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문제 정의
- 본 연구에서는 만형자의 물 추출물(WEVF)이 알레르기 반응 및 염증반응에 미치는 효과를 확인하기 위하여 생체내 실험으로 약물의 직장 투여에 의한 compound 48/80 유도 전신성 알레르기 반응과 anti-DNP IgE 매개 국소성 알레르기 반응에 대한 실험을 하였다. 또 생체외 실험으로 인체 비만세포주인 HMC-1 세포에서 phorbol 12-myristate 13-acetate와 calcium ionophore A23187(PMACI)에 의한 히스타민 유리, 세포내 칼슘의 분석 및 염증유발성 사이토카인의 유전자 발현에 대한 영향을 검토하였다.
제안 방법
- 27) WEVF의 히스타민 유리 억제 기전을 검토하기 위하여 비만세포내 칼슘의 양을 측정하였다. 양성대조군으로 gallic acid와 칼슘 chelator인 1,2-bis(2-aminophenoxy) ethane– N,N,N,’N’-tetraacetic acid acetoxymethyl ester(BAPTA-AM) (BAPTA)을 사용하였다.
- Compound 48/80 유도 전신성 알레르기 반응에 대한 WEVF의 효과 − 즉시형 과민반응에 대한 WEVF의 효과를 검토하기 위하여 compound 48/80을 사용하여 전신성 아나 필락시를 유도하였다.
- anti-DNP IgE로 감작시킨 비만세포를 DNP-HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 WEVF (1-1000 mg/kg, 체중)를 직장투여하고 30분 후에 치사시켰다. Evans blue로 염색된 피부 부위를 잘라 1 M-KOH 1 mL 를 가하고 인산과 아세톤(5:13)의 혼액 9 mL를 가하여 색소를 추출한 후 spectrophotometer(Ultrospec 2100 pro uv/vis spectrophotometer, Amersham Biosciences, England)로 620에서 색소량을 측정하였다.
- 비만세포로부터 히스타민 유리에 미치는 WEVF의 효과 − 비만세포에 PMACI를 처리하면 비만세포가 활성화 되면서 세포내 알레르기 유발물질인 히스타민이 유리된다. HMC-1 세포에서 히스타민의 유리에 미치는 WEVF의 효과를 검토하기 위하여 PMACI를 처리하기 10분전에 WEVF 를 처리하였으며 양성대조군으로 항알레르기 효과가 검증된 gallic acid(GA) 26) 를 사용하였다. WEVF(1-100 µg/mL)는비만세포에서 PMACI에 의한 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.
- PCA 반응에 대한 WEVF의 효과 − PCA 반응에 미치는 WEVF의 효과를 검토하기 위하여 DNP-HSA와 evans blue의 혼합액을 투여하기 1시간 전에 WEVF(1-1000 mg/kg)를 직장 투여 하였다.
- RT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석 − RNA를 분리 kit를 사용하여 세포로부터 total RNA를 분리하고 분리된 total RNA의 흡광도를 측정하여 정량한 후 1 µg의 RNA로 cDNA를 합성한 후 주형으로 한 다음 primer를 사용하여 PCR를 증폭하였다.
- 즉 anti-DNP IgE 100 µg을 생쥐의 등에 피내 주사하여 감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체 반응을 야기시켰다. anti-DNP IgE로 감작시킨 비만세포를 DNP-HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 WEVF (1-1000 mg/kg, 체중)를 직장투여하고 30분 후에 치사시켰다. Evans blue로 염색된 피부 부위를 잘라 1 M-KOH 1 mL 를 가하고 인산과 아세톤(5:13)의 혼액 9 mL를 가하여 색소를 추출한 후 spectrophotometer(Ultrospec 2100 pro uv/vis spectrophotometer, Amersham Biosciences, England)로 620에서 색소량을 측정하였다.
- 본 연구에서는 만형자의 물 추출물(WEVF)이 알레르기 반응 및 염증반응에 미치는 효과를 확인하기 위하여 생체내 실험으로 약물의 직장 투여에 의한 compound 48/80 유도 전신성 알레르기 반응과 anti-DNP IgE 매개 국소성 알레르기 반응에 대한 실험을 하였다. 또 생체외 실험으로 인체 비만세포주인 HMC-1 세포에서 phorbol 12-myristate 13-acetate와 calcium ionophore A23187(PMACI)에 의한 히스타민 유리, 세포내 칼슘의 분석 및 염증유발성 사이토카인의 유전자 발현에 대한 영향을 검토하였다.
- WEVF(5-1000 mg/kg, 체중)는 compound 48/80 주사 1시간 전에 직장으로 투여하였다. 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분, 10분 및 20분 후에 각각 WEVF(1000 mg/kg, 체중)을 직장으로 투여하였다. 치사율 실험은 아나필락시 쇽을 유발시킨 후 1시간 동안 관찰하였다.
- 실험재료(WEVF) − 본 실험에 사용된 만형자(Viticis Fructus)는 보화당 한의원(전주)에서 구입하였으며 우석대학교 약대 임종필 교수의 감수를 받아 실험에 사용하였다. 만형자를 분쇄 후 정제수로 수욕상에서 5시간 추출하고 감압 농축한 다음 동결 건조하였다. 이 추출물을 사용 직전에 생리식염수 또는 Tyrode buffer A (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.
- 염증유발성 사이토카인의 유전자 발현에 대한 WEVF의효과 − TNF-α, IL-4, IL-6 및 IL-8 등은 잘 알려진 염증유발 물질이며 PMACI의 자극에 의해 비만세포에서 발현된다. 비만세포 유래 염증유발에 대한 WEVF의 효과를 검토하기 위하여 HMC-1 세포를 PMACI로 자극하기 1시간 전에 WEVF을 처리하였다. WEVF(1-100 µg/mL)는 비만세포에서 PMACI에 의한 TNF-α와 IL-6의 유전자 발현을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.
