[논문]PCR-DGGE를 이용한 친환경 농법 적용 고추경작지 내 진균의 군집 다양성 분석

정병권; 김광섭; 송진하; 김상달

doi:10.4014/kjmb.1303.03002

PCR-DGGE를 이용한 친환경 농법 적용 고추경작지 내 진균의 군집 다양성 분석
PCR-DGGE Analysis of the Fungal Community of Red-pepper Fields Utilizing Eco-friendly Farming Methods 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.41 no.3, 2013년, pp.292 - 299

정병권 (영남대학교 미생물생명공학과) , 김광섭 (영남대학교 미생물생명공학과) , 송진하 (영남대학교 미생물생명공학과) , 김상달 (영남대학교 미생물생명공학과)

초록
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본 연구에서는 분자생물학적 기법인 PCR-DGGE를 사용하여 친환경 농법을 적용한 고추경작지에서 서식하는 진균의 군집 변화를 분석하고자 하였다. 먼저 토양으로부터 추출한 DNA는 DGGE 분석을 위해 진균의 universal primer인 ITS 1/4 primer set를 사용하여 nested-PCR을 수행하였으며, 증폭된 산물을 사용하여 DGGE를 수행한 결과 진균의 군집을 나타내는 band의 수는 고추 정식 전에는 3-4개에 불과했으나 고추를 정식한 후에는 전체 처리구에서 평균 15개로 조사되어 작물의 정식이 진균의 밀도 및 다양성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 처리구 별로는 윤작과 컨소시엄 미생물제제를 동시에 적용한 고추 경작지에서 band 수가 18개로 나타나 가장 많은 것으로 조사되었다. 반면에 연작지의 화학농약 처리구에서는 band의 수가 14개로 나타나 처리구 중에서 진균의 다양성이 가장 낮은 것으로 확인되었다. 또한 식물에 질병을 일으키는 주요 병원성 진균의 DNA를 marker로 사용하여 각 처리구 별로 패턴을 비교한 결과, 연작지에서 모잘록병을 일으키는 R. solani AG-1 (IB)이 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 염기서열 분석을 통해 우점종을 조사한 결과, 고추 정식 전에는 Paraphaeosphaeria quadriseptata, 정식 후에는 Mortierella chlamydospora, Cucurbitaria berberidis 및 Chaetomium globosum 종이 우점하고 있는 것으로 확인되었다. 처리구 간의 유사성 분석에서는 연작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구와 윤작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구가 유사한 것으로 나타났으며, 화학농약 처리구 역시 경작체계가 다름에도 불구하고 유사성이 있는 것으로 확인되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we analyzed the changes in fungal populations of red-pepper fields employing eco-friendly farming methods, such as microbial agents and crop rotation, by using polymerase chain reactions coupled with denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). Primer specific for fungi were used to determine the contribution of domains to the microbial community. Analysis of planted and non-planted soil samples applying PCR-DGGE technology offered evaluation of long-term patterns in fungal species richness. To evaluate the stability of DGGE patterns from different soils, comparison of planted and non-planted soil samples were compared using PCR-DGGE. The number of DNA fragments obtained from all planted soil samples by DGGE separation was far greater (14 to 15 bands) than that of the non-planted soil samples (3 to 4 bands). In addition, 14 bands were observed from crop continuation soil treated with agrochemicals and 18 bands from crop rotation soil treated with microbial agents. The PCR-DGGE analysis suggests that the use of crop rotation and microbial agents benefits the fungal community more than crop continuation using agrochemicals. These results indicate that crop rotation with microbial agents was better able to support beneficial organisms, enable more effective biological control and maintain a healthier balance of nutrients, organic matter and microorganisms.

