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문제 정의
- 이와 같은 연구 결과로부터 발정 주기에 따른 자궁액 내의 단백질 변화가 추측된다. 따라서 본 연구는 돼지에서 발정주기동안 자궁으로부터 분비되는 단백질과, 그 변화를 확인하기 위해 프로테오믹스 기법을 이용하여 자궁액 내에 존재하는 단백질을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 0.1% TFA, acetonitrile 혼합액과 0.1% TFA, acetonitrile, 물 혼합액으로 Zip-Tip을 통과시켜 resin으로 시료가 붙게 하였다. 그 후, 0.
- 이것을 18cm인 NL3∼11 IPG strip(GE Healthcare Bio-Sciences AB, USA)를 사용하여 20°C에서 16시간 동안 rehydration을 하였다. Isoelectric Focusing(IEF)는 Protean IEF cell(Bio-Rad)을 이용하여 500 V와 1,000 V에서 1시간, 8,000 V에서 4.5시간, 10,000 V에서 4시간으로 총 10.5시간을 채웠다. IEF를 마친 IPG strip을 equilibration buffer[1.
- MALDI-TOF-TOF는 applied biosystems voyager system 4372를 이용하였으며, 모든 결과는 matrix로 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 이용해 reflector-positive mode로 얻었다.
- MALDI-TOF-TOF는 applied biosystems voyager system 4372를 이용하였으며, 모든 결과는 matrix로 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 이용해 reflector-positive mode로 얻었다. MALDI-TOF-TOF를 통해 얻어진 스펙트럼은 MASCOT program으로 NCBInr에서 database 검색을 실시하였다.
- 고체화된 자궁액은 Mammalian Protein Extraction Reagent(M-per®, Thermo scientific, USA) 300 μl를 첨가하고, Ultrasonic processor와 4°C Rotation을 3회 이상 반복하면서 단백질을 추출하였다.
- 본 연구는 돼지에서 자궁에서 분비되는 자궁액을 난포기와 황체기로 나누어 각 주기별 단백질 발현을 차이를 이차원 전기영동과 MALDI-TOF-TOF를 실시하였다. 이차원 전기영동 후 주기별 전기영동 결과에서 재현성을 나타내는 spot 중 난포기와 황체기에서 각각 따로 나타나는 spot과 유의적으로 발현량의 차이가 나타나는 spot 만을 선발하여 분석 및 동정하였다.
- 돼지의 발정 주기 별 자궁액이 많은 자궁을 도축장에서 회수한 후 4°C 환경을 유지하면서 2시간 이내에 실험실로 운반하였다. 운반된 자궁은 0.85% 생리 식염수로 세척하여 자궁 광인대를 제거하고, 자궁각의 한쪽을 절단하여 자궁액을 회수하였다. 주기 별로 모인 자궁액은 동결건조로 sampling하여 -80°C에 보관하였다.
- 이것을 18cm인 NL3∼11 IPG strip(GE Healthcare Bio-Sciences AB, USA)를 사용하여 20°C에서 16시간 동안 rehydration을 하였다.
- 본 연구는 돼지에서 자궁에서 분비되는 자궁액을 난포기와 황체기로 나누어 각 주기별 단백질 발현을 차이를 이차원 전기영동과 MALDI-TOF-TOF를 실시하였다. 이차원 전기영동 후 주기별 전기영동 결과에서 재현성을 나타내는 spot 중 난포기와 황체기에서 각각 따로 나타나는 spot과 유의적으로 발현량의 차이가 나타나는 spot 만을 선발하여 분석 및 동정하였다. 난포기 자궁액의 단백질 분석에서는 재현성을 나타낸 57개의 spot 중 황체기에서는 나타나지 않은 69번과 94번 spot에 대한 동정을 실시하였으며(Table 1), 검색 결과는 69번 spot은 Ribonuclease HII로, 94번 spot은 Exoribonuclease Ⅱ로 나타났다.
- 5M Tris, SDS, 10% ammonium persulfate, TEMED]에 IPG strip을 sample로 이용하여 300 V에서 50 mA로 6시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 CBB(Coomassie Brilliant Blue R, Sigma, China)를 이용하여 염색한 후, spot의 위치를 육안으로 검토하였다.
