[논문]동결보존액에 Zardaverine의 첨가가 동결-융해 후 돼지 정자의 운동학적 특성에 미치는 영향

김정아; 조은석; 정용대; 최요한; 홍준기; 김영신; 정학재; 백선영; 사수진

doi:10.5762/kais.2020.21.9.251

동결보존액에 Zardaverine의 첨가가 동결-융해 후 돼지 정자의 운동학적 특성에 미치는 영향
Effects of Zardaverine in Freezing Extender on Kinetic Characteristics of Post-Thawed Boar Sperm 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.21 no.9, 2020년, pp.251 - 258

초록
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본 연구에서는 동결보존액에 대한 Zardaverine (phosphodiesterase inhibitor) 첨가가 돼지 동결-융해 정자의 운동학적 특성에 미치는 효과를 조사하였다. 돼지정액의 동결보존은 보조 번식기술 및 유전자원 장기보존을 위해 유용하게 이용되는 중요한 기술이다. 하지만 정자세포를 동결-융해하는 과정에서 발생하는 온도충격은 정자의 수정능력을 급격히 저하시킨다. 정액샘플은 성숙한 Duroc종 수퇘지로부터 채취했으며, lactose-egg yolk 동결보존액에 다양한 농도로 Zardaverine (0, 20, 50, 75 및 100 𝜇M)을 첨가하여 정액을 동결하였다. 융해 후 정자세포의 운동학적 특성 분석은 정자운동성자동분석기(CASA; computer-assisted sperm analysis)를 이용하였다. 그 결과, 융해 직후 정자의 운동성(MOT)은 타처리구에 비해 20 𝜇M 처리구에서 가장 높았다(p<0.05). Curvilinear velocity (VCL)은 0 𝜇M 과 20 𝜇M 처리구가 75 𝜇M 처리구를 제외한 다른 처리구들에 비해 유의적으로 높은 값을 보였다(p<0.05). Average path velocity (VAP)는 20 𝜇M 처리구가 100 𝜇M 처리구에 비해 유의적으로 높았으며(p<0.05) Amplitude of head lateral displacement (ALH)는 20 𝜇M 처리구가 50 𝜇M과 100 𝜇M 처리구에 비해 유의적으로 높았다(p<0.05). 이상의 결과를 종합하면, 동결용 보존액에 대한 Zardaverine 첨가가 동결-융해된 돼지 정자의 운동학적 특성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated the effect of Zardaverine supplementation in freezing extender, on kinetic characteristics of post-thawed boar sperm. Cryopreservation of boar sperm is an important technique of assisted reproductive technology and genetic resource banking. Although this technique is particularly useful, freeze-thaw cycles associated with sperm cryopreservation significantly reduce sperm quality. Semen from mature Duroc boars were collected and cryopreserved in freezing extenders (LEY) treated with varying concentrations of Zardaverine (0, 20, 50, 75, 100 𝜇M). The time-dependent kinetic characteristics of post-thawed spermatozoa were determined after thawing by applying computer-assisted sperm analysis (CASA). We observed that the motility immediately after thawing was significantly higher in 20 𝜇M stocks than in control (0 𝜇M) and the other treatments (p<0.05). Curvilinear velocity (VCL) in 0 𝜇M and 20 𝜇M stocks were significantly higher than the other treatment groups, except 75 𝜇M (p<0.05). Higher average path velocity (VAP) was obtained at 20 𝜇M as compared to 100 𝜇M, whereas amplitude of head lateral displacement (ALH) was significantly higher at 20 𝜇M than 50 𝜇M and 100 𝜇M (p<0.05). No differences were obtained for Straight-line velocity (VSL) and Linearity (LIN). In conclusion, our results indicate that Zardaverine improves the motility, VCL, VAP, and ALH of post-thawed boar sperm.

주제어

표/그림 (3)

표 Table 1. Effects of different concentration of Zardaverine on the kinetic characteristics of frozen-thawed sperm immediately after thawing
표 Table 2. Effects of different concentration of Zardaverine on the kinetic characteristics of frozen-thawed sperm at 30 min after thawing
그림 Fig. 1. Effect of different concentrations of Zardaverine (0, 20, 50, 75, and 100 μM) with times on kinetic characteristics of post-thawed boar spermatozoa VCL: curvilinear velocity (µm/s); VSL: straight-line velocity (µm/s); VAP: average path velocity (µm/s); LIN: linearity (%); ALH: amplitude of lateral head displacement (µm).

