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문제 정의
- 따라서 본 연구는 우리나라에서는 안면도에만 분포하는 희귀소멸위기 수종인 먹넌출 생명자원의 보존전략 수립을 위해 엽의 형태적 특성 변이와 I-SSR 표지자 분석을 이용한 유전적 특성을 밝히는데 있다.
제안 방법
- PCR 증폭산물은 1×TBE buffer를 사용하여 2% agarose gel에서 2시간 30분 전기영동 하였고, ethidium bromide로 정색하여 UV trans-illuminator상에서 사진을 찍고 증폭산물의 존재 유무를 판정하였다.
- 채취된 시료는 형태적 특성 조사를 위해 개체목별로 10개의 성엽을 임의로 선발하여 전체 39개체 390개 엽을 대상으로 조사하였다. 엽의 형태적 특성은 엽신장, 엽폭(상⅓, #, 하⅓), 엽지수(길이/폭), 엽병길이, 엽두께, 엽맥수(좌측), 엽맥수(우측) 및 엽면적을 각각 조사하였다(Fig. 2). 엽의 길이 및 폭 특성은 버니어캘리퍼스를 이용하였으며, 엽면적은 엽면적 측정기(LI-3100, LI-COR Inc.
- 2). 엽의 길이 및 폭 특성은 버니어캘리퍼스를 이용하였으며, 엽면적은 엽면적 측정기(LI-3100, LI-COR Inc., USA)를 이용하여 측정하였다.
- 추출한 먹넌출의 DNA는 국립산림과학원(KFRI) 산림유전자원과 유전자은행(DNA-bank)에 보관하였다. Polymerase chain reaction (PCR)은 주형 DNA 6 ng, 10X buffer, 1 mM dNTP, 0.025% BSA 각각 1.5 ul, 2 mM MgCl2 1.2 ul, 1.5 uM ISSR primer 3.75 ul, Promega Flexi GoTaq(Promega Corp., Madison, WI) 0.6 U 및 증류수가 포함된 총 15 ul의 반응액을 95℃에서 5분 동안 1차 해리한 후, 해리 95℃ 1분, annealing 50～54℃ 1분, extension 72℃ 2분으로 구성된 반응을 30회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 extension하여 수행하였다(Applied Biosystems Gene Amp. PCR system 9700). ISSR primer는 UBC primer Set #9 (University of British Columbia, Canada) 46개를 사용하였으며, 이 가운데 재현성이 우수하고 다형성을 보이는 8개의 primer (UBC primer; #825, #830, #841, #842, #847, #851, #857, #859)를 사용하였다.
- 우리나라에서 안면도에만 분포하는 먹넌출 집단의 생명자원보존을 위하여 엽의 형태적 특성과 I-SSR 표지자를 이용한 유전변이를 조사하였다. 10가지 엽특성에 대한 ANOVA 분석결과 모든 특성에서 개체 간에 통계적인 유의성이 인정되었다.
- 채취된 먹넌출의 유엽은 유전변이 분석을 위해 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 DNA를 분리 ND-1000 Spectrophotometer (Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량하였다. 추출한 먹넌출의 DNA는 국립산림과학원(KFRI) 산림유전자원과 유전자은행(DNA-bank)에 보관하였다.
대상 데이터
- 공시재료는 충청남도 태안군 안면읍 승언리 해발 53 m의 소나무 숲에 분포하는 먹넌출 천연집단을 대상으로 하였으며(Fig. 1), 2012년 10월 엽 특성 조사와 유전변이 분석을 위한 시료를 채취하였다. 먹넌출은 소나무(Pinus densiflora Siebold & Zucc.
- 채취된 시료는 형태적 특성 조사를 위해 개체목별로 10개의 성엽을 임의로 선발하여 전체 39개체 390개 엽을 대상으로 조사하였다. 엽의 형태적 특성은 엽신장, 엽폭(상⅓, #, 하⅓), 엽지수(길이/폭), 엽병길이, 엽두께, 엽맥수(좌측), 엽맥수(우측) 및 엽면적을 각각 조사하였다(Fig.
- PCR system 9700). ISSR primer는 UBC primer Set #9 (University of British Columbia, Canada) 46개를 사용하였으며, 이 가운데 재현성이 우수하고 다형성을 보이는 8개의 primer (UBC primer; #825, #830, #841, #842, #847, #851, #857, #859)를 사용하였다. PCR 증폭산물은 1×TBE buffer를 사용하여 2% agarose gel에서 2시간 30분 전기영동 하였고, ethidium bromide로 정색하여 UV trans-illuminator상에서 사진을 찍고 증폭산물의 존재 유무를 판정하였다.
데이터처리
- 분산분석(ANOVA)을 통해 측정형질의 개체간 변이를 분석하였고 각 형질의 변이정도를 파악하고자 변이계수 값을 비교하였으며, 모든 통계분석은 SAS 프로그램(ver. 8.01; SAS Institute Inc., 1999)또한 I-SSR PCR에 의해 생성된 다형성 증폭산물을 바탕으로 POPGENE 1.32 프로그램(Yeh et al., 1997)을 이용하여 유효대립유전자의 수(Kimura and Cow, 1964), 다형적 유전좌의 비율, Shannon의 다양성지수(Lewontin, 1972) 등 유전적 다양성을 구하였다.
