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문제 정의
- 따라서 본 연구는 우리나라에서는 안면도에만 분포하는 희귀소멸위기 수종인 먹넌출 생명자원의 보존전략 수립을 위해 엽의 형태적 특성 변이와 I-SSR 표지자 분석을 이용한 유전적 특성을 밝히는데 있다.
제안 방법
- PCR 증폭산물은 1×TBE buffer를 사용하여 2% agarose gel에서 2시간 30분 전기영동 하였고, ethidium bromide로 정색하여 UV trans-illuminator상에서 사진을 찍고 증폭산물의 존재 유무를 판정하였다.
- 추출한 먹넌출의 DNA는 국립산림과학원(KFRI) 산림유전자원과 유전자은행(DNA-bank)에 보관하였다. Polymerase chain reaction (PCR)은 주형 DNA 6 ng, 10X buffer, 1 mM dNTP, 0.025% BSA 각각 1.5 ul, 2 mM MgCl2 1.2 ul, 1.5 uM ISSR primer 3.75 ul, Promega Flexi GoTaq(Promega Corp., Madison, WI) 0.6 U 및 증류수가 포함된 총 15 ul의 반응액을 95℃에서 5분 동안 1차 해리한 후, 해리 95℃ 1분, annealing 50～54℃ 1분, extension 72℃ 2분으로 구성된 반응을 30회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 extension하여 수행하였다(Applied Biosystems Gene Amp. PCR system 9700). ISSR primer는 UBC primer Set #9 (University of British Columbia, Canada) 46개를 사용하였으며, 이 가운데 재현성이 우수하고 다형성을 보이는 8개의 primer (UBC primer; #825, #830, #841, #842, #847, #851, #857, #859)를 사용하였다.
- 2). 엽의 길이 및 폭 특성은 버니어캘리퍼스를 이용하였으며, 엽면적은 엽면적 측정기(LI-3100, LI-COR Inc., USA)를 이용하여 측정하였다.
- 채취된 시료는 형태적 특성 조사를 위해 개체목별로 10개의 성엽을 임의로 선발하여 전체 39개체 390개 엽을 대상으로 조사하였다. 엽의 형태적 특성은 엽신장, 엽폭(상⅓, #, 하⅓), 엽지수(길이/폭), 엽병길이, 엽두께, 엽맥수(좌측), 엽맥수(우측) 및 엽면적을 각각 조사하였다(Fig. 2). 엽의 길이 및 폭 특성은 버니어캘리퍼스를 이용하였으며, 엽면적은 엽면적 측정기(LI-3100, LI-COR Inc.
- 우리나라에서 안면도에만 분포하는 먹넌출 집단의 생명자원보존을 위하여 엽의 형태적 특성과 I-SSR 표지자를 이용한 유전변이를 조사하였다. 10가지 엽특성에 대한 ANOVA 분석결과 모든 특성에서 개체 간에 통계적인 유의성이 인정되었다.
- 채취된 먹넌출의 유엽은 유전변이 분석을 위해 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 DNA를 분리 ND-1000 Spectrophotometer (Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량하였다. 추출한 먹넌출의 DNA는 국립산림과학원(KFRI) 산림유전자원과 유전자은행(DNA-bank)에 보관하였다.
대상 데이터
- PCR system 9700). ISSR primer는 UBC primer Set #9 (University of British Columbia, Canada) 46개를 사용하였으며, 이 가운데 재현성이 우수하고 다형성을 보이는 8개의 primer (UBC primer; #825, #830, #841, #842, #847, #851, #857, #859)를 사용하였다. PCR 증폭산물은 1×TBE buffer를 사용하여 2% agarose gel에서 2시간 30분 전기영동 하였고, ethidium bromide로 정색하여 UV trans-illuminator상에서 사진을 찍고 증폭산물의 존재 유무를 판정하였다.
- 공시재료는 충청남도 태안군 안면읍 승언리 해발 53 m의 소나무 숲에 분포하는 먹넌출 천연집단을 대상으로 하였으며(Fig. 1), 2012년 10월 엽 특성 조사와 유전변이 분석을 위한 시료를 채취하였다. 먹넌출은 소나무(Pinus densiflora Siebold & Zucc.
- 채취된 시료는 형태적 특성 조사를 위해 개체목별로 10개의 성엽을 임의로 선발하여 전체 39개체 390개 엽을 대상으로 조사하였다. 엽의 형태적 특성은 엽신장, 엽폭(상⅓, #, 하⅓), 엽지수(길이/폭), 엽병길이, 엽두께, 엽맥수(좌측), 엽맥수(우측) 및 엽면적을 각각 조사하였다(Fig.
데이터처리
- 분산분석(ANOVA)을 통해 측정형질의 개체간 변이를 분석하였고 각 형질의 변이정도를 파악하고자 변이계수 값을 비교하였으며, 모든 통계분석은 SAS 프로그램(ver. 8.01; SAS Institute Inc., 1999)또한 I-SSR PCR에 의해 생성된 다형성 증폭산물을 바탕으로 POPGENE 1.32 프로그램(Yeh et al., 1997)을 이용하여 유효대립유전자의 수(Kimura and Cow, 1964), 다형적 유전좌의 비율, Shannon의 다양성지수(Lewontin, 1972) 등 유전적 다양성을 구하였다.