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 돼지정자의 동결 과정에서의 Zardaverine의 첨가효과를 검토하지 못했다. 따라서 본 연구는 돼지정자 동결용 배지(LEY; Lactose-Egg yolk extender)에 대한 Zardaverine의 첨가가 융해 후 정자의 운동학적 특성에 미치는 영향을 평가하기 위해 수행되었다.

제안 방법

그 후, 1차 동결보존액에 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 각각 다양한 농도(0, 20, 50, 75 및 100 μM) 의 Zardaverine 첨가하여 1시간 동안 교반을 실시하였다. 2차 동결보존액은 Zardaverine가 첨가되지 않은 1차 동결보존액에 1.5% Orvus Es Paste (OEP; Nova Chem, U.S.A)와 9% Glycerol (Sigma)을 첨가하여 4℃냉장고 보관하여 실험에 사용하였다. 동결 시 OEP와 Glycerol의 최종 농도는 각각 0.
1차 동결보존액(LEY; Lactose-Egg Yolk extender) 준비를 위하여 11% α-Lactose 용액 80 ㎖와 egg yolk 20 ㎖를 혼합하여 2시간 동안 교반을 실시하고, 원심분리(3,000 rpm, 5℃, 20분)하여 상층액만을 회수하였다. 그 후, 1차 동결보존액에 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 각각 다양한 농도(0, 20, 50, 75 및 100 μM) 의 Zardaverine 첨가하여 1시간 동안 교반을 실시하였다. 2차 동결보존액은 Zardaverine가 첨가되지 않은 1차 동결보존액에 1.

대상 데이터

정자샘플은 BTS 희석을 통해 30×10⁶ cells/㎖의 농도로 조정하여 분석했다. 38℃로 가온된 정자샘플 5μl를 markler counting chamber (Sefi-Medical Instruments, Israel)와 CASA를 사용하여 샘플 당 최소 100마리의 정자를 평가하기 위해서 10회 이상 분석을 반복하여 데이터를 수집하였다. 각 정자 샘플의 운동학적 특성 지표인 운동성(MOT, percent of motile sperm, %; 운동성이 있는 정자의 비율), 곡선운동 속도(VCL, curvilinear velocity, ㎛/s; 정자의 운동 경로를 따라 형성되는 호를 단위시간 당 이동한 거리), 직선운동 속도(VSL, straight-line velocity, ㎛/s; 정자의 처음 위치와 마지막 위치 사이의 직선거리를 전체 경과시간으로 나눈 값), 평균운동 속도(VAP, average path velocity, ㎛/s; 전체 이동한 거리를 경과한 시간으로 나눈 값), 직진성(LIN, linearity, %; VSL과 VCL의비[VSL/VCL]), 측두 이동거리(ALH, Amplitude of lateral head displacement, ㎛; 이동에 따른 정자두부 좌우 진폭의 평균거리)가 측정되었다.
개체 간의 변이를 최소화하기 위해서 동결-융해 후 정자의 운동성이 30% 이상인 개체(두록종 수퇘지)만를 선발한 후 정액샘플을 pooling 하여 본 연구에 이용하였다.
농촌진흥청 국립축산과학원 양돈과에서 사육된 성숙한 두록종(Duroc) 수퇘지 3두로부터 음경수압법을 이용하여 정액샘플을 채취하였다. 채취된 원정액은 여과지를 통해 교양물질 및 불순물을 제거한 후, 채취정액과 등온 조건(약 38℃)으로 가온한 정액희석액(BTS; Beltsville thawing solution)을 1:1 비율로 1차 희석하여 1시간이내로 실험실로 운반하여 시험에 이용하였다.

데이터처리

본 연구에서의 통계분석은 R 3.6.1 version을 이용하여 ANOVA와 GLM(Generalized linear model)를 적용하여 Duncan의 multiple range test방법에 의하여 통계적 유의성을 분석하였으며 처리 평균 간의 유의성 검정은 t-test를 이용하였다. 유의수준은 5%로 검정을 실시하였다.