주제어

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문제 정의

따라서 본 연구에서는 고추의 경작지를 대상으로하여 식물 생장촉진근권세균(Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR) 균주인 auxin, siderophore 및 bbb-glucanase를 생산하는 Bacillus licheniformis K11 [28], auxin, siderophore, celluase를 생산하는 Bacillus subtilis AH18 [8], 그리고 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG)와 1-aminocyclopropane1-carboxylic acid deaminase (ACC deaminase)를 생산하는 Pseudomonas fluorescens 2112 [11-13]가 혼합된 컨소시엄 미생물제제 처리 및 콩과작물인 강낭콩을 정식하여 윤작체계를 적용한 후, 근권토양으로부터 DNA를 추출하여 분자생물학적 기법인 PCR-DGGE 기법을 통해 진균의 군집다양성 변화를 비교하고자 하였다.
본 연구에서는 분자생물학적 기법인 PCR-DGGE를 사용 하여 친환경 농법을 적용한 고추경작지에서 서식하는 진균의 군집 변화를 분석하고자 하였다. 먼저 토양으로부터 추출한 DNA는 DGGE 분석을 위해 진균의 universal primer인 ITS 1/4 primer set를 사용하여 nested-PCR을 수행하였으며, 증폭된 산물을 사용하여 DGGE를 수행한 결과 진균의 군집을 나타내는 band의 수는 고추 정식 전에는 3-4개에 불과했으나 고추를 정식한 후에는 전체 처리구에서 평균 15개로 조사되어 작물의 정식이 진균의 밀도 및 다양성을 증가 시키는 것으로 확인되었다.

