Ginsenoside Rp1 is one of ginseng saponins with chemotherapeutic activity. In this study, we investigated the effects of Rp1 on spleen cells. Spleen is a major immune organ consisted of crucial immune cells, such as T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, and some antigen-presenting cell...
Ginsenoside Rp1 is one of ginseng saponins with chemotherapeutic activity. In this study, we investigated the effects of Rp1 on spleen cells. Spleen is a major immune organ consisted of crucial immune cells, such as T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, and some antigen-presenting cells. Although the anti-tumor potential of Rp1 was studied, the effects of Rp1 on immune cells have not investigated yet. A viability assay using 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), flow cytometric analysis, Western blot analysis were used to detect cellular changes on Rp1-treated spleen cells. MTT assay showed that Rp1 decreased the viability of spleen cells. To further investigate the effects of Rp1 on activated spleen cells, we treated lipopolysaccharide (LPS) as a representative inflammatory agent and Rp1 on spleen cells in a combination. The surface expression levels of activation markers for lymphocytes, CD25 and CD69 were measured. Apoptotic analysis revealed the cytotoxic effects of Rp1 on both na$\ddot{i}$ve and activated cells, and the expression pattern of some apoptosis-related proteins was correlated to apoptotic events of cells. Taken together, ginsenoside Rp1 increases the cellular death of spleen cells and also inhibits the LPS-induced activation of spleen cells.
Ginsenoside Rp1 is one of ginseng saponins with chemotherapeutic activity. In this study, we investigated the effects of Rp1 on spleen cells. Spleen is a major immune organ consisted of crucial immune cells, such as T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, and some antigen-presenting cells. Although the anti-tumor potential of Rp1 was studied, the effects of Rp1 on immune cells have not investigated yet. A viability assay using 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), flow cytometric analysis, Western blot analysis were used to detect cellular changes on Rp1-treated spleen cells. MTT assay showed that Rp1 decreased the viability of spleen cells. To further investigate the effects of Rp1 on activated spleen cells, we treated lipopolysaccharide (LPS) as a representative inflammatory agent and Rp1 on spleen cells in a combination. The surface expression levels of activation markers for lymphocytes, CD25 and CD69 were measured. Apoptotic analysis revealed the cytotoxic effects of Rp1 on both na$\ddot{i}$ve and activated cells, and the expression pattern of some apoptosis-related proteins was correlated to apoptotic events of cells. Taken together, ginsenoside Rp1 increases the cellular death of spleen cells and also inhibits the LPS-induced activation of spleen cells.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 ginsenoside Rp1을 naïve 상태의 비장세포와 대표적인 염증유발물질인 lipopolysaccharide(LPS)로 활성화된 비장세포에 투여하여 어떤 세포변화가 일어나는지 알아보고자 한다.
이번 실험에서는 ginsenoside Rp1이 비장세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. MTT assay 결과 Rp1은 LPS를 처리하지 않았을 때와 처리하였을 때 모두 비장세포의 생존율을 감소시켰다.
제안 방법
1% sodium azide가 첨가된 PBS를 사용하였다. 1차 항체로 biotinylated anti-mouse CD25, 2차 항체로 streptavidin-phycoerythrin(PE)을 처리하거나, PE-labeled anti-mouse CD69 (BD Biosciences, USA)를 처리하였다. 항체를 넣은 샘플은 4℃에서 30분간 반응시켰고 1% paraformaldehyde를 이용해 분석 시까지 보관했다.
전반적으로 Rp1이 비장세포의 크기에는 영향을 보이지 않는 것으로 판단된다. Cell death에 대한 Rp1의 효과를 알아보기 위해 annexin V-FITC/PI 염색을 실시하였다(Fig. 3). 사분면의 lower-left는 살아있는 세포, lower-right는 early apoptosis, upper-right는 late apoptosis와 upper-left는 necrosis를 포함하는 세포를 나타낸다.
