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문제 정의
- Corallopyronin만이 Corallococcus 균주에서 최초로 발견된 물질이다[10]. 본 연구에서는 국내에서 분리한 Corallococcus와 Myxococcus 속 균주들을 대상으로 배양추출물을 제조하여 항균 활성을 비교 하였고, Staphylococcus aureus와 Pseudomonas aeroginosa 에 항세균 활성을 보인 C. coralloides 균주들의 항세균 물질 생산 조건을 조사하였다.
제안 방법
- 대조구로는 DMSO 를 함유한 종이디스크를 사용하였다. 32oC에서 2일간 배양한후, 생장저지환의 지름을 측정하여 항균활성을 측정하였다.
- C. albicans, P. aeruginosa 또는 S. aureus가 도말된 평판배지 위에 배양추출액 10 µl를 함유한 6 mm 종이디스크 (Advantec MFS, Japan)를 올려놓았다.
- C. coralloides KYC4012 was cultured in CYE, CY, VY/3, and CYS broths and the culture extracts prepared from each culture were analyzed using HPLC.
- C. coralloides 균주들에 의한 항세균 물질 생산이 최적인 배지를 선별하기 위하여 CYE, CY, VY/3 배지에서 KYC4012을 배양하고, 배양추출물을 제조한 다음, HPLC 분석을 통해 물질 피크의 크기를 비교하였다. 그 결과, VY/3에서는 1~5번 피크 물질 생성이 모두 관찰되었으나, CYE와 CY에서는 이들 피크들이 전혀 검출되지 않았다(Table 3).
- CYS 배지는 0.5% casitone, 0.1% yeast extract, 0.3% soluble starch, 0.1% MgSO4·7H2O, 0.05% CaCl2, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (pH 7.6), 0.1% 미량원소용액, 0.5 µg/ml cyanocobalamine을 첨가하였으며, 미량원소용액은 1리터당 100 mg MnCl2·4H2O, 20 mg CoCl2, 10 mg CuSO4, 10 mg Na2MoO4·2H2O, 20 mg ZnCl2, 5 mg LiCl, 5 mg SnCl2·2H2O, 10 mg H3BO3, 20 mg KBr, 20 mg KI, 8 g EDTA Na-Fe3+ salt (trihydrate)를 첨가하였다.
- Corallococcus속 균주에 의한 항세균 활성물질의 생산이 배양시간에 따라 어떻게 달라지는지 조사하기 위하여 CYS 배지에 KYC4012 균주를 접종하고, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일 동안 배양한 다음, XAD-16 레진을 회수하여 배양추출물을 제조하였다. 그리고 HPLC 분석을 통하여 배양시간에 따른 3번 피크(30.
- 추출물을 건조시킨 후, 1 ml의 DMSO 에 녹여 보관하였다. HPLC 분석을 위해서는 레진만을 증류수로 세척하고 50% 아세톤과 100% 아세톤으로 추출하였다. 회전증발기를 사용하여 아세톤만을 제거한 다음, 남은 수용액을 에틸아세테이트로 추출하였고, 건조시킨 후, 80%메탄올 1 ml에 용해하였다.
- albicans는 YM 배지에서 배양하였다. NA 배지는 0.3% beef extract와 0.5% peptone을 첨가하였으며, YM 배지는 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1% glucose로 구성되어 있었다.
- S. aureus와 P. aeruginosa에 활성을 보인 6균주들이 활성을 전혀 보이지 않은 C. coralloides 균주 KYC1674와 물질 생성에서 어떤 차이를 보이는지 조사하기 위하여 이들의 배양추출물을 Zorbax SB-C18 컬럼을 장착한 HPLC를 사용하여 비교 분석하였다. 7개 균주들의 배양추출물을 HPLC로 전개하였을 때, 25분 이전에서는 대체로 유사한 크로마토그램을 보였다(Fig.
- 국내 토양시료에서 분리한 174 Corallococcus 속 균주와 207 Myxococcus 속 균주들의 배양추출물을 제조하고 Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus에 대한 항균 활성을 비교하였다. 항진균 활성을 보이는 균주의 비율은 Corallococcus가 7.
- Gerth 등은 점액세균에서 탐색된 생리활성물질과 생산 균주에 대한 정보를 바탕으로 Myxococcus 속과 Sorangium 속 균주들이 다양한 생리활성물질을 생산하는 반면, Corallococcus 속 균주들은 생리활성물질을 거의 생산하지 않음을 보고하였다[5]. 국내에서 분리한 Corallococcus 속 균주들도 동일한 양상을 보이는지 알아보기 위하여, 국내 토양시료에서 분리한 Corallococcus 174속 균주와 Myxococcus 207속 균주들을 배양하여 배양추출물을 제조하고, C. albicans, S. aureus, Paeruginosa에 대한 생장저지 활성을 측정하였다. 그 결과, 174 Corallococcus 속 균주 중 7.
