드리아 활성도는 FACS를 이용한 후 평가하여 수정률과의 상관관계를 알아보고자 수행하였다. Kirby et al.
제안 방법
20 µM 농도로 조정된 SYBR-14 5 µL를 첨가하여 실온의 밀실에서 5분간 배양하고, 2.4 mM 농도의 PI 5 µL를 첨가하여 다시 5분간 배양한 후에 유세포 분석기(BD FACS AriaⅡ, USA)로 형광의 발현차를 분석하였다.
PI-SYBR+ population은 PI 적색 형광이 발현되지 않았고, SYBR의 녹색 형광만 발현하는 cells로 정자원형질막이 손상되지 않음을 나타내었다. PI+SYBR- population은 적색 형광만 발현되고, 녹색형광은 발현되지 않는 죽은 cells을 나타냈으며, PI+SYBR+ population은 PI와 SYBR의 염색이 둘 다 이루어진 경우로 죽어가는 세포군으로 분석하였다. 동결 보호제에 따른 정자 생존율의 결과는 Table 2와 같다.
염색되지 않은 PI-SYBR- population은 세포 잔여물(debris)로 간주 하였다. PI-R123+ population은 살아 있으며, 미토콘드리아 활성도가 높은 군으로 간주하였으며, PI+R123와 PI+R123+ population은 죽은 정자로 미토콘드리아의 활성도가 없거나 낮아지는 정자군으로 분석하였다(Fig. 4). 정자의 미토콘드리아 활성도가 유지되면서 살아있는 정자는 DMF를 이용하여 동결한 정액에서 52.
1). SYBR-14 대 PI의 형광 발현은 2차원적 dot plots으로 표현되었으며, 4가지 집단으로 나누어 분석하였다. PI-SYBR- population은 염색이 되지 않은 것을 나타내며, DNA를 포함하지 않는 debris로 간주 되었다.
동결 보호제에 의하여 닭 정액의 동결 및 융해과정에서 나타날 수 있는 정상 첨체율을 관찰하기 위하여 FITC-PSA와 PI 염색 후 FACS를 이용하여 정자세포를 분석하였으며(Fig. 2), 그 결과는 Table 3과 같다.
미토콘드리아 활성도 검사는 Rhodamine123(R123, Sigma, USA)와 PI 형광 염색을 이용한 이중염색 방법을 이용하여 FACS로 형광의 발현차를 분석하였다. EK 희석액으로 90×106/mL로 희석된 500 µL 정액에 methanol를 이용하여 1 mg/mL로 희석된 R123 stock solution을 증류수를 이용하였다.
실험군별 생존율 검사는 SYBR-14와 PI(Live/Dead sperm viability Kit, Invitrogen, USA)이중형광 Probe를 이용하여 EK 희석액에 최종농도 90×106/mL로 희석된 400 µL 정액에 DMSO를 이용하였다.
1 mg/mL로 희석한 R123 5 µL를 첨가하여 실온의 밀실에서 20분간 배양하고, 500 g에 3분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 EK 희석액 500 µL를 점적하여 재 부유하였다. 여기에 PI 염색을 실시하고, 다시 5분간 배양한 후에 FACS로 분석하였다.
염색된 정자는 500 g에 3분간 원심 분리하여 회수하였고, EK 희석액 500 µL를 첨가하고, PI 염색을 실시하고, FACS로 분석하였다.
정자 미토콘드리아의 활성도 평가는 R123와 PI 형광 염색 후 FACS를 이용하여 분석하였다(Fig. 3). 염색되지 않은 PI-SYBR- population은 세포 잔여물(debris)로 간주 하였다.
정자의 생존율은 SYBR-14와 PI 형광 염색 후 FACS를 이용하여 형광발현 분포로 조사하였다(Fig. 1). SYBR-14 대 PI의 형광 발현은 2차원적 dot plots으로 표현되었으며, 4가지 집단으로 나누어 분석하였다.
첨체 손상 검사는 Fluorescein isothiocyanate-labeled PSA(FITC-PSA; Lectin from Pisum sativum, Sigma, USA)와 PI 형광염색을 이용한 이중염색 방법을 이용하여 FACS로 형광 발현도를 분석하였다. EK 희석액으로 90×106/mL로 희석된 500 µL 정액에 0.