Flow cytometry를 이용하여 세포 크기 변화를 관찰하였다(Fig. 3). 살아있는 비장세포의 구역을 gate한 결과(%로 표시), LPS군과 LPS + Rp1처리군은 control군에 비해 세포의 수가 현저히 증가하였으며 우측 상방의 커진 세포의 수가 증가하였다.
Western blot을 통하여 세포자멸사를 억제하는데 작용하는 단백질들인 Bcl-2, Bcl-xL, cIAP-1, cIAP-2의 발현을 확인해보았다. 그 결과 Bcl-2와 나머지 단백질의 발현양상이 달랐다.
LPS처리군의 경우 lower-left가 증가하여 살아있는 세포수가 증가한 반면, Rp1처리군은 control 군 및 LPS처리군에 비해 upper-right가 높아서 late apoptosis가 많이 일어났음을 알 수 있었다. 또한 rhodamine 123 염색을 통해 미토콘드리아의 membrane potential을 알아보았다(Fig. 3). Control군에 비해 LPS처리군은 증가한 반면 Rp1군은 약간 감소하였다.
림프구의 활성화 마커인 CD25와 CD69의 변화를 알아보았다(Fig. 4). LPS에 의한 CD25와 CD69의 발현이 현저하게 증가하였고, LPS에 의한 발현 증가가 Rp1에 의해서 CD25와 CD69 모두 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
비장세포의 생존율 변화를 알아보기 위한 다른 방법으로 LPS 1 µg/mL, Rp1 10 µg/mL을 처리하여 2일간 배양한 후 trypan blue exclusion test를 실시하였다.
비장세포의 생존율에 대한 Rp1의 효과를 알아보기 위해 LPS를 처리하지 않은 naïve 비장세포와 LPS에 의해 활성화된 비장세포에 Rp1을 처리하였다.
생존율 측정을 위해 LPS 1 µg/mL, Rp1 10 µg/mL 을 처리하고 배양한 다음, trypan blue 염색으로 live cell, dead cell의 수를 세었다.
항체를 넣은 샘플은 4℃에서 30분간 반응시켰고 1% paraformaldehyde를 이용해 분석 시까지 보관했다. 세포자멸사와 세포괴사를 포함하는 cell death를 알아보기 위해 물질이 처리된 비장세포를 2일간 배양한 뒤에 annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)/propidium iodide(PI) kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 염색하였다. 또한 세포 내 미토콘드리아의 막전위 수준을 알아보기 위하여 10 µg/ml Rhodamine 123(Sigma)를 처리하여 30분간 배양하였다.
또한 세포 내 미토콘드리아의 막전위 수준을 알아보기 위하여 10 µg/ml Rhodamine 123(Sigma)를 처리하여 30분간 배양하였다. 염색된 세포들은 FACSCalibur and CellQuest(BD, USA)을 이용해 분석하였다.
이후 실험에서는 LPS의 염증성 반응을 나타내는 농도로 1 µg/mL, 생존율 저하 효과가 뚜렷한 Rp1의 농도로 10 µg/mL을 선정하여 사용하였다.
대상 데이터
12% SDS-PAGE gel을 이용하였고 nitrocellulose membrane에 blotting하였다. 1차 항체로 anti-Bcl-2, anti-Bcl-xL(Santa Cruz Biotech, USA), anti-cIAP-1, anti-cIAP-2 항체(Cell Signaling Tech, USA)를 사용하였고 2차 항체로 horseradish peroxidase (HRP, Santa Cruz Biotech, USA)가 결합된 적절한 항체를 사용하였다.
동물실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 시행되었으며 제주대학교 동물실험윤리지침을 준수하였다. Rp1은 Ambo Institute(서울)에서 제공받았으며 phosphate-buffered saline(PBS)에 녹여 사용하였다.
모든 실험에는 ORIENT BIO에서 구입하여 제주대학교 수의약리학실험실에서 유지된 8~12주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 동물실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 시행되었으며 제주대학교 동물실험윤리지침을 준수하였다.
데이터처리
모든 data는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, Student’s t test를 통해 분석하였다.