- Corallococcus속 균주에 의한 항세균 활성물질의 생산이 배양시간에 따라 어떻게 달라지는지 조사하기 위하여 CYS 배지에 KYC4012 균주를 접종하고, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일 동안 배양한 다음, XAD-16 레진을 회수하여 배양추출물을 제조하였다. 그리고 HPLC 분석을 통하여 배양시간에 따른 3번 피크(30.71분)의 변화를 조사하였다. 3번 피크 물질의 양은 6일째까지 계속 증가하였으며, 이후에는 정체되는 양상을 보였다.
- 분석된 피크 중 어떤 피크가 항세균 활성을 보이는지 조사하기 위하여 6균주의 하나인 KYC4012의 배양추출물을 대상으로 HPLC 전개를 실시하여 5개 피크의 분획을 받아 농축한 다음, S. aureus와 P. aeruginosa를 대상으로 활성을 측정하였다. 그 결과, 각각 30.
- 이러한 설명과 이전에 생리활성물질 생산에 사용되었던 배지조성을 기반으로 CYS 배지를 디자인하고 KYC4012에 의한 항세균 물질의 생산을 조사하였다. 그 결과, CYS 배지에서는 VY/3 배지에서보다 피크에 따라 2~8배 많은 물질을 생산하였다(Table 3).
- 이후의 실험에서는 Corallococcus 속 균주들에 의한 물질 생산 특성을 조사하기 위하여 S. aureus와 P. aeruginosa에 활성을 보인 6균주 KYC4006, KYC4010, KYC4012, KYC4021, KYC4023, KYC4046를 대상으로 자실체 형성, 배지 및 배양시간에 따른 물질 생산을 조사하였으며, 배양추출물들을 HPLC로 비교 분석하였다.
- 5 µg/ml cyanocobalamine을 첨가하였으며, 미량원소용액은 1리터당 100 mg MnCl2·4H2O, 20 mg CoCl2, 10 mg CuSO4, 10 mg Na2MoO4·2H2O, 20 mg ZnCl2, 5 mg LiCl, 5 mg SnCl2·2H2O, 10 mg H3BO3, 20 mg KBr, 20 mg KI, 8 g EDTA Na-Fe3+ salt (trihydrate)를 첨가하였다. 자실체 형성 유도를 위해서는 WCE 배지를 사용하였다. WCE 배지는 10 mM MOPS, 0.
- 점액세균 단일 세포의 형태 관찰을 위해서는 VY/3 배지에서 3일 동안 배양한 영양세포들을 Nikon ECLIPSE E600 위상차현미경을 사용하여 관찰하였으며, 점액세균의 자실체 형태는 WCE 배지에서 7일간 배양한 자실체를 Nikon SMZ1000 입체현미경을 사용하여 관찰하였다. 사진은 Nikon DS-Fi1 디지털 카메라를 사용하여 촬영하였다.
대상 데이터
- C. coralloides의 일반적인 배양에는 VY/3 배지를 사용하였으며, 필요에 따라서 CY[17] 또는 CYE 배지[7]를 사용하였다. 배양추출물 제조를 위해서는 CYS 배지를 사용하였다.
- Corallococcus와 Myxococcus 속 균주들은 모두 호서대학교 점액세균은행에서 직접 분리하여 보유하고 있는 균주들을 사용하였다. P.
- Corallococcus와 Myxococcus 속 균주들은 모두 호서대학교 점액세균은행에서 직접 분리하여 보유하고 있는 균주들을 사용하였다. P. aeruginosa ATCC 10145, S. aureus ATCC 25923, Candida albicans ATCC18804는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 구입하였다.
- aureus가 도말된 평판배지 위에 배양추출액 10 µl를 함유한 6 mm 종이디스크 (Advantec MFS, Japan)를 올려놓았다. 대조구로는 DMSO 를 함유한 종이디스크를 사용하였다. 32oC에서 2일간 배양한후, 생장저지환의 지름을 측정하여 항균활성을 측정하였다.
- coralloides의 일반적인 배양에는 VY/3 배지를 사용하였으며, 필요에 따라서 CY[17] 또는 CYE 배지[7]를 사용하였다. 배양추출물 제조를 위해서는 CYS 배지를 사용하였다. VY/3 배지는 VY/2 배지[17]를 변형시킨 배지로 0.
- 점액세균 단일 세포의 형태 관찰을 위해서는 VY/3 배지에서 3일 동안 배양한 영양세포들을 Nikon ECLIPSE E600 위상차현미경을 사용하여 관찰하였으며, 점액세균의 자실체 형태는 WCE 배지에서 7일간 배양한 자실체를 Nikon SMZ1000 입체현미경을 사용하여 관찰하였다. 사진은 Nikon DS-Fi1 디지털 카메라를 사용하여 촬영하였다.