- 특정한 spot에 위치한 gel 조각을 destaining 하기 위해 25 mM NH4 bicarbonate(50% ACN)를 400 μl씩 분주해 15분간 정치 후, 상층액을 제거하는 과정을 4회 반복한 뒤 10 mM NH4 bicarbonate(50% ACN)를 40 μl씩 분주하여 15분간 정치한 뒤 상층액을 제거하였다.
- 황체기에서 발현된 단백질은 난포기에서 발현된 단백질보다 많은 spot이 나타났으며, 이에 대한 분석 및 동정은 재현성을 나타낸 73개의 spot 중 황체기에서만 나타난 spot을 선발하여 실시하였다(Table 1). 황체기에서 확인한 단백질들은 α-enolase, Alanine-tRNA ligase, Tropomyosin alpha-3 chain, Ribosome-recycling factor, Polyribo-nucleotide nucleotidyltransferase 그리고 Probable prefoldin subunit 4로 확인되었다.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 결과는 SAS 9.2를 이용하여 General linear model(GLM)을 적용하여 Duncan의 multiple range test에 의하여 유의차(p<0.05)를 검정하였다.
성능/효과
- 이차원 전기영동 후 주기별 전기영동 결과에서 재현성을 나타내는 spot 중 난포기와 황체기에서 각각 따로 나타나는 spot과 유의적으로 발현량의 차이가 나타나는 spot 만을 선발하여 분석 및 동정하였다. 난포기 자궁액의 단백질 분석에서는 재현성을 나타낸 57개의 spot 중 황체기에서는 나타나지 않은 69번과 94번 spot에 대한 동정을 실시하였으며(Table 1), 검색 결과는 69번 spot은 Ribonuclease HII로, 94번 spot은 Exoribonuclease Ⅱ로 나타났다. Ribonuclease HII는 핵산 내부 가수분해 효소로 DNA를 손상시키는 ribonucleotide를 제거한다는 결과가 있었으며(Ochiai 등, 2005), Exoribonuclease Ⅱ는 mRNA의 분해와 polyribonucleotide를 단일가닥으로 가수분해하는 기능을 확인하여 단백질 생합성 증가에 영향을 미칠 것으로 추측된다.
- 2에서는 난포기와 황체기에서 서로 다른 spot이 나타났는데, 그 중 난포기에서는 68번, 69번 및 94번, 황체기에서는 156번, 157번, 184번, 185번, 186번, 187번, 190번 및 191번에서 확인되었다. 단백질은 MALDI-TOF-TOF와 NCBInr database 검색을 이용하여 Ribonuclease HII, Exoribonuclease 2, Alpha-enolase, Alanine- tRNA ligase, Tropomyosin alpha-3 chain, Ribosome-recycling factor, Polyribonucleotide nucleotidyltransferase, Probable profoldin subunit 4에 해당하는 단백질임을 확인하였다(Table 1). 또한, Fig.
- 1에 나타냈다. 돼지에서 난포기와 황체기의 자궁액 내에서 발현된 단백질 spot의 차이가 보였는데, 난포기에서는 총 136개의 spot을 확인하였으며 이중 57개의 spot이 재현성이 나타났으며, 황체기에서는 140개의 spot 중 73개의 spot이 재현성이 나타난 것을 확인하였다. 그 중 Fig.
- 이와 같이, 주난포기에서 발현된 단백질들의 기능을 미루어 보아 다음 단계로의 발달을 도울 수 있는 단백질을 포함하는 것으로 추측된다. 또한 황체기에서 발현된 단백질들은 황체기 단계에서 발생하는 탈락막화 현상의 진행에 필요한 기능을 지닌 단백질인 것으로 확인되었다.
- 황체기에서 확인한 단백질들은 α-enolase, Alanine-tRNA ligase, Tropomyosin alpha-3 chain, Ribosome-recycling factor, Polyribo-nucleotide nucleotidyltransferase 그리고 Probable prefoldin subunit 4로 확인되었다.
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