성능/효과
- 우리나라에서 안면도에만 분포하는 먹넌출 집단의 생명자원보존을 위하여 엽의 형태적 특성과 I-SSR 표지자를 이용한 유전변이를 조사하였다. 10가지 엽특성에 대한 ANOVA 분석결과 모든 특성에서 개체 간에 통계적인 유의성이 인정되었다. 조사된 39개체의 평균특성은 엽신장 11.
- 먹넌출 엽의 평균특성은 엽신장 11.8 cm, 최대엽폭 7.1 cm, 엽지수 1.67, 상1/3폭 5.4 cm, 하1/3폭 6.2 cm, 엽병길이 3.6 cm, 엽두께 0.19 mm, 엽맥수(좌) 11.5개, 엽맥수(우) 11.4개, 엽면적 61.7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.
- 먹넌출의 유전변이 분석에 사용된 8개의 I-SSR primer에서 총 50개의 증폭산물이 관찰되었으며, 다형적 증폭산물은 13개를 얻을 수 있었다(Fig. 3). 증폭된 다형적 유전자좌를 토대로 계산된 유전변이량은 유효대립유전자의 수(Ae)가 1.
- 7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.8%, 21.7%, 22.0%로 높게 나타났으며, 나머지 특성들에서는 15% 이내의 비교적 낮은 변이를 나타냈다(Table 1). 본 연구 결과는 Lee (2003)에 의해 보고된 엽신장 8～13 cm와 최대 엽폭 4.
- 7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.8%, 21.7%, 22.0%로 높게 나타났으며, 나머지 특성들에서는 15% 이내의 비교적 낮은 변이를 나타냈다. 선발된 8개 I-SSR Primer에서 총 50개의 증폭산물을 얻었으며, 유효대립 유전자의 수 1.
- 본 연구 결과 국내 안면도 먹넌출 집단은 유전다양성이 비교적 높은 수종으로 분석되었으나 좁은 지역에 제한적으로 분포하고 있고 개체수도 많지 않으며 개화가 편중되어 나타나기 때문에 유전적 부동의 영향을 받을 가능성이 매우 큰 것으로 판단된다. 집단의 크기가 작은 경우 유전적인 영향뿐만 아니라 환경과 집단 개체수의 급진적인 변화에 따른 멸절의 위협이 높다(Shaffer, 1981; Lynch et al.
- 0%로 높게 나타났으며, 나머지 특성들에서는 15% 이내의 비교적 낮은 변이를 나타냈다. 선발된 8개 I-SSR Primer에서 총 50개의 증폭산물을 얻었으며, 유효대립 유전자의 수 1.719개, 다형적 유전자좌의 비율 26.0%, 이형접합도의 기대치 0.410 및 Shannon의 다양성지수 0.598로 각각 나타났다. 안면도 먹넌출 집단은 제한된 지역에 분포하며 개체수가 적음에도 불구하고 높은 유전다양성을 유지하는 것으로 나타났다.
- 598로 각각 나타났다. 안면도 먹넌출 집단은 제한된 지역에 분포하며 개체수가 적음에도 불구하고 높은 유전다양성을 유지하는 것으로 나타났다.
- 10가지 엽특성에 대한 ANOVA 분석결과 모든 특성에서 개체 간에 통계적인 유의성이 인정되었다. 조사된 39개체의 평균특성은 엽신장 11.8 cm, 최대엽폭 7.1 cm, 엽지수 1.67, 상1/3폭 5.4 cm, 하1/3폭 6.2 cm, 엽병길이 3.6 cm, 엽두께 0.19 mm, 엽맥수(좌) 11.5개, 엽맥수(우) 11.4개, 엽면적 61.7 cm2로 나타났다. 변이계수 값은 엽두께, 엽병길이, 엽면적이 각각 18.
- 3). 증폭된 다형적 유전자좌를 토대로 계산된 유전변이량은 유효대립유전자의 수(Ae)가 1.719개, 다형적 유전자좌의 비율(P)이 26.0%, 이형접합도의 기대치(He)는 0.410, Shannon의 다양성지수(S.I.)는 0.598로 나타났다(Table 3). 기존의 I-SSR 표지자를 이용한 연구에서 Shannon의 다양성지수는 소나무 0.
- 5개로 원기재문(Makino, 1892)과 Koidzumi (1916)가 언급한 10～15개와 유사한 경향을 나타냈다. 특히, 먹넌출 엽의 형태적 특성에 대한 모든 형질들은 개체들 간에 통계적인 유의성이 인정되어 개체간에 변이가 많은 형질들로 나타났다(Table 2). Chen and Carsten (2007)에 의하면 기본종인 청사조(B.
후속연구
- 따라서 현재 먹넌출 집단의 유전다양성을 유지할 수 있도록 현지내 보존 전략이 필요하며, 보존전략 수립을 위한 유전적 공간구조 구명을 통한 표본추출 전략 등 합리적인 기준을 마련하는 일이 수행되어야 한다. 또한 삽목 증식법(Song et al., 2011)과 더불어 종자를 통한 증식법 개발과 시설저장 등 현지외보존 전략도 병행하여 수립되어야 할 것이다.
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