제안 방법

) 모종 총 600주를 난괴법으로 25주씩 4반복 정식하였다. 2차년도에는 연작과 윤작의 적용을 위해 고추 및 두과작물인 강낭콩(Phaseolus vulgaris var. humilis Alef.) 모종을 각각의 처리구당 25주씩 난괴법으로 4반복으로 정식하였다. 또한 동일한 양의 컨소시엄 미생물제제(2 Bacillus sp.
DGGE를 통해 분리된 각각의 DNA의 염기서열을 분석하여 동정하기 위해 gel에 위치한 각각의 band를 멸균된 매스로 조심스럽게 자른 후 e-tube에 옮겨 담았으며, 회수한 gel 로부터 DNA의 추출은 높은 수율확보를 위해 QIAEX® II Gel Extraction Kit의 protocol을 변형하여 실시하였다.
6 volume의 iso-propanol을 첨가한 후 원심분리하여 상등액을제거하였으며, 70% ethanol로 세척한 다음 최종적으로 TE buffer 20 µl에 DNA를 녹였다. Elution된 DNA는 앞의 PCR 조건과 동일하게 증폭하여 1.5% agarose gel에서 전기 영동(100 V, 30 min)하여 확인하였다.
, Ltd. Korea에 의뢰하였으며, 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST search를 통해 Genbank에 등록된 염기서열과 비교하여 동정하였다. 처리구 간의 상동성은 XLstat2008 (Addinsoft, USA)로 계산하여 Dice 유사도를 조사한 후, unweighted pair group average를 사용하여 dendrogram으로 나타내었다.
Test PCR에 의해 가장 특이적으로 진균의 DNA를 증폭할수 있었던 ITS 1/4 primer set를 사용하여 고추 정식 전과 정식 6개월 후의 연작, 윤작지 내 물처리구, 컨소시엄 미생물 제제 처리구, 화학농약 처리구로부터 추출한 total DNA를 주형으로 하여 nested-PCR을 수행하였다. Nested-PCR은 pre-denaturation (94℃, 5 min) 한 뒤 denaturation (94℃, 1 min), annealing (50℃, 1 min 30 s), extension (72℃, 3 min)을 35 cycles 반복 수행한 다음 final extention (72℃, 10 min)의 과정으로 수행하였으며, 1차로 ITS1/4 primer set 로 total DNA를 증폭시킨 후 증폭산물을 ITS4 primer에 GC-clamp를 부착하여 2차로 PCR을 다시 수행하였다. 그 결과, 고추 정식 전과 정식 6개월 후의 토양시료로부터 추출한 total DNA가 안정적으로 증폭되어 500-600 bp 사이의 증폭 산물을 얻을 수 있었다(Fig.
Test PCR 수행 시 Oomycetes 강에 속하는 Phytophthora capsici와 Sordariomycetes 강에 속하는 Fusarium oxysporum의 genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, 대조구로는 증류수와 세균종인 Bacillus subtilis AH18, Pseudomonas fluorescens 2112의 genomic DNA를 시료로 사용하였다. Primer set (forward/reverse)로는 ITS1/ITS4 [23], FF390/FR1 [4], nu-SSU-0817/nu-SSU-1196 [7]를 사용하였으며, 진균의 DNA에 가장 특이적으로 결합하는 primer set를 선발한 후 DGGE 수행 시 고유염기서열의 melting temperature에 따라서 DNA를 분리하고 이중가닥이 단일가닥으로 분리되는 것을 방지하기 위해 reverse primer의 5말단에 GC clamp를 부착하였다(Table 1). 또한 토양 내 존재하는 진균의 군집다양성을 분석을 위해 추출한 토양 DNA의 안정적인 PCR 증폭을 위해서 nested-PCR을 실시하였다.
Test PCR에 의해 가장 특이적으로 진균의 DNA를 증폭할수 있었던 ITS 1/4 primer set를 사용하여 고추 정식 전과 정식 6개월 후의 연작, 윤작지 내 물처리구, 컨소시엄 미생물 제제 처리구, 화학농약 처리구로부터 추출한 total DNA를 주형으로 하여 nested-PCR을 수행하였다. Nested-PCR은 pre-denaturation (94℃, 5 min) 한 뒤 denaturation (94℃, 1 min), annealing (50℃, 1 min 30 s), extension (72℃, 3 min)을 35 cycles 반복 수행한 다음 final extention (72℃, 10 min)의 과정으로 수행하였으며, 1차로 ITS1/4 primer set 로 total DNA를 증폭시킨 후 증폭산물을 ITS4 primer에 GC-clamp를 부착하여 2차로 PCR을 다시 수행하였다.
Total DNA는 세균 뿐만 아니라 진균, 동식물의 조직세포, 조류로부터 DNA 추출이 가능한 FastDNA® SPIN Kit for Soil (MP biomedicals, USA)을 사용하여 추출하였다.
경작지 토양으로부터 진균의 군집을 분석하기 위해 fungal DNA가 포함된 total DNA의 추출은 세균 뿐만 아니라 비교적 세포벽이 두꺼운 진균의 DNA를 추출할 수 있는 FastDNA® SPIN Kit for Soil (MP biomedicals, USA)을 사용하였으며, 1.5% agarose gel에서의 전기영동(100 V, 30 min)을 통해 3,000 bp 이상의 손상없는 DNA로 확인되었다(Fig. 1).
2). 따라서 진균 군집의 DGGE 분석을 위한 total DNA의 PCR 증폭은 ITS 1/4 primer set를 사용하여 수행하였다.
) 모종을 각각의 처리구당 25주씩 난괴법으로 4반복으로 정식하였다. 또한 동일한 양의 컨소시엄 미생물제제(2 Bacillus sp., and 1 Pseudomonas sp., BBP), 화학농약(agrochemical, Ac) 및 물(water, Wt)을 처리하기 위하여 관주시설을 설치하였으며, 정식 2주 후부터 작물 1주당 100 ml씩 접종하였다. 각 처리 구당 접종농도는 컨소시엄 미생물제제의 경우 106 CFU/ml를 처리하였으며, 화학농약(A사 L 제품)은 제품에 표기된 권장기준에 따라 처리하였다.