이론/모형
- 배양추출물의 HPLC 분석은 Zorbax SB-C18 컬럼(4.6 mm × 150 mm, 5 µm)을 장착한 Agilent 1260 VL Infinity Series HPLC 시스템을 사용하였다(Agilent Technologies, USA).
성능/효과
- 1). 16S rRNA 유전자 서열도 C. coralloides의 표준균주인 DSM2259 (Accession number DQ768120)와 99.7% 이상 동일하였다. 따라서 6균주는 모두 C.
- 호서대학교 점액세균은행은 전국 2,015지점에서 채취한 토양시료로부터 분리한 2,672 균주의 야생 점액세균을 보유하고 있다[9, 14]. 16S rRNA 유전자 염기서열 및 자실체 형태를 기반으로 한 균주 동정에 의하면, 보유 균주들의 40.9%가 Myxococcus 속 균주들이며, 28.0%가 Corallococcus 속, 23.5%가 Sorangium 속, 그리고 나머지 7.7%가 다른 속에 속하는 점액세균 균주인 것으로 분석되었다.
- 16S rRNA 유전자 서열에서도 차이를 보였다. 6균주들은 모두 지역적으로 다른 장소에서 분리한 균주들로, KYC4006, KYC4012는 강원도에서 채취한 토양에서 분리하였으며, 다른 4균주는 각각 경남, 인천, 전북, 충북에서 채취한 토양에서 분리하였다(Table 2). 이러한 결과들을 바탕으로 6균주는 모두 다른 균주들인 것으로 사료되었다.
- 1%(21균주)로 1%(2균주)를 보인 Myxococcus에 비해 상대적으로 높았다. Corallococcus 균주 중 P. aeruginosa, S. aureus에 모두 활성을 보이는 6 C. coralloides 균주들은 자실체 형성에서는 차이를 보였지만 항세균 활성을 나타내는 배양추출물의 HPLC 크로마토그램은 유사 하였는데, 이들이 생산하는 항세균 물질의 생산은 CYS 배지에서 6일 이상 배양할 때 가장 높았다.
- Myxococcus 속 균주들의 경우에는 207 균주 중 51.7%에 해당하는 107균주가 C. albicans의 성장을 억제하는 항진균 활성을 보였으며, 1%에 해당하는 2균주가 그람음성 세균인 S. aureus에 항세균 활성을 보였다. P.
- aeruginosa에 항세균 활성을 보인 균주들은 없었다(Table 1). S. aureus에 활성을 보인 2균주 중 1균주가 C. albicans에도 활성을 보였으므로 207균주 중 52.2%에 해당하는 108균주가 항진균 또는 항세균 활성을 보였다. 이는 Corallococcus 속 균주들에 비해 2.
- aeruginosa에 항 세균 활성을 보였다(Table 1). S. aureus에 활성을 보인 6균주들은 모두 P. aeruginosa에도 활성을 보였지만, C. albicans 에 활성을 보인 13균주들은 S. aureus과 P. aeruginosa에 활성을 보이지 않았다. 따라서 174균주 중 19.
- 개별 활성에서는 다른 양상을 보였는데, 항진균 활성의 경우에는 Corallococcus 속 균주들(7.5%)이 Myxococcus 균주 들(51.7%)에 비해 낮은 비율을 보였지만, 항세균 활성의 경우에는 Corallococcus 속 균주들(12.1%)이 Myxococcus 속 균주들(1%)에 비해 높은 비율을 보였다. 특히 Myxococcus 속 균주들에서는 P.
- aureus, Paeruginosa에 대한 생장저지 활성을 측정하였다. 그 결과, 174 Corallococcus 속 균주 중 7.5%에 해당하는 13균주가 C. albicans의 성장을 억제하는 항진균 활성을 보였으며, 12.1%에 해당하는 21균주가 그람음성 세균인 S. aureus에, 3.4%에 해당하는 6균주가 그람양성 세균인 P. aeruginosa에 항 세균 활성을 보였다(Table 1). S.
- 이러한 설명과 이전에 생리활성물질 생산에 사용되었던 배지조성을 기반으로 CYS 배지를 디자인하고 KYC4012에 의한 항세균 물질의 생산을 조사하였다. 그 결과, CYS 배지에서는 VY/3 배지에서보다 피크에 따라 2~8배 많은 물질을 생산하였다(Table 3). CYS 배지는 0.