이론/모형
Bradford's method에 따라 단백질을 정량하여 동일한 양의 단백질을 분석하였다.
성능/효과
그리고 CD69 역시 림프구의 activation시 초기에 발현되는 활성화 marker이다 [15]. CD25와 CD69의 발현을 분석한 결과 LPS에 의한 두 분자의 발현증가를 Rp1이 억제하였다. 이는 LPS가 그람음성균의 표면물질이면서 대표적인 염증성 원인 물질임을 감안할 때, Rp1이 LPS에 의한 림프구의 과도한 활성화를 억제할 수 있는 가능성을 보여준 결과로 판단된다.
Control군에 비해 Rp1군에서는 세포의 수가 적고, 죽은 세포가 보였다. LPS군에서는 cluster가 많이 보였으며 세포가 많이 자란 상태였고, Rp1과 LPS를 함께 처리한 군에서는 LPS만 처리한 군에 비해 cluster의 생성이 적음을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
4). LPS에 의한 CD25와 CD69의 발현이 현저하게 증가하였고, LPS에 의한 발현 증가가 Rp1에 의해서 CD25와 CD69 모두 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
5). LPS에 의한 특정 anti-apoptotic 단백질들의 발현 증가는 Rp1에 의해 억제되는 사실을 확인하였다.
사분면의 lower-left는 살아있는 세포, lower-right는 early apoptosis, upper-right는 late apoptosis와 upper-left는 necrosis를 포함하는 세포를 나타낸다. LPS처리군의 경우 lower-left가 증가하여 살아있는 세포수가 증가한 반면, Rp1처리군은 control 군 및 LPS처리군에 비해 upper-right가 높아서 late apoptosis가 많이 일어났음을 알 수 있었다. 또한 rhodamine 123 염색을 통해 미토콘드리아의 membrane potential을 알아보았다(Fig.
이번 실험에서는 ginsenoside Rp1이 비장세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. MTT assay 결과 Rp1은 LPS를 처리하지 않았을 때와 처리하였을 때 모두 비장세포의 생존율을 감소시켰다. 또한 Rp1을 처리한 후 현미경으로 세포의 형태를 관찰했을 때 비장세포의 수가 감소한 것을 확인하였다.
Rp1이 cell death에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시한 annexin V-FITC/PI 염색 결과를 보면 Rp1은 비장세포의 세포자멸사를 촉진하였다. 또한 Rp1 단독처리군은 대조군에 비해 미토콘드리아 막전위가 저하되었으나, LPS + Rp1처리군은 LPS처리군에 비해 거의 변화가 없었다. 이는 Rp1에 의한 세포자멸사가 미토콘드리아 막전위와 관련성이 적은 경로를 통했거나 일시적인 변화로 한정되었을 가능성이 있을 것으로 추정된다.
MTT assay 결과 Rp1은 LPS를 처리하지 않았을 때와 처리하였을 때 모두 비장세포의 생존율을 감소시켰다. 또한 Rp1을 처리한 후 현미경으로 세포의 형태를 관찰했을 때 비장세포의 수가 감소한 것을 확인하였다. LPS에 의해 증가된 cluster의 수는 Rp1 처리에 의해 감소되었다.
현재 항암제로서 Rp1의 효과가 연구를 통해 입증되었지만 [11], 면역세포에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다. 본 연구를 통해 항암제로 Rp1을 사용했을 때 면역세포에 잠재적인 독성을 줄 수 있는 사실을 알 수 있었다. 또한 최근 다른 ginsenoside의 일종인 Rh1이 항알레르기 및 항염증 효과가 있는 것으로 알려진 사실에 비추어 볼 때 [13], Rp1 또한 단독으로 과도한 면역반응을 조절할 수 있는 효과적인 면역억제제로서의 가능성이 기대된다.
비장세포에 Rp1을 0~100 µg/mL, LPS를 0~1 µg/mL 처리하여 2일간 배양한 후 MTT assay를 실시한 결과, LPS에 의한 세포생존율이 Rp1에 의해 고농도에서 유의하게 감소하였고, Rp1 10 µg/mL에서 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 1A).