1). 또한 추출한 total DNA의 PCR 수행을 위해 UV-vis spectrophotometer (ND-1000, NanoDrop Technologies Thermo scientific, USA)를 사용하여 농도와 순도를 측정하였으며, 측정결과 별도의 정제과정 없이 PCR을 수행할 수있는 순도와 농도로 측정되었다(결과미제시). 또한 육안으로도 갈색이 아닌 투명색을 띄어 PCR을 저해시키는 humic compounds가 제거되었음을 확인할 수 있었다.
Primer set (forward/reverse)로는 ITS1/ITS4 [23], FF390/FR1 [4], nu-SSU-0817/nu-SSU-1196 [7]를 사용하였으며, 진균의 DNA에 가장 특이적으로 결합하는 primer set를 선발한 후 DGGE 수행 시 고유염기서열의 melting temperature에 따라서 DNA를 분리하고 이중가닥이 단일가닥으로 분리되는 것을 방지하기 위해 reverse primer의 5말단에 GC clamp를 부착하였다(Table 1). 또한 토양 내 존재하는 진균의 군집다양성을 분석을 위해 추출한 토양 DNA의 안정적인 PCR 증폭을 위해서 nested-PCR을 실시하였다. 이는 일명 second-PCR로 불리어지며 정확한 target gene의 증폭을 위해 사용되는 방법으로, nested-PCR 의 과정은 먼저 선발된 primer set를 사용하여 1차로 PCR 을 수행한 후 GC clamp가 부착된 primer set를 사용하여 2차 PCR을 수행하였다.
Korea) 10 µl를 섞은 후 gel에 loading하여 전기영동 (60℃, 60 V, 18 h)을 실시하였으며, 군집분석과 함께 식물병원성 진균의 밀도 변화를 분석하기 위해 식물병원성 진균 6종(Table 2)의 DNA를 marker로 사용하였다. 전기영동이 종료된 gel은 EtBr이 포함된 1X TAE buffer에 20분간 염색한 후, 40분간 동일한 buffer에서 탈색시켰으며, UV를 사용하여 gel 상의 band를 확인하였다.
제작된 gel은 1X TAE buffer (40 mM tris-acetate, 1 mM EDTA) 8 L가 채워진 60℃ 항온수조에 넣었으며, PCR 증폭 산물 50 µl와 6X loading dye (Solgent Co., Ltd. Korea) 10 µl를 섞은 후 gel에 loading하여 전기영동 (60℃, 60 V, 18 h)을 실시하였으며, 군집분석과 함께 식물병원성 진균의 밀도 변화를 분석하기 위해 식물병원성 진균 6종(Table 2)의 DNA를 marker로 사용하였다.
Korea에 의뢰하였으며, 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST search를 통해 Genbank에 등록된 염기서열과 비교하여 동정하였다. 처리구 간의 상동성은 XLstat2008 (Addinsoft, USA)로 계산하여 Dice 유사도를 조사한 후, unweighted pair group average를 사용하여 dendrogram으로 나타내었다.
Total DNA는 세균 뿐만 아니라 진균, 동식물의 조직세포, 조류로부터 DNA 추출이 가능한 FastDNA^®SPIN Kit for Soil (MP biomedicals, USA)을 사용하여 추출하였다. 추출한 DNA는 1.5% agarose gel에 loading하여 전기영동(100V, 30 min)을 통해 확인하였으며, UV-vis spectrophotometer (ND-1000, NanoDrop Technologies Thermo scientific, USA)를 사용하여 농도와 순도를 확인하였다. 또한 추출한 DNA는 PCR을 수행하기 전까지 −20℃에서 보관하였다.
컨소시엄 미생물제제와 화학농약을 처리한 연작 및 윤작지 토양에 서식하는 진균의 군집다양성을 분석하기 위해 BioRad Dcode System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)을 사용하여 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 분석을 수행하였다. DGGE 분석에 사용할 gel의 조성은 denaturing gel의 경우 9% polyacrylamide (37.
컨소시엄 미생물제제와 화학농약을 처리한 연작 및 윤작지 토양으로부터 추출한 total DNA에서 진균 DNA의 증폭을 위해 먼저 동정에 사용되는 다양한 primer set들을 사용해 시험 적으로 test PCR을 수행하였다. Test PCR 수행 시 Oomycetes 강에 속하는 Phytophthora capsici와 Sordariomycetes 강에 속하는 Fusarium oxysporum의 genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, 대조구로는 증류수와 세균종인 Bacillus subtilis AH18, Pseudomonas fluorescens 2112의 genomic DNA를 시료로 사용하였다.
컨소시엄 미생물제제와 화학농약을 처리한 연작 및 윤작지에 존재하는 진균의 군집 다양성을 분석하기 위해 고추를 심기 전(N-P, non-planting)과 6개월 후에 채취한 토양 시료로부터 total DNA를 추출하였다. Total DNA는 세균 뿐만 아니라 진균, 동식물의 조직세포, 조류로부터 DNA 추출이 가능한 FastDNA^®SPIN Kit for Soil (MP biomedicals, USA)을 사용하여 추출하였다.
각 처리 구당 접종농도는 컨소시엄 미생물제제의 경우 106 CFU/ml를 처리하였으며, 화학농약(A사 L 제품)은 제품에 표기된 권장기준에 따라 처리하였다. 토양시료는 모종을 정식한 날을 기준으로 하여 정식 전(non-planting, NP)과 정식 6개월 후 작물의 근권토양을 6반복으로 임의 채취하여 혼합하였으며, 2 mm 표준체(10 mesh)로 체걸음을 실시하였다.