대상 데이터
공시축은 국립축산과학원 가축유전자원시험장에서 보존 중인 연산오계 수탉 10수를 정액 채취용으로 사용하였다.
본 실험에서는 닭 정액은 EK 희석액을 이용하여 희석하였으며, 그 조성은 Table 1과 같다. 운반된 정액은 5℃하에서 동결 보호제가 첨가되지 않은 EK 희석액으로 1:1 비율로 희석 후 30분간 평형시간을 가졌다.
데이터처리
통계 분석은 통계분석프로그램(SPSS version 18.0)을 이용하여 일원분산분석(ANOVA) 후 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test 방법을 이용하여 검정하였다.
이론/모형
정액 채취는 마사지 채취법(Burrows and Quinn, 1935)의 변형인 횡취법(side collection)으로 주 2회 채취하였으며, 눈금이 있는 15 mL 튜브(Becton Dickinson, USA)를 이용하여 정액의 부피를 정량하였다. 채취된 정액은 5℃ 보온병에 담아 신속하게 실험실로 운반하였다.
성능/효과
05). 7% DMF를 사용하여 동결하였을 때 수정률은 유의적인 차이가 없었지만, 생존율 및 미토콘드리아 활성도가 유의적으로 가장 높았으며, 정상 첨체율이 유의적으로 높았다. 이는 DMF를 이용한 닭 정자 동결법이 정자의 세포막과 첨체의 손상에 미치는 영향이 가장 낮은 동결 보호제인 것으로 사료된다.
, 2007). FITC-PSA/PI 염색 후 FACS를 이용하여 정자의 정상 첨체율을 분석한 결과에서 생존율과 동일하게 DMF 처리군이 가장 높은 비율을 나타냈으며, DMF, MA를 이용한 동결정액 순으로 유의적으로 낮은 비율을 나타냈다. 그리고 손상된 첨체는 죽은 정자에서 대부분 관찰할 수 있었으며, 살아있는 정자에서는 정상적인 첨체를 보유하여 첨체반응도가 거의 없으므로 첨체 파열은 동결과 관련되어 세포가 죽은 뒤에 손상된 두부에서 노출된 첨체와 반응하여 첨체반응이 일어난다고 사료된다.
, 2002). SYBR-14와 PI형광 염색 후 FACS로 분석한 결과, 정자막은 DMF를 이용한 동결 정액제조 방법이 가장 높은 정상 첨체율을 나타냈고, MA를 이용한 동결 정액에서 가장 낮은 비율을 관찰하였다.
Table 3에서와 같이 첨체막이 온전한 생존 정자의 비율(PSA-PI- population)은 DMF를 이용하여 동결한 정액이53.84 ± 1.72%로서 가장 높았고, DMA 45.14 ± 2.6%, MA 31.74 ± 2.22 순으로 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
닭 정액을 동결한 결과, DMF를 사용하였을 때 생존율은 52.1 ± 5.52%로 DMA와 MA에 비해 유의적으로 높았으며(P<0.05), DMA 46.94 ± 5.06%, MA 36.56 ± 4.66%순으로 나타났다(P<0.05).
동결 보호제로 DMF를 사용하여 동결 융해한 정자의 생존율(PI-SYBR+ population)은 52.1 ± 5.52%로 가장 높았으며, DMA는 46.94 ± 5.06%, MA는 36.56 ± 4.66% 순으로 유의적인 차이를 보였다(p<0.05).
미토콘드리아 활성도 검사에 이용한 Rhodamine123은 미토콘드리아 내막에 축적되어 형광을 띄며, 미토콘드리아 막이 손상된 정자는 형광물질이 내막에서 유출되어 형광을 띄지 않게 된다. 미토콘드리아 활성도 검사에서도 미토콘드리아 막이 온전한 정자 생존율은 DMF 처리군이 가장 높았으며, DMA와 MA 처리군 순으로 유의적으로 낮아지는 것을 나타냈다.
본 연구의 결과를 종합해 보면 닭 정액 동결 보호제로 7% DMF를 사용하여 동결하였을 때 생존율 및 미토콘드리아 활성도가 유의적으로 가장 높았으며, 정상 첨체율 또한 유의적으로 높게 관찰되었다. 이는 DMF를 이용한 닭 정자 동결법이 정자의 세포막 및 첨체 손상에 미치는 영향이 가장 낮은 동결 보호제인 것으로 사료되며, 가금유전자원의 동결 보존 방법의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
정자 미토콘드리아 막이 손상되지 않은 생존 정자는 DMF를 이용하여 동결한 정액에서 52.68 ± 1.07%로 가장 높게 나타났고, DMA 44.46 ± 1.04%, MA 38.36 ± 1.88%순으로 유의적 차이를 나타냈다(p<0.05).