- coralloides 균주들에 의한 항세균 물질 생산이 최적인 배지를 선별하기 위하여 CYE, CY, VY/3 배지에서 KYC4012을 배양하고, 배양추출물을 제조한 다음, HPLC 분석을 통해 물질 피크의 크기를 비교하였다. 그 결과, VY/3에서는 1~5번 피크 물질 생성이 모두 관찰되었으나, CYE와 CY에서는 이들 피크들이 전혀 검출되지 않았다(Table 3). KYC4023과 KYC4046을 대상으로 배양과, S.
- aeruginosa를 대상으로 활성을 측정하였다. 그 결과, 각각 30.14, 30.71, 31.23, 31.71분의 머무름 시간을 갖는 피크-2, 3, 4, 5 분획이 S. aureus에 성장 저해 활성을 보였으며, 26.62분의 머무름 시간을 갖는 피크-1 분획은 활성을 보이지 않았다(Fig. 3). 한편, 다섯 피크 모두는 P.
- aeruginosa에 활성을 보이지 않았다. 따라서 174균주 중 19.5%에 해당하는 34균주가 항진균 또는 항세균 활성을 보였다.
- 7% 이상 동일하였다. 따라서 6균주는 모두 C. coralloides인 것으로 확인되었다. 하지만 균주들 간에는 자실체의 형태와 색에서 차이를 보이는데, KYC4010은 끝이 산등성이 위에 동그란 뿔을 형성한 반면, KYC4012는 끝이 뾰족한 뿔을 형성하였으며, KYC4006은 자실체 색이 다른 균주와 차이를 보였다(Fig.
- 3번 피크 물질의 양은 6일째까지 계속 증가하였으며, 이후에는 정체되는 양상을 보였다. 따라서 최대 수율을 얻기 위해서는 6일간 배양하는 것이 가장 적절한 것으로 나타났다. Corallococcus 속 균주들은 물질 생산능력에 비해 탐색된 생리활성물질이 극소수이다.
- 7배 높은 비율이다. 이러한 결과는 국내 토양에서 분리된 Corallococcus 속 균주들도 국외 분리 균주들과 마찬가지로 Myxococcus 속 균주들에 비해 활성물질 생산 비율이 낮음을 보여준다. 이러한 특성으로 인해 그 동안 Corallococcus에서의 신규 물질 발견이 Myxococcus에 비해 상대적으로 낮은 것으로 사료된다.
- aureus를 대상으로 하는 생리활성조사에서도 동일한 결과를 얻었다. 이러한 결과의 원인에 대한 설명 중 하나는 Corallococcus속 균주들이 CYE 과 같이 영양생장만을 위한 배지에서는 항세균 물질을 생산 하지 않지만, VY/3와 같이 영양생장을 지원하다가 후기에 자실체를 형성하게 하는 배지에서는 항세균 물질을 생산한다는 것이다.
- 1%)이 Myxococcus 속 균주들(1%)에 비해 높은 비율을 보였다. 특히 Myxococcus 속 균주들에서는 P. aeruginosa에 대한 저해 활성을 전혀 보이지 않았지만, Corallococcus의 경우에는 6균주가 P. aeruginosa에 대한 성장 저해 활성을 보였다(Table 1).
- 하지만 25분 이후에는 활성이 없는 KYC1674와 활성이 있는 6균주들의 배양추출물들 사이에 눈에 띄는 차이가 관찰되었다. 특히, 26.62, 30.14, 30.71, 31.23, 31.71분에서 검출된 피크들은 대부분의 활성이 있는 균주들에서 검출되었지만 활성이 없는 KYC1674의 추출물에서는 검출되지 않았다. 이후 실험을 위해 차이를 보이는 피크 각각에 번호를 매겨 구분하였다(Fig.
- 7%(207균주 중 107균주)를 보인 Myxococcus에 비해 낮았다. 하지만, 항세균 활성을 보인 균주의 비율은 Corallococcus가 12.1%(21균주)로 1%(2균주)를 보인 Myxococcus에 비해 상대적으로 높았다. Corallococcus 균주 중 P.
- 국내 토양시료에서 분리한 174 Corallococcus 속 균주와 207 Myxococcus 속 균주들의 배양추출물을 제조하고 Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus에 대한 항균 활성을 비교하였다. 항진균 활성을 보이는 균주의 비율은 Corallococcus가 7.5%(174균주 중 13균주)로 51.7%(207균주 중 107균주)를 보인 Myxococcus에 비해 낮았다. 하지만, 항세균 활성을 보인 균주의 비율은 Corallococcus가 12.
후속연구
- Corallococcus 속 균주들은 물질 생산능력에 비해 탐색된 생리활성물질이 극소수이다. 본 연구에서 얻은 결과들은 향후 Corallococcus 속 균주들로부터 신규 생리활성물질을 탐색하는데 기반이 될것으로 기대한다.
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