대상 데이터

컨소시엄 미생물제제와 화학농약을 처리한 연작 및 윤작지 토양으로부터 추출한 total DNA에서 진균 DNA의 증폭을 위해 먼저 동정에 사용되는 다양한 primer set들을 사용해 시험 적으로 test PCR을 수행하였다. Test PCR 수행 시 Oomycetes 강에 속하는 Phytophthora capsici와 Sordariomycetes 강에 속하는 Fusarium oxysporum의 genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, 대조구로는 증류수와 세균종인 Bacillus subtilis AH18, Pseudomonas fluorescens 2112의 genomic DNA를 시료로 사용하였다. Primer set (forward/reverse)로는 ITS1/ITS4 [23], FF390/FR1 [4], nu-SSU-0817/nu-SSU-1196 [7]를 사용하였으며, 진균의 DNA에 가장 특이적으로 결합하는 primer set를 선발한 후 DGGE 수행 시 고유염기서열의 melting temperature에 따라서 DNA를 분리하고 이중가닥이 단일가닥으로 분리되는 것을 방지하기 위해 reverse primer의 5말단에 GC clamp를 부착하였다(Table 1).
토양미생물의 군집분석을 위한 시험포장지는 경상북도 경산시 대동 영남대학교 자연자원대학 소재의 실습포장지(23 ×33 m)에 설치하였으며, 청양품종의 고추(Capsicum annum L.) 모종 총 600주를 난괴법으로 25주씩 4반복 정식하였다.

데이터처리

DGGE 수행 후 경작체계 및 처리구 간의 군집 유사도를 분석하기 위해 band 위치와 개수를 평행비교하여 XLstat2008 (Addinsoft, USA)로 계산한 후 unweighted pair group average를 사용하여 dendrogram으로 나타내었다. 그 결과, 경작체계 간의 군집 유사성은 나타내지 않았으나 연작 및 윤 작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구와 화학농약 처리구가 각각 군집이 유사한 것으로 나타났다.

이론/모형

Cluster analysis on fungal communities of crop continuation and rotation in red-pepper field soil. The dendrogram was based on the cluster analysis by the unweighted pair group method using arithmetic averages. Wt, water treatment; BBP, consortium microbial agent treatment; Ac, agrochemical treatment; CC, crop continuation field; RC, crop rotation field.