정자의 미토콘드리아 활성도가 유지되면서 살아있는 정자는 DMF를 이용하여 동결한 정액에서 52.68 ± 1.07%로 가장 높게 나타났고, DMA 44.46 ± 1.04%, MA 38.36 ± 1.88% 순으로 유의적 차이를 나타냈다(p<0.05).
죽은 정자의 비율(PI+ SYBR- population)은 DMF 45.43 ± 5.72%와 DMA 49.27 ± 4.98%는 유의적 차이가 없었으나, MA 처리군은 다른 동결 보호제에 비해 유의적으로 낮았다(p<0.05).
첨체막이 온전한 죽은 정자의 비율(PSA+PI- population)은 DMF를 이용하여 동결한 정액에서 5.86 ± 0.65%, DMA는 2.7 ± 0.35%, MA는 2.0 ± 0.19% 순으로 관찰되었으며, 유의적인 차이를 보였다(p<0.05).
첨체막이 파열되고 죽은 정자는 이와 반대로 MA를 이용하여 동결한 정액이 61.16 ± 1.86%로서 가장 높았고, DMA 47.48 ± 1.9% DMF 36.56 ± 1.42%순으로 유의적 차이를 보였다(p<0.05).
첨체막이 파열되고 죽은 정자의 비율(PSA+PI+ population)은 이와는 반대로 MA를 이용하여 동결한 정액이 61.16 ± 1.86%로서 가장 높았고, DMA 47.48 ± 1.9% DMF 36.56 ± 1.42% 순으로 유의적 차이를 보였다(p<0.05).
05). 첨체막이 파열된 생존 정자의 비율(PSA-PI+ population)은 실험군 간 유의적 차이가 없었다. 첨체막이 온전한 죽은 정자의 비율(PSA+PI- population)은 DMF를 이용하여 동결한 정액에서 5.
후속연구
본 연구의 결과를 종합해 보면 닭 정액 동결 보호제로 7% DMF를 사용하여 동결하였을 때 생존율 및 미토콘드리아 활성도가 유의적으로 가장 높았으며, 정상 첨체율 또한 유의적으로 높게 관찰되었다. 이는 DMF를 이용한 닭 정자 동결법이 정자의 세포막 및 첨체 손상에 미치는 영향이 가장 낮은 동결 보호제인 것으로 사료되며, 가금유전자원의 동결 보존 방법의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
생식세포의 동결보존은 어떻게 이용되는가?
생식세포의 동결보존은 가금 산업 및 유전자원 보존을 위한 유용한 방법으로 이용되고 있으며, 정액의 동결보존 기술의 시작은 glycerol이 닭 정자의 동결보존에 효과가 있다는 사실을 입증하면서 세포 동결에 관한 과학적 접근이 가장 먼저 시도되었다(Polge et al., 1949).
정자 동결보존이 미치는 영향은 무엇인가?
동결보존은 정자에 유해한 영향을 미치며, 미토콘드리아와 첨체 부위의 구조적 손상(Harris et al., 1973; Xia et al., 1988)과 세포막 투과성 변화를 야기하는 것으로 보고되었다(Blesbois et al., 2005).
SYBR-14와 PI을 주로 이용하는 생사염색법의 특징은 무엇인가?
, 2004). 전자는 세포 사망이 일어나 세포막의 투과성이 떨어지게 되어 DNA와 결합된 형태가 유리되어 형광이 소실되는 특성을 보유하며 살아있는 정자만을 염색하여 녹색 형광 반응을 나타내며, 후자는 죽은 세포에서 막 투과성이 낮아지면 세포막을 쉽게 침투하여 염색되어 죽은 세포만을 염색되는 특성을 보유하여 적색 형광 반응도를 나타낸다. 정자 첨체의 이상 유무를 판단하는 방법은 정자의 수정 능력을 추정하는 방법으로 PNA(peanut agglutinin)나 PSA(pisum sativum agglutinin)와 같은 lectin 이 형광시약에 결합된 물질을 주로 활용하고 있다.
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