- 세포내 칼슘의 분석 − 세포내 칼슘은 Fluo-3/AM(Molecular Probes, Eugene, OR)을 사용하여 측정하였다.
- 세포독성에 대한 WEVF의 영향 − WEVF의 세포독성을 검토하기 위하여 HMC-1 세포에 WEVF를 처리한 후 MTT 법으로 cell viability를 측정하였으며 양성대조군으로 H2 O2를 사용하였다.
- 만형자를 분쇄 후 정제수로 수욕상에서 5시간 추출하고 감압 농축한 다음 동결 건조하였다. 이 추출물을 사용 직전에 생리식염수 또는 Tyrode buffer A (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2 , 1 mM MgCl2 , 5.6 mM glucose, 0.1% bovine serum albumin)를 사용하여 일정 농도로 조제하였다.
- 즉 anti-DNP IgE 100 µg을 생쥐의 등에 피내 주사하여 감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체 반응을 야기시켰다.
- 즉 o-phthaldialdehyde로 히스타민을 형광유도체화 시킨 후 λex = 353 nm, λem = 438 nm 에서 상대 형광광도를 측정하여 정량하였다.
- 의 방법에 따라 실험하였다. 즉 비만세포의 탈과립제로 compound 48/80(8 mg/kg, 체중)을 생쥐의 복강 내에 주사 하였다. WEVF(5-1000 mg/kg, 체중)는 compound 48/80 주사 1시간 전에 직장으로 투여하였다.
- 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분, 10분 및 20분 후에 각각 WEVF(1000 mg/kg, 체중)을 직장으로 투여하였다. 치사율 실험은 아나필락시 쇽을 유발시킨 후 1시간 동안 관찰하였다.
대상 데이터
- TNF-α와 IL-6는 R & D사 (Minneapolis, MN, USA) 제품을 사용하였다.
- 시약 및 세포배양 − Compound 48/80, anti-dinitrophenyl (DNP) IgE, DNP-human serum albumin (HSA), phorbol 12-myristate 13-acetate, calcium ionophore A23187은 Sigma (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.
- 실험동물 − ICR계 mouse는 대한 바이오링크 (충북)에서 구입하여 실험에 사용할 때까지 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%로 유지되는 항온, 항습 사육실에서 사육하였다.
- 실험재료(WEVF) − 본 실험에 사용된 만형자(Viticis Fructus)는 보화당 한의원(전주)에서 구입하였으며 우석대학교 약대 임종필 교수의 감수를 받아 실험에 사용하였다.
- 양성대조군으로 gallic acid와 칼슘 chelator인 1,2-bis(2-aminophenoxy) ethane– N,N,N,’N’-tetraacetic acid acetoxymethyl ester(BAPTA-AM) (BAPTA)을 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 분석 − 실험 결과는 mean±S.E.로 표시하였으며 ANOVA와 Duncan's multiple range tests에 의해 유의성을 검정하여 p<0.05인 결과를 얻었을 때 유의성이 있는 것으로 하였다.
이론/모형
- Compound 48/80에 의한 전신성 아나필락시 − 김 등24)의 방법에 따라 실험하였다.
- 1 to 100 µg/ mL) for 24 h. The cell viability was determined using MTT assay. Cell viability was determined by the relative absorbance, compared to control.
- 세포독성 − WEVF에 대한 세포독성은 신 등의 방법25)에 따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay에 의해 cell viability를 측정하였다.
- 수동 피부 아나필락시(PCA) − 김 등24) 의 방법에 따라 실험하였다.
- 히스타민의 정량 − 세포배양액 중의 히스타민은 김 등26)의 방법에 따라 실험하였다.
성능/효과
- 1. WEVF는 compound 48/80에 의해 유도된 전신성 알레르기반응 및 anti-DNP IgE로 유도된 국소성 알레르기반응을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 8-12) 비만세포는 전신의 장기나 조직에 분포하고 있으며 알레르기 반응의 유발에 필수적인 세포로 알려져 있다.13) 비만세포의 탈과립을 유도하는 활성화는 다가성 항원이 IgE 고친화성 수용체인 FceRI와 응집체를 형성하여 일어나게 되며 IgE 수용체를 통한 자극 외에 compound 48/80, protein kinase C(PKC) activator인 phorbol 12-myristate 13-acetate 와 calcium ionophore A23187 등과 같은 약리학적 복합물질에 의해 일어나게 된다.14-16) 비만세포의 탈과립 유도물질중 compound 48/80은 비만세포 내의 칼슘 수준을 증가시켜 전신성 알레르기 반응을 일으키며 적당량의 compound 48/80은 아나필락시의 기전을 연구하기 위한 히스타민 유리 촉진제로서 널리 사용되고 있다.
- 19) 비만세포의 활성화로 화학적 매개물질 이외에도 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor(TNF-α), Interleukin(IL)-1β, IL-6, IL-8 등이 분비되며 이러한 염증유발성 물질에 의해 알레르기 염증반응이 유도된다.
- 2. WEVF는 HMC-1 세포에서 PMACI에 의해 유도된 칼슘농도의 증가를 억제하는 기전으로 히스타민의 유리를 억제하였다.
- 3. WEVF는 PMACI로 자극된 HMC-1 세포에서 TNF-α 와 IL-6의 유전자 발현을 억제하였다.
- WEVF(1-100 µg/mL)는 비만세포에서 PMACI에 의한 TNF-α와 IL-6의 유전자 발현을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 4).
- WEVF(1-100 µg/mL)는비만세포에서 PMACI에 의한 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 3).
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