성능/효과

DGGE 분석을 위한 primer set들의 진균 특이성을 확인하기 위해 Oomycetes 강에 속하는 Phytophthora capsici, Sordariomycetes 강에 속하는 Fusarium oxysporum의 genomic DNA와 대조구로 증류수와 세균종인 Bacillus subtilis AH18, Pseudomonas fluorescens 2112의 genomic DNA를 사용하여 test PCR을 수행한 결과, ITS1/4 primer set를 사용하였을 경우 가장 특이성 있는 PCR 증폭산물을 형성하는 것으로 확인되었다. 반면에 nu-SSU 0817/1196 primer set를 사용하였을 경우, ITS1/4 primer set와 동일하게 대조구에서는 증폭산물이 형성되지 않고 진균의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우 특이성있게 증폭되는 것으로 확인되었으나 증폭산물의 농도가 ITS 1/4 primer에 비해 낮았으며, FF390/FR1 primer set의 경우 진균에 특이성 있는 반응을 나타내지 않았다(Fig.
3과 같이 분리된 증폭 산물의 band가 다양한 위치에 존재하는 것으로 확인되었다. 고추 경작지에서 우점하고 있는 종으로 판단되는 band의 수는 정식 전의 경우 3-4개에 불과하였으나 정식 6개월 후에는 평균 15개로 증가하였는데, 이는 고추의 정식으로 인해 근권생태계가 형성됨으로써 그 개체수 및 밀도가 증가한 것으로 생각된다. 또한 처리구 별로 우점종의 band 수를 비교해보면 윤작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구가 18개로 가장 많은 band 수를 나타내었으며, 연작지의 화학농약 처리 구가 14개로 가장 낮은 band 수를 나타내었다.
고추의 정식 전과 정식 6개월 후의 토양으로부터 추출한 total DNA를 주형으로 하여 진균의 universal primer인 ITS 1/4 primer set로 nested-PCR을 통해 얻은 500-600 bp의 증폭산물을 DGGE에 적용한 결과, Fig. 3과 같이 분리된 증폭 산물의 band가 다양한 위치에 존재하는 것으로 확인되었다. 고추 경작지에서 우점하고 있는 종으로 판단되는 band의 수는 정식 전의 경우 3-4개에 불과하였으나 정식 6개월 후에는 평균 15개로 증가하였는데, 이는 고추의 정식으로 인해 근권생태계가 형성됨으로써 그 개체수 및 밀도가 증가한 것으로 생각된다.
DGGE 수행 후 경작체계 및 처리구 간의 군집 유사도를 분석하기 위해 band 위치와 개수를 평행비교하여 XLstat2008 (Addinsoft, USA)로 계산한 후 unweighted pair group average를 사용하여 dendrogram으로 나타내었다. 그 결과, 경작체계 간의 군집 유사성은 나타내지 않았으나 연작 및 윤 작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구와 화학농약 처리구가 각각 군집이 유사한 것으로 나타났다. 또한 연작지의 물처리 구는 컨소시엄 미생물제제 처리구보다 화학농약 처리구와군집이 유사하였으며, 윤작지의 물처리구는 컨소시엄 미생물제제 처리구와 비교적 유사성이 근접하였으나 독립적인 양상을 띄는 것으로 나타났다(Fig.
Nested-PCR은 pre-denaturation (94℃, 5 min) 한 뒤 denaturation (94℃, 1 min), annealing (50℃, 1 min 30 s), extension (72℃, 3 min)을 35 cycles 반복 수행한 다음 final extention (72℃, 10 min)의 과정으로 수행하였으며, 1차로 ITS1/4 primer set 로 total DNA를 증폭시킨 후 증폭산물을 ITS4 primer에 GC-clamp를 부착하여 2차로 PCR을 다시 수행하였다. 그 결과, 고추 정식 전과 정식 6개월 후의 토양시료로부터 추출한 total DNA가 안정적으로 증폭되어 500-600 bp 사이의 증폭 산물을 얻을 수 있었다(Fig. 3).
또한 처리구 별로 우점종의 band 수를 비교해보면 윤작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구가 18개로 가장 많은 band 수를 나타내었으며, 연작지의 화학농약 처리 구가 14개로 가장 낮은 band 수를 나타내었다. 그리고 각 처리구 간의 식물병원성 진균의 존재 여부를 확인하기 위해 marker로 사용된 6종의 식물병원성 진균의 band와 비교하여 조사한 결과, 모잘록병을 일으키는 R. solani AG-1 (IB) 가 연작지의 물처리구에서만 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 지력을 약화시키는 작물의 연작 및 지속적인 화학농약의 처리는 토양에 서식하는 진균의 우점종 수를 감소시킴과 동시에 병원성 진균의 개체수가 증가하는 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
반면에 연작지의 화학농약 처리구에서는 band의 수가 14개로 나타나 처리구 중에서 진균의 다양성이 가장 낮은 것으로 확인되었다. 또한 식물에 질병을 일으키는 주요 병원성 진균의 DNA를 marker로 사용하여 각 처리구 별로 패턴을 비교한 결과, 연작지에서 모잘록병을 일으키는 R. solani AG-1 (IB)이 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 염기서열 분석을 통해 우점종을 조사한 결과, 고추 정식 전에는 Paraphaeosphaeria quadriseptata, 정식 후에는 Mortierella chlamydospora, Cucurbitaria berberidis 및 Chaetomium globosum 종이 우점하고 있는 것으로 확인되었다.