이론/모형

동결-융해된 정자의 운동학적 특성들은 CASA를 사용 하여 객관적으로 평가되었다. 정자샘플은 BTS 희석을 통해 30×10⁶ cells/㎖의 농도로 조정하여 분석했다.

성능/효과

Jeong 등(2018)은 다양한 농도(0, 20, 50, 75및 100 μM)의 Zardaverine을 동결정액의 융해보존액에 첨가하여 실험을 수행하였으며 50 μM의 Zardaverine이 융해 후 가장 높은 정자의 운동성을 나타내었다고 보고하였다[23]. 반면에, 본 연구에서는 동결 보존액에 20 μM Zardaverine 첨가가 융해 후 가장 높은 정자의 운동성을 보였다. 따라서 동결-융해 과정에서 동결 전 또는 후의 보존액에 Zardaverine이 첨가될 때, 동결-융해된 정자의 운동성에 미치는 영향이 상이할 수 있다.
05). 본 연구의 결과는 20 μM Zardaverine 의 첨가가 동결-융해된 돼지 정자의 운동학적 특성에 대한 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 정자 운동성에 긍정적인 영향을 미친다고 알려진 다양한 PDE 억제제에 대한 다른 연구 결과와 일치한다[16, 18, 20].
본 연구의 결과를 종합해 보면 동결보존액에 대한 20μM Zardaverine의 첨가는 동결-융해 후 돼지 정자의 운동성, VCL, VSL VAP, LIN에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 돼지정액 동결기술은 우량 씨수퇘지 유전자원의 장기보존과 번식효율 증진 측면에서 돼지 육종개량과 더불어 양돈산업에서 잠재적으로 활용가치가 매우 높다.

후속연구

그럼에도 불구하고 정자의 운동성은 임신율, 분만율 및 산자 수에 영향을 미치는 수퇘지의 번식력에 대한 중요한 지표로 간주되어왔다[25]. 따라서 동결정액 융해 후의 정자 운동성을 개선한다면 우량 씨수퇘지 유전자원의 효율적인 보존과 증식에 큰 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 돼지의 정액을 동결하는 과정에서 발생하는 냉동손상을 최소화하기 위하여 적절한 양의 Zardaverine 사용이 유용할 것으로 사료된다.
돼지정액 동결기술은 우량 씨수퇘지 유전자원의 장기보존과 번식효율 증진 측면에서 돼지 육종개량과 더불어 양돈산업에서 잠재적으로 활용가치가 매우 높다. 본 연구의 결과는 돼지정자의 동결보존과 융해 후 수정능력 개선을 위한 다양한 첨가물 활용 연구에 기초자료를 제공할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	정자 동결기술의 장점은 무엇인가?	정자세포의 동결보존은 1952년 Polge에 의해 처음 소개된 이후로 축산업 분야에서 사용이 급속히 증가되었다[1]. 정자 동결기술은 고가치 유전자원의 장기보존, 원거리 수송, 병원체 사전검역을 통한 안전한 국제교류 등의 장점을 가지고 있다[2-4]. 그러나 정자동결이 우량 씨 수퇘지의 유전자원을 반영구적으로 보존할 수 있는 최고의 기술임에도 불구하고 전 세계적으로 돼지인공수정에서 동결정액을 활용하는 비중은 1% 가량이다[5].
	정자세포의 동결보존의 시초는?	정자세포의 동결보존은 1952년 Polge에 의해 처음 소개된 이후로 축산업 분야에서 사용이 급속히 증가되었다[1]. 정자 동결기술은 고가치 유전자원의 장기보존, 원거리 수송, 병원체 사전검역을 통한 안전한 국제교류 등의 장점을 가지고 있다[2-4].
	정자 동결기술의 문제점은 무엇인가?	그러나 정자동결이 우량 씨 수퇘지의 유전자원을 반영구적으로 보존할 수 있는 최고의 기술임에도 불구하고 전 세계적으로 돼지인공수정에서 동결정액을 활용하는 비중은 1% 가량이다[5]. 동결정액을 산업현장에 적용함에 있어 가장 큰 제약은 정자세포 동결과정에서 발생하는 저온손상에 의하여 수정능력이 저하되어 수태율과 산자수에 악영향을 미친다는 점이다[6, 7]. 이는 여러가지 장점에도 불구하고 양돈산업에서 동결정액이 널리 활용되지 않은 요인이다[8].

참고문헌 (25)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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