성능/효과
- 먹넌출 엽의 평균특성은 엽신장 11.8 cm, 최대엽폭 7.1 cm, 엽지수 1.67, 상1/3폭 5.4 cm, 하1/3폭 6.2 cm, 엽병길이 3.6 cm, 엽두께 0.19 mm, 엽맥수(좌) 11.5개, 엽맥수(우) 11.4개, 엽면적 61.7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.
- 7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.8%, 21.7%, 22.0%로 높게 나타났으며, 나머지 특성들에서는 15% 이내의 비교적 낮은 변이를 나타냈다(Table 1). 본 연구 결과는 Lee (2003)에 의해 보고된 엽신장 8～13 cm와 최대 엽폭 4.
- 5개로 원기재문(Makino, 1892)과 Koidzumi (1916)가 언급한 10～15개와 유사한 경향을 나타냈다. 특히, 먹넌출 엽의 형태적 특성에 대한 모든 형질들은 개체들 간에 통계적인 유의성이 인정되어 개체간에 변이가 많은 형질들로 나타났다(Table 2). Chen and Carsten (2007)에 의하면 기본종인 청사조(B.
- 먹넌출의 유전변이 분석에 사용된 8개의 I-SSR primer에서 총 50개의 증폭산물이 관찰되었으며, 다형적 증폭산물은 13개를 얻을 수 있었다(Fig. 3). 증폭된 다형적 유전자좌를 토대로 계산된 유전변이량은 유효대립유전자의 수(Ae)가 1.
- 3). 증폭된 다형적 유전자좌를 토대로 계산된 유전변이량은 유효대립유전자의 수(Ae)가 1.719개, 다형적 유전자좌의 비율(P)이 26.0%, 이형접합도의 기대치(He)는 0.410, Shannon의 다양성지수(S.I.)는 0.598로 나타났다(Table 3). 기존의 I-SSR 표지자를 이용한 연구에서 Shannon의 다양성지수는 소나무 0.
- 본 연구 결과 국내 안면도 먹넌출 집단은 유전다양성이 비교적 높은 수종으로 분석되었으나 좁은 지역에 제한적으로 분포하고 있고 개체수도 많지 않으며 개화가 편중되어 나타나기 때문에 유전적 부동의 영향을 받을 가능성이 매우 큰 것으로 판단된다. 집단의 크기가 작은 경우 유전적인 영향뿐만 아니라 환경과 집단 개체수의 급진적인 변화에 따른 멸절의 위협이 높다(Shaffer, 1981; Lynch et al.
- 우리나라에서 안면도에만 분포하는 먹넌출 집단의 생명자원보존을 위하여 엽의 형태적 특성과 I-SSR 표지자를 이용한 유전변이를 조사하였다. 10가지 엽특성에 대한 ANOVA 분석결과 모든 특성에서 개체 간에 통계적인 유의성이 인정되었다. 조사된 39개체의 평균특성은 엽신장 11.
- 10가지 엽특성에 대한 ANOVA 분석결과 모든 특성에서 개체 간에 통계적인 유의성이 인정되었다. 조사된 39개체의 평균특성은 엽신장 11.8 cm, 최대엽폭 7.1 cm, 엽지수 1.67, 상1/3폭 5.4 cm, 하1/3폭 6.2 cm, 엽병길이 3.6 cm, 엽두께 0.19 mm, 엽맥수(좌) 11.5개, 엽맥수(우) 11.4개, 엽면적 61.7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.
- 7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.8%, 21.7%, 22.0%로 높게 나타났으며, 나머지 특성들에서는 15% 이내의 비교적 낮은 변이를 나타냈다. 선발된 8개 I-SSR Primer에서 총 50개의 증폭산물을 얻었으며, 유효대립 유전자의 수 1.
- 0%로 높게 나타났으며, 나머지 특성들에서는 15% 이내의 비교적 낮은 변이를 나타냈다. 선발된 8개 I-SSR Primer에서 총 50개의 증폭산물을 얻었으며, 유효대립 유전자의 수 1.719개, 다형적 유전자좌의 비율 26.0%, 이형접합도의 기대치 0.410 및 Shannon의 다양성지수 0.598로 각각 나타났다. 안면도 먹넌출 집단은 제한된 지역에 분포하며 개체수가 적음에도 불구하고 높은 유전다양성을 유지하는 것으로 나타났다.
- 598로 각각 나타났다. 안면도 먹넌출 집단은 제한된 지역에 분포하며 개체수가 적음에도 불구하고 높은 유전다양성을 유지하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 따라서 현재 먹넌출 집단의 유전다양성을 유지할 수 있도록 현지내 보존 전략이 필요하며, 보존전략 수립을 위한 유전적 공간구조 구명을 통한 표본추출 전략 등 합리적인 기준을 마련하는 일이 수행되어야 한다. 또한 삽목 증식법(Song et al., 2011)과 더불어 종자를 통한 증식법 개발과 시설저장 등 현지외보존 전략도 병행하여 수립되어야 할 것이다.
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