그 결과, 경작체계 간의 군집 유사성은 나타내지 않았으나 연작 및 윤 작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구와 화학농약 처리구가 각각 군집이 유사한 것으로 나타났다. 또한 연작지의 물처리 구는 컨소시엄 미생물제제 처리구보다 화학농약 처리구와군집이 유사하였으며, 윤작지의 물처리구는 컨소시엄 미생물제제 처리구와 비교적 유사성이 근접하였으나 독립적인 양상을 띄는 것으로 나타났다(Fig. 5). 이러한 결과를 통해 토양에 서식하는 진균의 군집 구성은 연작 및 윤작과 같은 경작체계보다 제제의 종류에 의해 영향을 더 크게 받는 것으로 확인되었다.
solani AG-1 (IB)이 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 염기서열 분석을 통해 우점종을 조사한 결과, 고추 정식 전에는 Paraphaeosphaeria quadriseptata, 정식 후에는 Mortierella chlamydospora, Cucurbitaria berberidis 및 Chaetomium globosum 종이 우점하고 있는 것으로 확인되었다. 처리구 간의 유사성 분석에서는 연작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구와 윤작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구가 유사한 것으로 나타났으며, 화학농약 처리구 역시 경작체계가 다름에도 불구하고 유사성이 있는 것으로 확인되었다.
또한 추출한 total DNA의 PCR 수행을 위해 UV-vis spectrophotometer (ND-1000, NanoDrop Technologies Thermo scientific, USA)를 사용하여 농도와 순도를 측정하였으며, 측정결과 별도의 정제과정 없이 PCR을 수행할 수있는 순도와 농도로 측정되었다(결과미제시). 또한 육안으로도 갈색이 아닌 투명색을 띄어 PCR을 저해시키는 humic compounds가 제거되었음을 확인할 수 있었다.
고추 경작지에서 우점하고 있는 종으로 판단되는 band의 수는 정식 전의 경우 3-4개에 불과하였으나 정식 6개월 후에는 평균 15개로 증가하였는데, 이는 고추의 정식으로 인해 근권생태계가 형성됨으로써 그 개체수 및 밀도가 증가한 것으로 생각된다. 또한 처리구 별로 우점종의 band 수를 비교해보면 윤작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구가 18개로 가장 많은 band 수를 나타내었으며, 연작지의 화학농약 처리 구가 14개로 가장 낮은 band 수를 나타내었다. 그리고 각 처리구 간의 식물병원성 진균의 존재 여부를 확인하기 위해 marker로 사용된 6종의 식물병원성 진균의 band와 비교하여 조사한 결과, 모잘록병을 일으키는 R.
본 연구에서는 분자생물학적 기법인 PCR-DGGE를 사용 하여 친환경 농법을 적용한 고추경작지에서 서식하는 진균의 군집 변화를 분석하고자 하였다. 먼저 토양으로부터 추출한 DNA는 DGGE 분석을 위해 진균의 universal primer인 ITS 1/4 primer set를 사용하여 nested-PCR을 수행하였으며, 증폭된 산물을 사용하여 DGGE를 수행한 결과 진균의 군집을 나타내는 band의 수는 고추 정식 전에는 3-4개에 불과했으나 고추를 정식한 후에는 전체 처리구에서 평균 15개로 조사되어 작물의 정식이 진균의 밀도 및 다양성을 증가 시키는 것으로 확인되었다. 처리구 별로는 윤작과 컨소시엄 미생물제제를 동시에 적용한 고추 경작지에서 band 수가 18개로 나타나 가장 많은 것으로 조사되었다.
DGGE 분석을 위한 primer set들의 진균 특이성을 확인하기 위해 Oomycetes 강에 속하는 Phytophthora capsici, Sordariomycetes 강에 속하는 Fusarium oxysporum의 genomic DNA와 대조구로 증류수와 세균종인 Bacillus subtilis AH18, Pseudomonas fluorescens 2112의 genomic DNA를 사용하여 test PCR을 수행한 결과, ITS1/4 primer set를 사용하였을 경우 가장 특이성 있는 PCR 증폭산물을 형성하는 것으로 확인되었다. 반면에 nu-SSU 0817/1196 primer set를 사용하였을 경우, ITS1/4 primer set와 동일하게 대조구에서는 증폭산물이 형성되지 않고 진균의 DNA를 주형으로 사용하였을 경우 특이성있게 증폭되는 것으로 확인되었으나 증폭산물의 농도가 ITS 1/4 primer에 비해 낮았으며, FF390/FR1 primer set의 경우 진균에 특이성 있는 반응을 나타내지 않았다(Fig. 2). 따라서 진균 군집의 DGGE 분석을 위한 total DNA의 PCR 증폭은 ITS 1/4 primer set를 사용하여 수행하였다.
처리구 별로는 윤작과 컨소시엄 미생물제제를 동시에 적용한 고추 경작지에서 band 수가 18개로 나타나 가장 많은 것으로 조사되었다. 반면에 연작지의 화학농약 처리구에서는 band의 수가 14개로 나타나 처리구 중에서 진균의 다양성이 가장 낮은 것으로 확인되었다. 또한 식물에 질병을 일으키는 주요 병원성 진균의 DNA를 marker로 사용하여 각 처리구 별로 패턴을 비교한 결과, 연작지에서 모잘록병을 일으키는 R.