LPS에 의해 증가된 cluster의 수는 Rp1 처리에 의해 감소되었다. 비장세포에 Rp1을 처리한 결과 세포의 생존율이 감소하는 사실을 확인했다.
3). 살아있는 비장세포의 구역을 gate한 결과(%로 표시), LPS군과 LPS + Rp1처리군은 control군에 비해 세포의 수가 현저히 증가하였으며 우측 상방의 커진 세포의 수가 증가하였다. Rp1군은 control군에 비해 큰 변화를 보이지 않았다.
위의 실험결과를 종합해 볼 때, Rp1은 비장세포의 생존율을 억제하고, LPS에 의한 과도한 면역반응 시 세포사멸과정을 통해 면역과정을 조절할 수 있는 사실을 확인하였다. 현재 항암제로서 Rp1의 효과가 연구를 통해 입증되었지만 [11], 면역세포에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다.
CD25와 CD69의 발현을 분석한 결과 LPS에 의한 두 분자의 발현증가를 Rp1이 억제하였다. 이는 LPS가 그람음성균의 표면물질이면서 대표적인 염증성 원인 물질임을 감안할 때, Rp1이 LPS에 의한 림프구의 과도한 활성화를 억제할 수 있는 가능성을 보여준 결과로 판단된다.
후속연구
본 연구를 통해 항암제로 Rp1을 사용했을 때 면역세포에 잠재적인 독성을 줄 수 있는 사실을 알 수 있었다. 또한 최근 다른 ginsenoside의 일종인 Rh1이 항알레르기 및 항염증 효과가 있는 것으로 알려진 사실에 비추어 볼 때 [13], Rp1 또한 단독으로 과도한 면역반응을 조절할 수 있는 효과적인 면역억제제로서의 가능성이 기대된다.
3)와 다른 세포에서의 Rp1에 의한 세포자멸사 증가를 지지해 줄 수 있을 것으로 판단된다 [12]. 향후 일반적인 Bcl-2 의존적인 세포자멸사와 Rp1에 의한 세포자멸사를 비교하는 세부연구가 필요한 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비장이란?
비장은 혈액에서 유래된 항원에 대해 면역반응을 하며, 혈액의 주요한 여과장치로 작용하여 노화되거나 손상된 세포를 제거하는 주요한 면역기관이다 [1]. 비장은 적혈구를 저장하고 항원을 처리하는 적색질과 림프구가 풍부하고 면역 반응이 활발한 백색질로 구성되어 있으며, 림프구, 대식세포, 수지상세포 등으로 이루어져 있다 [2].
비장을 구성하는 것은?
비장은 혈액에서 유래된 항원에 대해 면역반응을 하며, 혈액의 주요한 여과장치로 작용하여 노화되거나 손상된 세포를 제거하는 주요한 면역기관이다 [1]. 비장은 적혈구를 저장하고 항원을 처리하는 적색질과 림프구가 풍부하고 면역 반응이 활발한 백색질로 구성되어 있으며, 림프구, 대식세포, 수지상세포 등으로 이루어져 있다 [2]. 혈액에서 유래된 항원이 항원제시세포에 의해 탐식, 소화된 후 항원성 펩타이드가 림프구에 제시되면서 면역반응이 일어나게 된다.
Ginseng에서 추출한 saponin 중 Rg1의 기능은?
Ginseng에서 추출한 saponin인 ginsenoside들은 상대적으로 작은 독성을 보이면서도 수많은 약리작용을 보여왔다. Rg1은 T-helper cell의 수와 비장의 자연살해세포(NK cell)의 활성을 증가시키고 [6], Rg3는 암세포 활성에 관여하는 NFkappaB를 억제하여 암세포의 성장을 억제하였다 [10]. 또한 Rb1은 nitric oxide의 생산을 억제하여 췌장 β세포의 세포자 멸사를 억제하는 것으로 알려졌다 [3].
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