solani AG-1 (IB) 가 연작지의 물처리구에서만 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 지력을 약화시키는 작물의 연작 및 지속적인 화학농약의 처리는 토양에 서식하는 진균의 우점종 수를 감소시킴과 동시에 병원성 진균의 개체수가 증가하는 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 그리고 DNA fragment의 염기서열을 분석을 통해 고추정식 전과 정식 6개월 후의 우점종을 비교한 결과, 정식 전에는 Paraphaeosphaeria quadriseptata 종이 우점하고 있는 것으로 확인되었는데, P.
5). 이러한 결과를 통해 토양에 서식하는 진균의 군집 구성은 연작 및 윤작과 같은 경작체계보다 제제의 종류에 의해 영향을 더 크게 받는 것으로 확인되었다.
또한 염기서열 분석을 통해 우점종을 조사한 결과, 고추 정식 전에는 Paraphaeosphaeria quadriseptata, 정식 후에는 Mortierella chlamydospora, Cucurbitaria berberidis 및 Chaetomium globosum 종이 우점하고 있는 것으로 확인되었다. 처리구 간의 유사성 분석에서는 연작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구와 윤작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구가 유사한 것으로 나타났으며, 화학농약 처리구 역시 경작체계가 다름에도 불구하고 유사성이 있는 것으로 확인되었다.
먼저 토양으로부터 추출한 DNA는 DGGE 분석을 위해 진균의 universal primer인 ITS 1/4 primer set를 사용하여 nested-PCR을 수행하였으며, 증폭된 산물을 사용하여 DGGE를 수행한 결과 진균의 군집을 나타내는 band의 수는 고추 정식 전에는 3-4개에 불과했으나 고추를 정식한 후에는 전체 처리구에서 평균 15개로 조사되어 작물의 정식이 진균의 밀도 및 다양성을 증가 시키는 것으로 확인되었다. 처리구 별로는 윤작과 컨소시엄 미생물제제를 동시에 적용한 고추 경작지에서 band 수가 18개로 나타나 가장 많은 것으로 조사되었다. 반면에 연작지의 화학농약 처리구에서는 band의 수가 14개로 나타나 처리구 중에서 진균의 다양성이 가장 낮은 것으로 확인되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아가로스 겔 전기영동 법에 비해 denaturing gradient gel electrophoresis의 장점은?	때문에 최근에는 fingerprinting의 일종인 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)와 같은 분자생물학적 방법을 통해 진균의 군집을 분석하는 연구가 이루어지고 있는데, DGGE는 의학적으로 유전자돌연변이를 동정하기 위해서 가장 먼저 사용되었으며[1], Muyzer 등[18]에 의해 PCR-DGGE를 사용하여 미생물 군집을 분석하는 연구가 시작되었다[18]. 일반적인 agarose gel 전기영동법과 다르게 DGGE는 polyacrylamide gel에 urea, formamide와 같은 화학적 변성자(denaturants)를 첨가하고 polyacrylamide의 농도구배와 높은 온도를 사용함으로 인하여 이중가닥의 DNA 의 guanine과 cytosine 함량에 따라 단일가닥으로 분리되는 정도가 달라지며, gel 상에서 이동하는 거리가 달라지게 됨으로 PCR에 의해 증폭된 같은 길이의 특정 DNA를 다양한 패턴으로 분리할 수 있어 환경에 서식하는 미생물의 군집상을 분석할 수 있는 장점이 있다[2, 6, 14]. 이러한 특성으로 인해 최근에는 옥수수, 밀 등과 같은 식물의 근권에 서식하는 진균 및 세균의 군집을 경시적으로 분석하는 연구가 이루어지고 있다[17, 20, 21].
	진균 군집 다양성을 분석하는 데 배양방법에 의존한 기술의 단점은?	과거에는 희석도말법과 같이 배양방법을 통한 colony 계수측정에 의해 토양에 존재하는 진균의 군집다양성에 대한 연구가 이루어졌다. 그러나 배양방법에 의존한 기술로는 담자균(Basidiomycetes)이나 내생균근균(Endomycorrhizae)와 같은 몇몇 진균을 배양하기 힘들뿐더러 진균의 군집다양성을 분석하기에는 제한적이고 많은 시간과 노력을 필요로 하며, 단일 균주를 순수하게 분리할 수 있을지라도 극히 작은 수의 균주만을 탐색할 수 밖에 없다는 단점이 존재한다[3, 25].
	친환경 농법을 적용한 고추경작지에서 고추 정식 전과 후의 진균 우점종은 무엇입니까?	solani AG-1 (IB)이 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 염기서열 분석을 통해 우점종을 조사한 결과, 고추 정식 전에는 Paraphaeosphaeria quadriseptata, 정식 후에는 Mortierella chlamydospora, Cucurbitaria berberidis 및 Chaetomium globosum 종이 우점하고 있는 것으로 확인되었다. 처리구 간의 유사성 분석에서는 연작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구와 윤작지의 컨소시엄 미생물제제 처리구가 유사한 것으로 나타났으며, 화학농약 처리구 역시 경작체계가 다름에도 불구하고 유사성이 있는 것으로 확인되었다.

참고문헌 (28)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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